劉洋，姚睿智，史宏昭，劉鵬，李士澤

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

ICR 小鼠多被應(yīng)用于生命科學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、生理心理學(xué)和神經(jīng)精神藥物學(xué)等研究領(lǐng)域，使用廣泛[1]。特別是因其獨(dú)有生理特征得到了學(xué)者們的關(guān)注和認(rèn)可，成已經(jīng)為了情緒障礙、感覺運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能這三大類神經(jīng)行為學(xué)研究中的主流試驗(yàn)動(dòng)物[2]，地位無可取代。但神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試對(duì)試驗(yàn)環(huán)境、測(cè)試條件和操作程序及受試動(dòng)物體況等因素有著較為嚴(yán)格的要求，一旦對(duì)這些敏感因素把控不嚴(yán)，會(huì)給試驗(yàn)結(jié)果造成不可估量的影響，這也嚴(yán)重阻礙了研究人員間的相互比較、參考。因此，研究選取了兩個(gè)個(gè)可互相印證、結(jié)果一致性的曠場(chǎng)試驗(yàn)（open field test，OFT）和高架十字迷宮試驗(yàn)（plus maze test，PMT）來測(cè)定ICR小鼠的相關(guān)神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)，探討ICR 小鼠的行為特征，確立其參考范圍，為自發(fā)運(yùn)動(dòng)、探索行為和焦慮情緒的進(jìn)一步研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為今后的運(yùn)動(dòng)能力和情緒障礙這兩大方面神經(jīng)行為學(xué)研究提供有價(jià)值的參考，為神經(jīng)行為學(xué)研究中異常數(shù)值的篩選和剔除提供合理的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的8 周齡的ICR 小鼠200 只（雌雄各半）。小鼠在人工智能氣候室中進(jìn)行為期7 d 的適應(yīng)性飼養(yǎng)，環(huán)境溫度設(shè)定為28±0.5 ℃，濕度為（40±5）%，自由采食、飲水。每5 只同性別ICR 小鼠群養(yǎng)于聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中[鼠籠大小為375 mm（長）×173 mm（寬）×165 mm（高）]。每籠給予200 g 的松軟木屑?jí)|料，每周更換墊料2 次。日光燈照明，光照強(qiáng)度為200 Lux，明暗周期比為12 L∶12 D（開燈8:00 am，關(guān)燈8:00 pm）。

適應(yīng)性飼養(yǎng)完成后，觀察ICR 小鼠的健康狀況并篩選和剔除提出異常、發(fā)情小鼠，將在最終獲得ICR 小鼠分別用于曠場(chǎng)試驗(yàn)、高架十字迷宮試驗(yàn)（各神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試裝置說明、操作方法、記錄指標(biāo)將在下面詳細(xì)介紹，n=90，雌雄各半）。

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與裝置

試驗(yàn)中所用的TM-Vision 行為學(xué)試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)、OFT-100 曠場(chǎng)試驗(yàn)箱、PMT-100 高架十字迷宮和落地式試驗(yàn)站等主要儀器均購自于成都泰盟軟件有限公司。

落地式試驗(yàn)站相對(duì)獨(dú)立于外界環(huán)境，可減少行為學(xué)實(shí)驗(yàn)因環(huán)境、燈光、氣流、噪音、人為干擾等的影響，因此所有的行為學(xué)測(cè)試全程均在落地式試驗(yàn)站中進(jìn)行。其頂部兩側(cè)裝有2 盞40 W 的日光燈作為照明系統(tǒng)，以保持觀察箱內(nèi)的光照條件一致；箱頂正中固定一個(gè)與TM-Vision 行為學(xué)試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)連接的高清攝像頭，用以收集并記錄圖像、試驗(yàn)進(jìn)程。

1.2.1 曠場(chǎng)試驗(yàn)裝置

曠場(chǎng)試驗(yàn)箱外形尺寸為625 mm（L）× 740 mm（W）× 510 mm（H），正面外側(cè)配有反光鏡，底壁及四周側(cè)壁由黑色塑膠構(gòu)成（圖1 A）。

圖1 曠場(chǎng)試驗(yàn)裝置Fig.1 Open-field test device

1.2.2 高架十字迷宮裝置

高架十字迷宮是由2 個(gè)開臂 [300 mm（長）×60 mm（寬）× 6 mm（高）]，2 個(gè)閉合臂[300 mm（長）×60 mm（寬）× 150 mm（高）]和1 個(gè)中心區(qū)域[60 mm（長）× 60 mm（寬）]組成，迷宮高度為500 mm，迷宮和閉臂側(cè)壁均是由黑色塑膠構(gòu)成（圖2 A）。

