陳海霞，白曉紅

卵巢儲備功能（ovarian reserve，OR）指卵巢皮質(zhì)區(qū)卵泡生長發(fā)育并形成可受精卵母細胞的能力，此能力取決于卵巢儲備始基卵泡的數(shù)量和質(zhì)量。若卵巢內(nèi)可募集的卵泡數(shù)量減少或卵母細胞質(zhì)量下降，配子生成功能下降，可致生育能力下降，即為卵巢儲備功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）[1]?？姑缋展芗に兀╝nti-Müllerian hormone，AMH）和竇卵泡計數(shù)（antral follicle count，AFC）是與卵巢儲備功能相關(guān)性最強的獨立預(yù)測因素[2-4]。目前，由于延遲生育、二胎政策以及社會環(huán)境等因素，DOR患者所占比例日益增長，在不孕女性中占10%，發(fā)病率遠高于早發(fā)性卵巢功能不全（primature ovarian insufficiency，POI）。DOR處于POI早期，無臨床癥狀，只有生化水平的異常表現(xiàn)，是育齡期女性最常見的生殖內(nèi)分泌疾病之一[5]。

目前，DOR的病因尚不明確，研究表明可能與遺傳、自身免疫、感染、醫(yī)源性損傷以及生活環(huán)境等因素有關(guān)。醫(yī)源性因素通過仔細詢問病史很容易獲取。研究證實，手術(shù)治療是導(dǎo)致后天DOR的重要因素[6]。年齡因素是公認的影響卵巢儲備功能的另一個重要高危因素。由于年齡增長，卵泡的數(shù)量和質(zhì)量下降，最終導(dǎo)致DOR[7]。因此，研究者將年齡導(dǎo)致的DOR視為生理性DOR，其他原因如免疫性、遺傳性、特發(fā)性因素導(dǎo)致的DOR被認為是病理性DOR，因為它們反映了異常的卵巢衰老。生理性DOR和病理性DOR代表兩種不同的患者群體。生理性DOR是無法抗拒的事實，在臨床中要加以區(qū)分，以便選擇不同的治療方法。由于DOR具有不可逆性，目前尚無非常有效的方法恢復(fù)或者改善患者的卵巢功能，因此早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)是解決患者生育問題的有效途徑。分子遺傳學(xué)病因分析是實現(xiàn)病理性DOR人群早期篩查和早期診治的關(guān)鍵手段之一，無論對臨床治療還是對早期預(yù)防都是非常重要的。

遺傳因素是導(dǎo)致DOR的重要因素。目前，認為導(dǎo)致POI的脆性X智力低下基因1（FMR1）也是導(dǎo)致DOR的潛在基因之一[8]。此外，POI的一些已知遺傳基因如叉頭轉(zhuǎn)錄因子2（Foxl2）、生長分化因子9（Gdf-9）已經(jīng)在小鼠中證實可能與DOR有關(guān)[9]，盡管POI的許多遺傳原因已得到證實，但與DOR相關(guān)的致病基因卻知之甚少，有關(guān)的研究更是不多。

總結(jié)梳理近年來國內(nèi)外有關(guān)DOR的研究進展，對引起該疾病已報道的相關(guān)基因研究加以綜述，最后闡述DOR與端粒長度的關(guān)系，以檢查這些因素與DOR相關(guān)聯(lián)的證據(jù)強度，以期為病理性DOR人群早期篩查和及早診治提供理論依據(jù)，從而制定合理高效的治療方案，避免無效治療。根據(jù)引起DOR的基因是否引起其他疾病分為：綜合性候選基因如FMR1、FOXL2等；非綜合性候選基因如GDF-9、卵泡刺激素受體（FSHR）、雌激素α受體（ESR1）等。

