雜交構(gòu)樹UDP-葡萄糖脫氫酶基因編碼蛋白的亞細胞定位及其啟動子5'端缺失片段的功能分析

吉仁花 張文波 林曉飛 包穎亮 特日格勒 包會嘎 白淑蘭*

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，呼和浩特 010019；2. 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；3. 烏海市濕地管理局，烏海 016000）

基因表達調(diào)控受多種內(nèi)外因子的影響，生物能夠根據(jù)自身需要及復(fù)雜多變的外界環(huán)境的改變作出反應(yīng)、調(diào)控特定的基因表達，以適應(yīng)其生長環(huán)境，同時也是生物體內(nèi)的細胞分化、形態(tài)發(fā)生及個體發(fā)育的分子基礎(chǔ)［1］?；虮磉_在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、蛋白質(zhì)加工水平等多個層次上進行調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控是表達調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，受多種順式作用元件及轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)調(diào)作用。順式作用元件是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄效率［2］。植物基因啟動子是重要的順式作用元件，通常位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游，可能通過與一些調(diào)節(jié)蛋白直接或者間接作用來控制著RNA 聚合酶的活性，激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子與下游基因的啟動子核心序列相結(jié)合，進而特異性地轉(zhuǎn)錄出一定量的mRNA，以參與調(diào)控下游相應(yīng)基因表達［3］，是調(diào)控基因表達的“開關(guān)”［4］。啟動子的應(yīng)用不僅可以在植物的特定部位或者某個發(fā)育階段生產(chǎn)目的蛋白或其他代謝產(chǎn)物，以實現(xiàn)對外源基因的表達調(diào)控，還可為新基因的功能研究以及闡明植物生長發(fā)育的調(diào)控機理等方面提供全新的思路［5］。目前，人們在轉(zhuǎn)基因育種研究中，利用啟動子實現(xiàn)對目標基因在某一時間或者目標組織中的高效表達，從而嘗試著達到培育高效、抗逆、安全的轉(zhuǎn)基因植物的目的［6～10］。因此，對于抗逆相關(guān)基因的啟動子克隆和確定其順式作用元件的核心序列、順式作用元件之間的相互作用以及這些順式作用元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子的研究是啟動子研究的重點［3］。

近期，中國科學(xué)院植物研究所利用野生構(gòu)樹（Broussonetia papyifera）為父本、小構(gòu)樹（Broussonetia kazinoki）為母本，通過現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)雜交育種方法培育出具有突出抗逆性的速生和豐產(chǎn)樹種——雜交構(gòu)樹（Broussonetia kazinoki×Broussonetia papyifera）［11］。雜交構(gòu)樹是多年生木本植物，有13 對染色體（2n=26），其基因組緊湊，遺傳背景簡單且表型性狀豐富［12］。具有生長快、分布廣、適應(yīng)性強、易繁殖、抗污染能力強及耐煙塵污染等特點。是一種多功能綜合性樹種，廣泛應(yīng)用于造紙、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)［13］并在扶貧產(chǎn)業(yè)、環(huán)境保護、生態(tài)修復(fù)上發(fā)揮著重要作用［14］。

