陳仝，楊曉葵

反復(fù)種植失?。╮ecurrent implantation failure，RIF）是體外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET）成功率進(jìn)一步提高的關(guān)鍵因素之一，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要是指在2個(gè)或以上的新鮮或冷凍周期內(nèi)，共移植至少4個(gè)優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎或不少于2個(gè)囊胚后仍未獲臨床妊娠[1]。胚胎著床取決于良好的子宮內(nèi)膜容受性、高質(zhì)量胚胎及兩者相互作用。RIF原因復(fù)雜，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前研究熱點(diǎn)聚焦于胚胎植入過程中子宮內(nèi)膜容受性與胚胎發(fā)育的分子層面。近年來(lái)，基因芯片技術(shù)檢測(cè)顯示mRNA和非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）的差異表達(dá)可影響子宮內(nèi)膜容受性及胚胎植入，從而在RIF的發(fā)生中發(fā)揮生物學(xué)作用。現(xiàn)就ncRNA在RIF方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ncRNA的生物學(xué)特點(diǎn)

ncRNA是一類不直接參與蛋白質(zhì)編碼的RNA分子，但其并非無(wú)生物學(xué)功能，可參與mRNAs剪接、表觀遺傳控制、啟動(dòng)子特異性基因調(diào)控、X染色體失活、核結(jié)構(gòu)維持等多種生理及病理過程[2]。根據(jù)ncRNA形狀可將其分為線性RNA及環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）兩類，線性RNA又可根據(jù)長(zhǎng)度分為以下兩類：①長(zhǎng)度小于200個(gè)核苷酸的短鏈ncRNA，包括核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、與Piwi蛋白相作用的RNA（PIWI interacting RNA，piRNA）、小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）等；②長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈ncRNA（long non-coding RNA，lncRNA）[2-3]。隨著測(cè)序技術(shù)發(fā)展和研究的深入，微小RNA（miRNA）、lncRNA和circRNA等在細(xì)胞中的作用越來(lái)越受到關(guān)注，這些ncRNA可以通過影響子宮內(nèi)膜中黏附分子、細(xì)胞因子的表達(dá)等調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性，參與卵母細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞增殖、發(fā)育等多種生物學(xué)過程影響胚胎質(zhì)量和胚胎與子宮內(nèi)膜相互作用，從多個(gè)環(huán)節(jié)導(dǎo)致RIF的發(fā)生。

2 miRNA與RIF

2.1 miRNA對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性是指著床期子宮內(nèi)膜獲得介導(dǎo)胚胎著床的能力，月經(jīng)周期中允許發(fā)育正常的胚胎黏附并侵入子宮內(nèi)膜的時(shí)間段稱為種植窗，約在排卵后7～10 d，在此期間，發(fā)育同步的胚胎和子宮內(nèi)膜通過相互作用使胚胎成功著床[4]。miRNA可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子表達(dá)影響子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致RIF的發(fā)生。在著床前后，白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的高表達(dá)可提高子宮內(nèi)膜容受性，與野生型小鼠相比，敲除miR-30d或使用miRNA激動(dòng)劑上調(diào)miR-223-3p均可降低子宮內(nèi)膜組織中LIF的表達(dá)，從而抑制胚胎著床[5-6]。同源盒基因A10（homeobox A10，HOXA10）是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的重要分子，其正常表達(dá)是胚胎種植所必需的[7]。人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中過量的miR-139-5p可抑制HOXA10的表達(dá)，對(duì)胚胎種植產(chǎn)生不利影響[8]。Kresowik等[9]關(guān)于已生育女性子宮內(nèi)膜的研究發(fā)現(xiàn)，miR-31在種植窗期子宮內(nèi)膜組織和血清中均顯著高表達(dá)。這些研究表明，miRNA不僅可通過調(diào)節(jié)LIF、HOXA10等著床關(guān)鍵分子的表達(dá)影響子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致RIF發(fā)生，也可作為潛在的子宮內(nèi)膜容受性評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物。

2.2 miRNA對(duì)胚胎種植的影響miRNA除調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性外，還可通過各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響子宮內(nèi)膜和胚胎之間的相互作用。正常小鼠的子宮內(nèi)膜組織中miR-429在胚胎種植過程中表達(dá)下降，miR-429表達(dá)增加可通過抑制原鈣黏蛋白8而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力，導(dǎo)致植入位點(diǎn)減少，從而影響胚胎植入[10]。而miR-126-3p在小鼠子宮內(nèi)膜植入位點(diǎn)特異性上調(diào)，可通過上調(diào)整合素（integrin,ITG）α11的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲能力，在胚胎種植中起到重要作用[11]?；|(zhì)金屬蛋白酶26（matrix metalloproteinase 26，MMP26）是一種參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的MMPs家族成員，研究發(fā)現(xiàn)小鼠子宮內(nèi)膜中miR-125b表達(dá)水平的增加可通過抑制MMP26的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)并阻礙胚胎著床[12]。有研究表明RIF患者子宮內(nèi)膜組織中高表達(dá)的miR-145，通過抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（endometrial epithelium cells,EECs）中有利于細(xì)胞表面黏附的胰島素樣生長(zhǎng)因子1型受體（insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R）而抑制胚胎附著，這可能是RIF發(fā)生的潛在分子機(jī)制[13]。