1 綜合性候選基因

1.1 FMR1FMR1又稱家族性智力低下基因，位于該基因5′端CGG＞200的重復(fù)異常是導(dǎo)致脆性X綜合征的常見原因。這種突變導(dǎo)致基因啟動子區(qū)處于高甲基化狀態(tài)，最終導(dǎo)致FMR1基因表達沉默。FMR1基因的CGG重復(fù)序列在人群中具有多態(tài)性。目前，國際上普遍認為：正常人群的CGG重復(fù)序列主要集中在29～30次，45～54次定義為中間帶（inter-mediate），55～199次定義為前突變（pre-mutation），＞200次定義為全突變（full m′utation）。FMR1基因除與脆性X綜合征有關(guān)，還與卵巢儲備功能有關(guān)，是與POI、DOR相關(guān)的重要基因[8]。一項回顧性研究對62例DOR（無脆性X綜合征史）患者的靜脈血標(biāo)本進行FMR1基因CGG重復(fù)序列檢測，結(jié)果表明14.5%的DOR患者所攜帶的FMR1基因CGG重復(fù)序列在35～44[10]。攜帶中間帶（35～54個CGG重復(fù)序列）的患者被視為處于“灰色區(qū)域”。有研究發(fā)現(xiàn)FMR1基因CGG重復(fù)序列處于灰色區(qū)域與DOR有關(guān)。一項前瞻性研究對DOR患者的血液標(biāo)本進行FMR1基因CGG重復(fù)序列檢測，發(fā)現(xiàn)14.5%的DOR患者攜帶的FMR1基因CGG重復(fù)序列為中間帶，而在卵巢儲備功能正常人群中僅3.9%攜帶[11]。另外，F(xiàn)MR1基因CGG重復(fù)序列還與卵泡刺激素（FSH）、AMH水平相關(guān)。Bishop等[12]通過檢測卵巢儲備功能正常和卵巢早衰（POF）患者血液中的FMR1基因CGG重復(fù)序列和FSH、AMH激素水平，統(tǒng)計分析FMR1基因CGG重復(fù)序列和FSH、AMH水平的相關(guān)性。結(jié)果表明FSH水平與FMR1基因CGG重復(fù)序列呈正相關(guān)（P＜0.01），AMH水平與FMR1基因CGG重復(fù)序列（＞32次）也呈負相關(guān)（P＜0.04）。其機制可能與FMR1基因mRNA過度堆積、脆性X智力低下蛋白（FMRP）相關(guān)mRNA調(diào)節(jié)異常、FMR polyG內(nèi)含子泛素化調(diào)節(jié)、FMR1 基因組蛋白修飾改變等有關(guān)[13]。盡管有許多因素可能導(dǎo)致DOR，但許多特發(fā)性病例很可能具有遺傳/表觀遺傳基礎(chǔ)。FMR1基因突變（50～200個CGG重復(fù)序列）與POI的關(guān)系表明FMR1基因的表觀遺傳也可能成為DOR的危險因素。研究顯示，和卵巢功能正常人群相比，DOR患者FMR1基因調(diào)控區(qū)域（包括啟動子和外顯子1）的組蛋白3賴氨酸9乙?；℉3K9ac）和組蛋白3賴氨酸9乙?；谆℉3K9me2）表觀遺傳修飾更多，而組蛋白3賴氨酸9乙?；柞；℉3K9me3）修飾則沒有差異[14]。目前大多數(shù)數(shù)據(jù)表明DOR與FMR1基因CGG重復(fù)序列有關(guān)。對這類人群進行FMR1基因篩查，有助于從基因角度為患者提供生育咨詢。

1.2 FOXL2FOXL2是人類早期卵巢生成分化過程中的重要調(diào)控因子，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)其靶基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達，同時參與顆粒細胞的增殖分化和類固醇的合成，對卵泡正常發(fā)育和維持正常的卵巢功能有重要作用。FOXL2是瞼裂狹小、逆向內(nèi)眥贅皮和上瞼下垂綜合征（BPES）的致病基因，分為兩種亞型：Ⅰ型FOXL2突變產(chǎn)物是一種無功能的截斷蛋白，由于突變FOXL2蛋白在叉頭區(qū)或聚丙氨酸區(qū)前截斷，產(chǎn)生的截斷蛋白在叉頭區(qū)完全或不完全缺失，導(dǎo)致眼瞼發(fā)育異常并伴有POF；Ⅱ型FOXL2突變產(chǎn)物是一種延長蛋白，多由聚丙氨酸區(qū)的丙氨酸擴增產(chǎn)生。FOXL2突變產(chǎn)生截斷蛋白，導(dǎo)致原始卵泡形成后卵母細胞周圍的體細胞不能生長增殖，最終次級卵泡缺乏[15]。有研究用Cre/lox條件性基因敲除法，選擇性地敲除了小鼠垂體前葉促性腺激素細胞中的Foxl2基因，條件性Foxl2基因敲除（CKO）的小鼠發(fā)育正常，但成年后生殖能力下降。CKO小鼠垂體中FSH β亞基mRNA表達量減少，導(dǎo)致FSH水平明顯偏低。該實驗提示Foxl2基因可能是體內(nèi)FSH生成所必需的[16]。Foxl2基因?qū)︻w粒細胞分化、卵泡正常發(fā)育和維持正常的卵巢功能至關(guān)重要，并且具有抗卵泡凋亡的作用。Foxl2基因突變使顆粒細胞不能由扁平轉(zhuǎn)為立方體，致使次級卵泡缺失，加速卵泡耗竭閉鎖，導(dǎo)致卵巢內(nèi)卵泡數(shù)目減少，最終發(fā)展為POI[16]。一例個案報道對POI患者外周血樣本進行全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)其攜帶FOXL2基因突變[c.223C＞T（p.Leu75Phe）][17]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，和卵巢儲備正常人相比，POI患者卵巢組織中的FOXL2 mRNA表達水平偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.017），表明FOXL2表達水平低下可能是POI的致病因素[18]，提示該基因也可能是導(dǎo)致DOR的因素之一。