在高等植物中，多糖代謝在調(diào)控其纖維素、半纖維素、果膠和胼胝質(zhì)等細胞壁物質(zhì)的形成、營養(yǎng)器官的生長及生殖器官的發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶（UDP-glucose dehydrogenas，UGDH）普遍存在于生物體內(nèi)，是半纖維素和果膠生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，它催化UDPGlc 生成多糖合成過程中的關(guān)鍵前體物質(zhì)——UDP-GlcA，是一種以NAD+或NADP+為受體、作用于供體CH-OH 基團上的氧化還原酶，參與多種糖代謝過程，進而調(diào)控植物生長發(fā)育［15］。UGDH 基因在不同物種中顯示比較保守，其核苷酸序列在植物中具有較高的同源性，但在原核生物中其核苷酸序列的同源性則較低。植物的UGDH 中均含有NAD 輔酶結(jié)合位點和催化位點兩個功能結(jié)構(gòu)域，例如：雜交楊（P.tremula×P.remuloides）［16］、大豆（Glycine max）［17］、苧麻（Boehmeria nivea）［18］、興安落葉松（Larix gmelinii）［19］、桉樹（Eucalyptus grandis）［20］UGDH 中與NAD 的結(jié)合有關(guān)的NAD 輔酶結(jié)合位點均位于8-14氨基酸、267-278氨基酸處。通常，UGDH 基因以不同的拷貝形式存在于植物中。在桉樹［20］、興安落葉松［19］和玉米（Zea mays）［21］的基因組中，均以雙拷貝形式存在；在人類基因組中以單拷貝的形式存在［22］；在擬南芥基因組中存在5個拷貝，包含4 個功能型基因和一個假基因［23］。UGDH 在植物體內(nèi)的多糖代謝和半纖維生物合成途徑中發(fā)揮著重要的作用。Klinghammer 和Tenhaken［23］研究結(jié)果顯示，AtUGDH 基因在轉(zhuǎn)基因植物中的過量表達增加了細胞壁的多糖含量，并呈現(xiàn)出特定的表型。興安落葉松LgUGDH 基因在擬南芥中的過量表達，增強了轉(zhuǎn)基因植物的營養(yǎng)生長，促進了半纖維素的生物合成并提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗寒性［19］。使用突變方法對玉米的ZmUGDH 基因進行功能分析顯示，在ZmUGDH 突變株中，細胞壁形成所需的基質(zhì)多糖含量顯著降低［21］。這些結(jié)果表明UGDH 在調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育中起關(guān)鍵作用。因此，分析雜交構(gòu)樹UGDH 基因啟動子各個順式調(diào)控元件在轉(zhuǎn)基因植物中的表達活性，進而明確各順式作用元件的功能及相互之間的關(guān)系是十分重要的。研究利用篩選的調(diào)控元件調(diào)節(jié)UGDH 基因在多糖合成過程中特異表達，從而調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物的生長發(fā)育。另外，一個基因的功能及其所參與的代謝途徑，很大程度上和該基因編碼的蛋白在細胞器中的所處位置有關(guān)。為了探索BpUGDH 基因調(diào)控植物生長發(fā)育的分子機制，對BpUGDH 基因編碼的蛋白質(zhì)進行亞細胞定位，進一步深入分析該基因的功能及其所參與的代謝途徑奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

雜交構(gòu)樹（B.kazinoki×B.papyifera）插條由內(nèi)蒙古包頭市綠禾農(nóng)牧林業(yè)有限公司提供，將插條剪成長度為35 cm，扦插在土壤和蛭石體積比1∶1 混和基質(zhì)的花盆中，4周后從植物幼嫩葉片中提取基因組DNA。

將本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種子用75%的酒精消毒4min 后短暫離心，倒出酒精，再加入無水酒精，用移液槍吹打，撒到無菌的濾紙上，待無水酒精完全揮發(fā)后，將種子均勻的播種到1/2MS 固體培養(yǎng)基中，置于4℃培養(yǎng)箱春化3 d 后，移至22±2℃，16 h光照/8 h黑暗光周期和45 mol·m-2·s-1的光照強度下培養(yǎng)；待煙草發(fā)芽長出2 片真葉時，移到已滅菌的土壤蛭石體積比1∶1 的營養(yǎng)土中，覆膜保濕5 d，撤膜后培養(yǎng)室條件下培養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 BpUGDH 基因啟動子5'端缺失片段的功能分析

BpUGDH 基因啟動子5'端缺失片段的克隆：將前期研究中利用Genome Walking kit（Takara），染色體步移（Genome Walking）技術(shù)克隆獲得的BpUGDH 基因啟動子1304bp 序列。根據(jù)Plant-CARE［24］（http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/ plant care/html/）在線軟件對所獲得的BpUGDH 基因上游啟動子序列進行順式作用元件的預(yù)測結(jié)果（詳見附圖1），使Pro.BpUGDH 從轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 304 bp的5'端逐一形成5個缺失片段，分別記為PB2-ETH（缺失-1 304 至-973）、PB3-Me-JA（缺失-1 304 至-465）、PB4-低溫（缺失-1304 至-355）、PB5-IAA（缺失-1 304 至-281）和PB6-GA（缺失-1 304至-244）。

根據(jù)BpUGDH 基因啟動子5'端逐一形成的5個缺失片段序列設(shè)計5 條包含pORE R1 載體多克隆位點兩側(cè)序列的重組引物和反向引物BpUGDH-Xbal-R（如表1 所示），以質(zhì)粒pMD19-T-Pro.BpUGDH 為模板，并利用Trans Start?FastPfu DNA Polymerase kit（TransGen Biotech）分 別 擴 增Pro.BpUGDH 5'端逐一形成的5 個缺失片段序列。PCR 反 應(yīng) 體 系 含 有10 μL 5×TransStart?FastPfu Buffer，4 μL 2.5 mmol·L-1dNTP，2.5 U Trans-Start?FastPfu DNA Polymerase，1μL 的10μmol·L-1的重組引物PB2-ETH（-973）-F2、PB3-MeJA（-465）-F3、PB4-低溫（-355）-F4、PB5-IAA（-281）-F5、PB6-GA（-244）-F6 和BpUGDH-Xbal-R 以及2 μL 質(zhì)粒pMD19-T-Pro. BpUGDH。PCR 擴增條件為：95℃3 min；95℃20 s，68℃20 s，72℃1 min，35 個循環(huán)；72℃10 min 作為最終延伸。1%的瓊脂糖電泳檢測、回收目的條帶。