胚胎的成功種植與胚胎質(zhì)量關(guān)系密切。目前，可移植胚胎的選擇主要基于形態(tài)學(xué)評(píng)估，然而簡(jiǎn)單的形態(tài)學(xué)方法不足以預(yù)測(cè)胚胎質(zhì)量。研究表明miRNA表達(dá)水平與卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎質(zhì)量有關(guān)。Feng等[14]研究顯示，發(fā)育成優(yōu)質(zhì)胚胎的人卵母細(xì)胞的卵泡液中miR-320呈高表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明在小鼠卵母細(xì)胞中敲除miR-320，可通過Wnt信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)胚胎發(fā)育潛能產(chǎn)生負(fù)面影響。豬卵母細(xì)胞中，下調(diào)的miR-29b通過介導(dǎo)DNA甲基化，上調(diào)凋亡基因Bax和Caspase-3表達(dá)，導(dǎo)致囊胚質(zhì)量下降，提示miR-29b可能在胚胎發(fā)育中起到保護(hù)作用[15]。未發(fā)育成囊胚的牛的條件培養(yǎng)基中，miR-24、miR-191和miR-148A表達(dá)均顯著上調(diào)，添加miR-24類似物后可明顯縮短桑葚胚發(fā)育到囊胚期的時(shí)間[16]。

上述研究表明，miRNA可調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附及侵襲相關(guān)因子表達(dá)，影響胚胎與子宮內(nèi)膜間的相互作用，并通過參與DNA甲基化、細(xì)胞凋亡等途徑調(diào)控干擾卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育，進(jìn)而影響胚胎種植，導(dǎo)致RIF的發(fā)生。

3 lncRNA與RIF

與正?？扇焉锱韵啾?，RIF患者子宮內(nèi)膜組織、卵母細(xì)胞及其周圍卵丘細(xì)胞中存在著大量差異表達(dá)的lncRNA。這些lncRNA可參與調(diào)節(jié)免疫活性、細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡、染色質(zhì)重塑等多種途徑影響子宮內(nèi)膜容受性、胚胎與子宮內(nèi)膜間的相互作用及胚胎質(zhì)量，在RIF的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

3.1 lncRNA對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控RIF患者與ET后成功妊娠女性的種植窗期子宮內(nèi)膜組織中存在多種差異表達(dá)的lncRNA，生物信息學(xué)分析顯示NONHSAT083203.2、NONHSAT212577.1和NONHSAT 193031.1等lncRNA通過lncRNA-mRNA相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖與凋亡、生長(zhǎng)因子表達(dá)及免疫活性影響子宮內(nèi)膜血管生成和對(duì)類固醇類激素的反應(yīng)，從而影響子宮內(nèi)膜容受性，參與RIF的發(fā)生[17-18]。Xu等[19]通過分析RIF患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞的lncRNAmiRNA-mRNA 網(wǎng) 絡(luò)，發(fā) 現(xiàn)lncRNA（TRG-AS1、SIMM25、NEAT1、LNC00511、SLC26A4-AS1 和H19）通過參與免疫反應(yīng)、代謝過程和細(xì)胞周期調(diào)控等多種途徑影響子宮內(nèi)膜容受性，在RIF的發(fā)生中發(fā)揮作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.2 lncRNA對(duì)胚胎種植的影響lncRNA可通過調(diào)節(jié)ITG家族的表達(dá)參與調(diào)控胚胎與子宮內(nèi)膜間相互作用。研究發(fā)現(xiàn)RIF患者子宮內(nèi)膜組織中l(wèi)ncRNA H19與ITGβ3的表達(dá)水平均降低且呈正相關(guān)，這種改變是lncRNA H19通過抑制let-7進(jìn)而調(diào)控ITGβ3的表達(dá)引起的，提示lncRNA H19在胚胎種植中可能起到重要作用[20]。Li等[21]研究表明可妊娠女性的子宮內(nèi)膜中，正常表達(dá)的lncRNA ENST00000433673可通過介導(dǎo)靶基因ITGAL提高細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)胚胎的黏附和植入。