2 非綜合性候選基因

2.1 GDF-9GDF-9是轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族成員之一，是卵母細胞產(chǎn)生的一種旁分泌因子，其對卵泡生成、顆粒細胞增殖至關(guān)重要。在卵巢組織中，GDF-9在卵母細胞中特定表達。除原始卵泡外，在所有卵泡發(fā)育時期均能檢測到[19]。該因子構(gòu)成復(fù)雜的旁分泌網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)卵母細胞和周圍體細胞聯(lián)系，促進初級卵泡向次級卵泡過渡，從而調(diào)控卵泡發(fā)育。Dong等[20]對Gdf-9基因敲除的小鼠卵巢進行了組織學(xué)實驗，結(jié)果顯示Gdf-9基因敲除的小鼠卵巢體積明顯小于野生型小鼠，同時Gdf-9基因敲除小鼠的顆粒細胞形成異常，只能維持在單層狀態(tài)，卵泡發(fā)育停滯于初級階段，無法形成正常的卵泡，最終導(dǎo)致不孕。目前，多篇研究顯示GDF-9的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與DOR有關(guān)[21-22]。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)GDF-9 c.G546A基因多態(tài)性和DOR及體外受精（IVF）結(jié)局密切相關(guān)。在DOR組中，攜帶GDF-9 c.G546A等位基因（GA/AA基因型）與攜帶GDF-9 546GG等位基因（GG基因型）相比，卵巢低反應(yīng)的發(fā)生率增高（64.7%vs.23.6%）。此外，在控制性超排卵中，DOR患者需要更大劑量的重組人卵泡刺激素（rFSH），但是獲得的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及妊娠率都較低。然而，在卵巢儲備功能正常組中，攜帶GDF-9 c.G546A等位基因（GA/AA基因型）與攜帶GDF-9 546GG等位基因（GG基因型）相比，卵巢低反應(yīng)的發(fā)生率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率以及妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。據(jù)此推測GDF-9 c.G546A等位基因可能是導(dǎo)致DOR的原因。相繼，該研究組在2例DOR患者中發(fā)現(xiàn)GDF-9存在新發(fā)突變c.G436T（p.R146C），但在卵巢功能正常人群中未檢測到[22]。攜帶p.R146C的2例患者在IVF治療中均發(fā)生卵巢低反應(yīng)。該突變導(dǎo)致蛋白產(chǎn)生減少，蛋白活性部分失活，影響蛋白的生物功能。提示GDF-9基因突變可能是導(dǎo)致DOR的重要原因。

2.2 FSHR生長卵泡在促性腺激素及性激素作用下發(fā)育成熟，生殖內(nèi)分泌相關(guān)基因突變可影響卵泡的募集、生長等功能。FSH是由垂體前葉產(chǎn)生的一種糖蛋白，在排卵前主要負責(zé)卵泡的形成和募集。其受體FSHR是G蛋白耦聯(lián)受體，主要位于卵巢顆粒細胞上。FSHR基因包含一個大外顯子和九個較小的外顯子，分別編碼跨膜胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域及細胞外結(jié)構(gòu)域。FSH與相應(yīng)受體結(jié)合以后，激活下游的環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A（cAMP-PKA）信號通路，引起靶蛋白發(fā)生磷酸化，從而參與并維持正常的性腺發(fā)育和生殖功能[23]。FSHR基因第680位點的多態(tài)性可能是導(dǎo)致卵巢反應(yīng)性差異的重要因素。一項研究通過提取108例不孕婦女外周血基因組DNA，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）檢測擴增FSHR基因外顯子10的片段并測序，研究該基因第680位點多態(tài)性。根據(jù)第680位是天冬酰胺（Asn）或絲氨酸（Ser）分為Asn/Asn、Asn/Ser和Ser/Ser型。Asn/Asn型全部是正常卵巢反應(yīng)；而Asn/Ser型中卵巢正常反應(yīng)占64.8%、卵巢低反應(yīng)占21.1%、卵巢高反應(yīng)占14.1%；Ser/Ser型中卵巢反應(yīng)均不正常，卵巢低反應(yīng)占46.7%、卵巢高反應(yīng)占53.3%，表明FSHR基因第680 位點多態(tài)性與卵巢反應(yīng)性有關(guān)[24]。Livshyts等[25]研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因第680位氨基酸從天冬酰胺（Asn）變?yōu)榻z氨酸（Ser），在卵巢低反應(yīng)人群中出現(xiàn)頻率高達26%，而在卵巢正常反應(yīng)組中僅7.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。盡管基因分型研究的樣本量很小，但都提示攜帶該基因型患者發(fā)生DOR的可能性較高。