表1 BpUGDH啟動子缺失片段的引物Table 1 Primers for the deletion of the BpUGDH promoter

BpUGDH 基因啟動子5'端缺失片段和pORE R1 載體的連接：利用pEASY?-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit 同源重組XbaI 酶切之后的線性化pORE R1 載體和BpUGDH 基因啟動子5'端缺失片段。反應(yīng)體系含有5 μL 2×Assembly Mix，0.04 pmol（濃度為193 ng·μL-1，1.32 μL）線性化載體和0.08 pmol（GA：22.9 ng·μL-1，0.6 μL；ETH：100 ng·μL-1，0.52 μL；MeJA：52.6 ng·μL-1，0.98μL；IAA：29 ng·μL-1，0.54 μL；4℃：35.3 ng·μL-1，0.55 μL）BpUGDH 基因啟動子5'端缺失片段，在50℃孵育15 min。反應(yīng)結(jié)束后，迅速拿出鏈接產(chǎn)物，冰上放置數(shù)秒后全部轉(zhuǎn)化50 μL 大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細胞，涂布kan 抗性平板，37℃過夜培養(yǎng)。

pORE R1-Pro.PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS重組質(zhì)粒的鑒定：分別挑取單菌落利用pORE R1載體的通用引物pORE-F：5'-ACTGAAGGCGGGAAACGACAAT-3'， pORE-R： 5'-TTTCACGGGTTGGGGTTTCTAC-3'進行菌落PCR檢測的同時利用XhoI、SacI酶切鑒定，選取PCR 及雙酶切鑒定均為陽性的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

從測序顯示正確的陽性重組菌中提取質(zhì)粒，通過凍融法將pORE R1-Pro.PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞。

Pro.BpUGDH：：GUS 和各個缺失片段的煙草的瞬時轉(zhuǎn)化：將轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101的質(zhì)粒菌種置于10 mL含有50 mg·L-1Kan和100 mg·L-1Rif的LB液體培養(yǎng)基中，在28℃200 r·min-1培養(yǎng)16 h 左右，使菌液OD600達到1.0～1.5 時3 600 r·min-1離心10 min，棄上清液。用10 mmol·L-1MES，10 mmol·L-1MgCl2，200 μmol·L-1As（pH 約為5.6）侵染液，重新懸浮菌液，并調(diào)節(jié)其OD600≈0.6。選擇7 周齡、長勢良好、舒展的、從最新葉算起選取第4 片葉，使用1 mL 注射器，避開葉脈從葉背面緩慢注入煙草下表皮，在22±2℃，16 h 光照/8 h 黑暗光周期和45 mol·m-2·s-1的光照強度下繼續(xù)生長4 d。

煙草葉片的GUS 染色及其β-GUS 含量的檢測：避開煙草葉片的注射針孔區(qū)域，用打孔器取直徑約0.5 cm 的葉圓片，置于GUS染色液中，在37℃下避光處理過夜；用無水乙醇脫色2～3 次以除去綠色，并在Nikon SMZ1000 顯微鏡下觀察Pro.BpUGDH：：GUS 和各個缺失片段的表達并拍照。同時采用植物β-葡萄糖苷酸酶（GUS）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定煙草葉片中β-GUS 的含量，具體操作方法見說明書。

1.2.2 雜交構(gòu)樹UGDH基因亞細胞定位分析

亞細胞定位預(yù)測：利用在線軟件TargetP 1.1［25］（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和Cell-PLoc 2.0［26］（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）進行BpUGDH亞細胞定位預(yù)測。

BpUGDH 基因ORF 的擴增：將前期研究中克隆已獲得的BpUGDH 基因的ORF末端分別設(shè)計兩條特異性引物，并在其5'末端添加KpnI 酶切位點（BpUGDH-1300-F：5'-CGGGGTACCATGGTGAAGATCTGTTGCATT-3'）和3'末端添加XbaI 酶切位點（BpUGDH-1300-R：5'-TAGTCTAGATGCCACAGCAGGCATGTCC-3'，去除終止密碼子），擴增目的基因的ORF 區(qū)域。PCR 反應(yīng)體系為：分別0.5 μL的10 μmol·L-1的BpUGDH-1300-F/R、1 μL pMD-19T-BpUGDH 質(zhì)粒、12.5μ L PrimeSTAR?Max DNA Polymerase（Takara），反應(yīng)體系為：98℃3 min；98℃10 s，55℃5 s，72℃5 s，35 個循環(huán)；72℃5 min 作為最終延伸。