卵母細(xì)胞及其周圍卵丘細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNA與卵母細(xì)胞質(zhì)量、胚胎發(fā)育潛能及胚胎質(zhì)量有關(guān)。AK124742是PSMD6基因的一個(gè)反義lncRNA，在發(fā)育成優(yōu)質(zhì)胚胎的卵母細(xì)胞外周的人卵丘細(xì)胞中，AK124742和PSMD6的表達(dá)水平上調(diào)且呈正相關(guān)，而且妊娠組AK124742和PSMD6的表達(dá)水平明顯高于非妊娠組[22]。Bouckenheimer等[23]應(yīng)用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)人MⅡ卵母細(xì)胞及卵丘細(xì)胞中顯著表達(dá)的lncRNA并構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)其功能，結(jié)果顯示MⅡ卵母細(xì)胞顯著表達(dá)的lncRNA（BCAR4、C3orf56、Tunar、OOEP-AS1、CASC18 和LINC01118）可能參與染色質(zhì)重塑、細(xì)胞多能性及推動(dòng)早期胚胎發(fā)育，而卵丘細(xì)胞中顯著表達(dá)的lncRNA（NEAT1、MALAT1、ANXA2P2、MEG3、IL6STP1 和VIM-AS1）與凋亡相關(guān)基因和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)功能基因表達(dá)相關(guān)。這表明多種lncRNA可參與卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞間的相互作用影響胚胎發(fā)育。

4 circRNA與RIF

4.1 circRNA對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控目前對(duì)circRNA在子宮內(nèi)膜容受性中作用的研究仍處于初步探索階段。但已發(fā)現(xiàn)多種顯著差異表達(dá)的circRNA參與子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控。Liu等[24]通過circRNA微陣列技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了在RIF患者子宮內(nèi)膜中hsa-circRNA-103716、hsa-circRNA-070616、hsacircRNA-104854、has-circRNA-104001、has-circRNA-004183、has-circRNA-044353和hsa-circRNA-404686這7個(gè)顯著差異表達(dá)的circRNA。另有動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-9119通過降低miR-26a水平下調(diào)羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2的表達(dá)，影響LIF和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等細(xì)胞因子水平從而調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性[25]。

4.2 circRNA對(duì)胚胎種植的影響circRNA在胚胎與子宮內(nèi)膜相互作用及胚胎質(zhì)量中的研究也逐步開展。circRNA可通過與miRNA競(jìng)爭(zhēng)mRNA的非編碼區(qū)，對(duì)mRNA表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，即為miRNA海綿。circRNA8073可作為miRNA海綿降低miR-181a的水平，從而增加羊EECs中神經(jīng)降壓素的表達(dá)，抑制EECs凋亡，并誘導(dǎo)LIF、VEGF、HOXA10和環(huán)氧合酶2的表達(dá)，有利于胚胎種植[26]。Zhang等[27]利用微陣列技術(shù)檢測(cè)了早孕小鼠子宮內(nèi)膜組織中著床點(diǎn)和未著床點(diǎn)的circRNA表達(dá)譜，結(jié)果顯示，與未植入部位相比，植入部位有101個(gè)circRNA上調(diào)，75個(gè)circRNA下調(diào)，差異表達(dá)的circRNA與細(xì)胞連接、滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附與侵襲等胚胎種植因素有關(guān)。

circRNA在胚胎早期發(fā)育中是必不可少的，異常表達(dá)可能會(huì)影響胚胎質(zhì)量導(dǎo)致胚胎種植失敗。在豬卵母細(xì)胞中敲除circARMC4可導(dǎo)致染色體排列嚴(yán)重受損，并顯著抑制第一極體排出和早期胚胎發(fā)育[28]。Cheng等[29]應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析了≤30歲和≥38歲女性顆粒細(xì)胞中circRNA的表達(dá)，差異表達(dá)的circRNA_103827和circRNA_104816參與葡萄糖代謝、細(xì)胞有絲分裂和卵巢類固醇的生成，可反映卵泡微環(huán)境受損的情況，其表達(dá)水平與女性年齡呈正相關(guān)而與優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈負(fù)相關(guān)。兩者在胚胎種植中的作用仍需更多研究去證實(shí)。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

ncRNA可通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子表達(dá)、血管增生、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞連接、滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和類固醇類激素調(diào)控等多種途徑參與子宮內(nèi)膜容受性、胚胎與子宮內(nèi)膜同步發(fā)育和胚胎發(fā)育的調(diào)控。目前有關(guān)lncRNA及circRNA在RIF中的研究大多數(shù)處于差異表達(dá)檢測(cè)階段，差異表達(dá)分子影響子宮內(nèi)膜容受性及胚胎種植的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。通過深入了解ncRNA調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性及胚胎種植的機(jī)制，有望找尋提高不孕患者胚胎種植率的方法，以期早日突破RIF這一輔助生殖技術(shù)中的瓶頸問題。