1.3 測(cè)定程序

適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，實(shí)驗(yàn)員每天抓摸小鼠10 min，使其適應(yīng)試驗(yàn)人員的捕捉操作，避免試驗(yàn)時(shí)產(chǎn)生應(yīng)激。實(shí)驗(yàn)開始前30 min 將小鼠移入測(cè)試室適應(yīng)，以減少新異環(huán)境刺激對(duì)小鼠活動(dòng)的影響，保證試驗(yàn)時(shí)小鼠活動(dòng)趨于穩(wěn)定。各組均在上午（8:00～11:00）依次完成相應(yīng)的神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試。每只小鼠僅測(cè)試1 次，不再重復(fù)測(cè)定。試驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制環(huán)境因素，確保一致；保持測(cè)試室內(nèi)安靜，試驗(yàn)人員不可更換，不可使用香水或其他有刺激性氣味的物品。每次測(cè)試結(jié)束，清理糞便，徹底清洗試驗(yàn)裝置底部和側(cè)壁，噴灑75%酒精，同時(shí)打開通氣，直至試驗(yàn)裝置及落地試驗(yàn)站內(nèi)干燥無異味后再進(jìn)行下一只小鼠的測(cè)試，避免前次受試小鼠的殘留氣味影響下一次的試驗(yàn)。

圖2 高架十字迷宮裝置Fig.2 Plus maze test device

1.3.1 曠場(chǎng)試驗(yàn)測(cè)試

打開OFT-100 曠場(chǎng)試驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，設(shè)置試驗(yàn)各項(xiàng)數(shù)據(jù)（如試驗(yàn)人員、項(xiàng)目名稱和簡(jiǎn)述等），同時(shí)將單次測(cè)試總時(shí)間設(shè)為300 s，數(shù)據(jù)顯示間隔設(shè)為3 s；打開攝像頭，調(diào)節(jié)光線亮度與試驗(yàn)箱的位置。進(jìn)行區(qū)域設(shè)定，選擇25 宮格模式，確定站立區(qū)和中心區(qū)域比例（見圖1 B）；最終設(shè)定標(biāo)尺。設(shè)置完成后，點(diǎn)擊“開始試驗(yàn)”，填寫動(dòng)物編號(hào)、溫度、濕度等試驗(yàn)參數(shù)。而后將ICR 小鼠背對(duì)試驗(yàn)人員放入曠試驗(yàn)箱中央，點(diǎn)擊“確定”命令，即可通過視頻行為分析系統(tǒng)觀察和記錄受試小鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)箱內(nèi)5 min 的活動(dòng)情況，觀察、記錄指標(biāo)包括：運(yùn)動(dòng)距離、靜止時(shí)間、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、區(qū)域分布指標(biāo)（四邊、四角、中央的活動(dòng)情況）、站立次數(shù)、運(yùn)動(dòng)軌跡等。

1.3.2 高架十字迷宮測(cè)試

除區(qū)域設(shè)定出2 條開臂和2 條閉臂（依次編號(hào)為1、2、3、4）以及中心區(qū)域（編號(hào)為5）外（見圖2 B），PMT-100 系列十字迷宮視頻分析系統(tǒng)試驗(yàn)操作程序大體同上。受試小鼠放置于中間區(qū)域（面向開臂），點(diǎn)擊“確定”命令，即可通過視頻行為分析系統(tǒng)觀察和記錄受試小鼠在高架十字迷宮內(nèi)5 min 的活動(dòng)情況，觀察、記錄指標(biāo)包括：運(yùn)動(dòng)距離、靜止時(shí)間、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、區(qū)域分布指標(biāo)（開臂、閉臂、中央的活動(dòng)情況）、開臂進(jìn)入次數(shù)、運(yùn)動(dòng)軌跡等。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism（La Jolla，CA，USA）軟件進(jìn)行分析，并作圖，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x±SEM）表示，比較分析用One-way ANOVA分析方法，P<0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 曠場(chǎng)試驗(yàn)中小鼠活動(dòng)軌跡圖Fig.3 Mouse activity of trajectory map in open field test

2 結(jié)果

2.1 ICR 小鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

在這里我們展示了ICR 小鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)軌跡，以便更加直觀地表現(xiàn)出小鼠的運(yùn)動(dòng)和區(qū)域分布狀態(tài)。因篇幅的原因并未全部列出，但這些圖片具有較好的普遍性和代表性，見圖3。

曠場(chǎng)試驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)試結(jié)果及其95%置信區(qū)間見表1。

ICR 小鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)中的性別差異如圖4 所示，雌、雄ICR 小鼠在運(yùn)動(dòng)時(shí)間、靜止時(shí)間、各區(qū)域滯留時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距離和站立次數(shù)等指標(biāo)中均無明顯差異。