2.3 ESR1該基因編碼雌激素受體α，并與雌激素相互作用，調(diào)控性腺激素釋放，在顆粒細胞增殖和卵泡生成過程中發(fā)揮重要作用。目前，在人類雌激素受體發(fā)現(xiàn)了兩種亞型：α和β[26]，分別由ESR1和ESR2基因表達。ESR1位于6q25.1染色體上，由8個外顯子組成；ESR2位于14q23.2號染色體上，由8個外顯子組成。在卵巢內(nèi)，α受體通常在卵泡膜細胞中表達更多，而β受體在顆粒細胞中表達[27]。M′Rabet等[28]研究發(fā)現(xiàn)位于ESR1基因內(nèi)含子1的PvuⅡ多態(tài)性變異在不育女性中的發(fā)生率是正常女性的兩倍，提示ESR1-PvuⅡ多態(tài)性可能導(dǎo)致POF。Livshyts等[29]分析卵巢儲備受損患者和卵巢儲備功能正常人群（年齡＜35歲為對照組Ⅰ；＞35歲對照組Ⅱ）的ESR1-PvuⅡ多態(tài)性（rs2334693），卵巢儲備受損組的p-等位基因頻率（-397T）為59.7%，卵巢儲備功能正常人群組（對照組Ⅰ）的p-等位基因頻率（-397T）為48.0%，卵巢儲備功能正常人群組（對照組Ⅱ）為45.3%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明ESR1-PvuⅡ多態(tài)性與卵巢儲備功能有關(guān)，提示該多態(tài)性可能是DOR的危險因素之一。

3 DOR與端粒長度的關(guān)系

端粒是位于染色體末端的DNA-蛋白結(jié)構(gòu)，由TTAGGG重復(fù)序列和大量的端粒結(jié)合蛋白組成。端粒長度通常由端粒酶維持。端粒酶核心有兩個必需組分：端粒酶RNA （TERC） 和角化不良蛋白（Dyskerin，DKC）組成。端粒酶RNA作為端粒延長的模板，角化不良蛋白則參與穩(wěn)定端粒酶的組成。由于末端復(fù)制問題，在端粒酶缺乏的情況下，端粒逐漸縮短。端粒酶基因（如TERC，DKC）突變的患者表現(xiàn)出端?？s短、POF及其相關(guān)疾病[30]。在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細胞維持端粒酶的活性以利于增殖分化，顆粒細胞則與卵母細胞相互作用，影響卵泡發(fā)生、發(fā)育及卵子質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)卵母細胞和顆粒細胞的端?？s短被認為是卵母細胞和卵泡質(zhì)量降低的征兆[31]。POI患者表現(xiàn)為顆粒細胞端粒縮短加快[32]。一項研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）估算顆粒細胞的端粒長度，結(jié)果表明和正常組（卵巢功能正常）的端粒長度（1.07±0.27）相比，POI患者的端粒長度較短（0.93±0.23），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000 6）[33]。提示端粒長度變化可能也與DOR有關(guān)。但其相關(guān)機制尚不清楚，需要進一步研究DOR與顆粒細胞端粒長度的關(guān)系，為發(fā)掘臨床診治策略提供更多理論基礎(chǔ)。

4 展望

綜上所述，DOR是一種由多因素相互作用導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，目前在大多數(shù)情況下病因仍不明確。因此深入研究DOR的發(fā)病機制及致病基因，不僅有助于了解卵巢功能的分子基礎(chǔ)，而且能為臨床高危險人群進行遺傳咨詢提供理論依據(jù)。未來隨著DNA測序技術(shù)的不斷發(fā)展，為尋找新的DOR易感位點或候選基因提供了高效的篩選手段，與病理性DOR相關(guān)聯(lián)的基因多態(tài)性、基因突變和表觀遺傳因素將會相繼發(fā)現(xiàn)。將來在進行卵巢刺激輔助生殖助孕之前，對該類患者進行基因篩查，為臨床提供新穎的靶向治療方法。