表1 ICR 小鼠開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果及95%置信區(qū)間Table 1 Open-field test results of ICR mice and their reference ranges

圖4 ICR 小鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)的性別差異Fig.4 Gender differences of ICR mice in open field test

2.2 ICR 小鼠高架十字迷宮測(cè)試結(jié)果

ICR 小鼠在高架十字迷宮中的運(yùn)動(dòng)軌跡圖見圖5。

ICR 小鼠在高架十字迷宮中各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)試結(jié)果及相應(yīng)的95%置信區(qū)間如表2 所示。

圖5 高架十字迷宮小鼠活動(dòng)軌跡圖（部分展示）Fig.5 Mouse activity trajectory map in plus maze test（partial display）

表2 ICR 小鼠高架十字迷宮測(cè)定結(jié)果及95%置信區(qū)間Table 2 Plus maze test results of ICR mice and their reference ranges

ICR 小鼠在高架十字迷宮中的性別差異如圖6所示，雄、雌ICR 小鼠在各區(qū)域滯留時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距離和進(jìn)入次數(shù)等各項(xiàng)指標(biāo)中均無明顯差異。

圖6 ICR 小鼠在高架十字迷宮試驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)的性別差異Fig.6 Gender differences of ICR mice in plus maze test

3 討論

曠場(chǎng)試驗(yàn)是評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能和焦慮狀態(tài)的經(jīng)典行為學(xué)方法之一，其原理是基于嚙齒類動(dòng)物的趨觸性，即嚙齒類動(dòng)物同時(shí)有畏懼空曠場(chǎng)地和探索行為新事物、新環(huán)境的天性，而在開闊的場(chǎng)地中其活動(dòng)呈現(xiàn)趨避性。曠場(chǎng)試驗(yàn)中常用小鼠的水平活動(dòng)反映其運(yùn)動(dòng)活性，即自主活動(dòng)能力；垂直運(yùn)動(dòng)反映小鼠對(duì)新異環(huán)境的探索程度，即探索行為行為[3]。研究的曠場(chǎng)試驗(yàn)中靜止時(shí)間、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)距離定是小鼠自主活動(dòng)能力的主要評(píng)定指標(biāo)；站立次數(shù)是小鼠探索行為行為的主要評(píng)定指標(biāo)，雖然中央?yún)^(qū)域活動(dòng)頻率也可以評(píng)價(jià)小鼠的探索行為，但我們考慮到小鼠的活動(dòng)特性后并未使用。這些指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果和參考范圍并未與前人部分研究的結(jié)果完全一致[4-6]，這可能是因受試小鼠的品種[6-8]、周齡和體重等關(guān)鍵因素不同而產(chǎn)生了一定的影響。除此之外，我們認(rèn)為更主要的原因是這些研究各自側(cè)重點(diǎn)有所不同，其研究人員針對(duì)曠場(chǎng)試驗(yàn)進(jìn)行了一定的修整。例如，在林曉春[4]的研究中，其測(cè)定時(shí)長僅設(shè)置為3 min，即使受試動(dòng)物為大鼠，也導(dǎo)致其測(cè)定結(jié)果低于試驗(yàn)；而在李騰飛[5]的試驗(yàn)中，結(jié)合其測(cè)定時(shí)長和小鼠活動(dòng)先強(qiáng)后弱的時(shí)相特點(diǎn)[9]考慮后，可以認(rèn)為其結(jié)果與試驗(yàn)高度符合。另外，各個(gè)研究中使用的數(shù)據(jù)采集軟件與試驗(yàn)中采用的也有所不同，這也是一個(gè)不可忽視的因素。曠場(chǎng)試驗(yàn)的中央、角落和周邊滯留時(shí)間及其與總時(shí)間百分比也可以作為小鼠的焦慮情緒評(píng)定指標(biāo)[5，10]，但為避免受到小鼠的趨避性和活動(dòng)時(shí)相特點(diǎn)的影響，焦慮樣情緒由高架十字迷宮和高架零迷宮搭配進(jìn)行測(cè)定并討論，這樣一來更為合理。因?yàn)閮烧叩慕Y(jié)果具有一致性，可以相互印證，能夠更好地反應(yīng)動(dòng)物焦慮的程度。因此，在這里對(duì)曠場(chǎng)試驗(yàn)的相關(guān)結(jié)果只做了展示而未進(jìn)行深入討論。

高架十字迷宮試驗(yàn)是國際公認(rèn)的動(dòng)物焦慮行為測(cè)評(píng)的裝置[11]，自發(fā)明以來就被廣泛應(yīng)用于大、小鼠的焦慮行為學(xué)研究，其原理是基于動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探索行為和對(duì)高懸開放臂的恐懼而形成的矛盾沖突狀態(tài)，進(jìn)而反映出動(dòng)物的焦慮情緒[12]。試驗(yàn)的高架十字迷宮試驗(yàn)中選擇了小鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)、滯留時(shí)間和滯留時(shí)間與總時(shí)間百分比作為動(dòng)物焦慮表現(xiàn)的主要評(píng)定指標(biāo)。這些指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果和參考范圍與前人部分研究的結(jié)果雖然仍一定的出入[13]，但考慮到如前所述的原因后，能夠認(rèn)為結(jié)果較為一致。同時(shí)，我們認(rèn)為在他們的研究中某些需要注意但極易忽略的操作可能并未得到較好的控制。例如，試驗(yàn)開始時(shí)，是按人員需要手持小鼠使其背對(duì)實(shí)驗(yàn)者放置在開臂與閉臂的接合處，且讓小鼠面對(duì)開臂。倘若面對(duì)閉臂，因小鼠嗜暗的天性（閉臂）[12]，結(jié)果將受很大影響；同時(shí)，同一試驗(yàn)中所有小鼠均需面對(duì)同一開臂且裝置放置位置相對(duì)固定，否則可能會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)產(chǎn)生偏差，這也可能是某些數(shù)據(jù)離散程度較大的原因之一。

值得注意的是，雖然雄、雌小鼠本身存在一定的生理差別，但研究通過曠場(chǎng)試驗(yàn)和高架十字迷宮試驗(yàn)并未得出雄、雌鼠ICR 在焦慮樣情緒、探索行為行為和自主活動(dòng)能力上存在性別差異。神經(jīng)行為學(xué)中關(guān)于小鼠兩性差異的報(bào)道不少，但多集中在認(rèn)知功能[14]這一方面，受試動(dòng)物也多是藥物成癮[15]、不良刺激和應(yīng)激狀態(tài)[16-17]的雄、雌小鼠，正常狀態(tài)下小鼠神經(jīng)行為學(xué)的兩性差異并未得到足夠的關(guān)注。在劉友平[3]的研究中，雖然與我們所用小鼠品系不同，但也未發(fā)現(xiàn)性別對(duì)其試驗(yàn)結(jié)果有所影響，這與研究結(jié)果基本一致。同時(shí)，這也可能與試驗(yàn)前期對(duì)于小鼠嚴(yán)格管理有一定的關(guān)系，比如，篩選并剔除了異常和發(fā)情小鼠，避免了動(dòng)情周期[18]的影響，也一定程度上降低了如雌二醇等雌激素水平波動(dòng)的影響，而這正是造成大多數(shù)研究中兩性差異的重要因素之一。

神經(jīng)行為學(xué)試驗(yàn)受到諸多因素的影響，除了動(dòng)物遺傳變異[19]、晝夜節(jié)律和動(dòng)情周期[20]等生物因素外，試驗(yàn)環(huán)境、測(cè)試條件、操作和人員序等因素也會(huì)對(duì)其造成不可估量的影響。因此，我們?cè)诮窈蟮纳窠?jīng)行為學(xué)試驗(yàn)過程中應(yīng)對(duì)小鼠的品系，周齡、營養(yǎng)及健康狀態(tài)、試驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)程度等嚴(yán)格把控，確保如試驗(yàn)時(shí)間段、試驗(yàn)人員、燈光和光照強(qiáng)度[20]、氣味[21]、甚至墊料[22]等試驗(yàn)條件一致。只有這樣才能科學(xué)的獲得有效數(shù)據(jù)；同時(shí)，在對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較、參考時(shí)，我們也應(yīng)留意這些因素的差異及其導(dǎo)致的改變，并作出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

4 結(jié)論

綜上所述，研究采用TM-Vision 系列行為學(xué)試驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行視頻采集、參數(shù)記錄和統(tǒng)計(jì)，其靈敏度較高，能夠提取客觀定量數(shù)據(jù)；同時(shí)，研究的樣本量豐富，試驗(yàn)相關(guān)因素控制精確，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，數(shù)據(jù)具有較好的重復(fù)性和可信度，可以為今后的情緒障礙和感覺運(yùn)動(dòng)這兩大類神經(jīng)行為學(xué)研究提供有價(jià)值的參考。另外，基于試驗(yàn)的結(jié)果，我們也認(rèn)為雄、雌ICR小鼠在本試驗(yàn)條件下其焦慮樣情緒、探索行為和自主活動(dòng)能力不存在兩性差異。