pCAMBIA1300-35S-BpUGDH-GFP 載體的構(gòu)建：利用DNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞（Takara），7.0μL的BpUGDH 雙酶切膠回收產(chǎn)物、3.5μL的載體雙酶切膠回收產(chǎn)物和10.5μL的Ligation Mix，輕輕混勻后16℃連接8 h。待反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細胞，涂布于kan抗性板上37℃培養(yǎng)過夜。

pCAMBIA1300-35S-BpUGDH-GFP 重組載體的鑒定：分別挑取單菌落利用pCAMBIA1300-35SGFP載體引物1300-GFP-F：5'-ATGGTGAAGATCTGTTGCATT-3' 和 1300-GFP-R：5'-TGCCACAGCAGGCATGTCC-3'進行菌落PCR檢測的同時利用KpnI 和XbaI 酶切鑒定，選取PCR 及雙酶切鑒定均為陽性的菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

煙草葉片的瞬時轉(zhuǎn)化：提取測序鑒定正確的pCAMBIA1300-35S-BpUGDH-GFP 重組表達載體質(zhì)粒，通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細胞，利用注射法進行煙草的瞬時轉(zhuǎn)化，在22±2℃，16 h 光照/8 h 黑暗光周期和45 mol·m-2·s-1的光照強度下繼續(xù)生長4 d 后使用德國蔡司（ZEISS）LSM 71003040702 激光共聚焦顯微鏡進行熒光檢測、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆BpUGDH基因啟動子5'端缺失片段

利用正向引物PB2-ETH（-973）-F2、PB3-MeJA（-465）-F3、PB4-低溫（-355）-F4、PB5-IAA（-281）-F5、PB6-GA（-244）-F6 和反向引物BpUGDH-XbaIR，以重組質(zhì)粒pMD19-T-Pro.BpUGDH 為模板進行PCR 擴增，獲得5 條大小不同的Pro.BpUGDH 的5'端缺失片段，經(jīng)測序驗證其大小分別為1 035、527、417、343和306 bp（見圖1）。

2.2 pORE R1-Pro. PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS表達載體的鑒定

圖1 Pro.BpUGDH的5'端缺失片段的克隆M. 200 bp DNA Ladder；1. 克隆獲得的Pro. BpUGDH 片段；2～6.Pro.BpUGDH缺失片段Fig.1 Cloning of the deletion fragment of Pro.BpUGDHM. 200 bp DNA Ladder；1. Fragment of Pro. BpUGDH；2-6. Deletion fragment of Pro.BpUGDH

利用2×Assembly Mix 同源重組XbaI酶切之后的線性化pORE R1載體和各個BpUGDH 基因啟動子5'端缺失片段，構(gòu)建重組載體pORE R1-PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS。對五個重組質(zhì)粒進行菌落PCR 驗證（如圖2A），同時用XhoI、SacI 酶雙酶切重組質(zhì)粒，分別得到1 035、527、417、343 和306 bp 的片段和pORE R1 載體片段（如圖2B），結(jié)果表明，Pro.BpUGDH 5'端缺失片段的表達載體已成功構(gòu)建。

2.3 Pro.BpUGDH 5'端缺失片段表達活性分析

為了研究Pro.BpUGDH 的各個缺失片段的表達活性，將含有5 個5'端缺失片段重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射煙草葉片瞬時表達。對煙草葉片GUS染色結(jié)果顯示：與Pro.BpUGDH（PB1）的染色結(jié)果相比，缺失-1 304～-281（PB5-IAA）和缺失-1 304～-244（PB6-GA）之間的區(qū)域，煙草葉圓片的染色略微變淺；缺失-1 304～-973（PB2-ETH）、缺失-1 304～-465（PB3-MeJA）和缺失-1 304～-355（PB4-低溫）之間的區(qū)域，煙草葉圓片的染色逐漸變淺，其中缺失-1 304～-355（PB4-低溫）區(qū)域的染色最淺（如圖3A）。煙草葉片GUS 染色的同時對其進行GUS 活性檢測，結(jié)果顯示：與Pro.BpUGDH（PB1）的GUS活性檢測結(jié)果相比，缺失片段PB5-IAA 和PB6-GA 的GUS活性無顯著差異；而缺失片段PB3-MeJA、PB2-ETH 和PB4-低溫的GUS 活性顯著下降，其中PB4-低溫的GUS 活性最低（如圖3B），與GUS 染色結(jié)果基本一致。

Pro.BpUGDH 5'端缺失片段在煙草葉片GUS活性趨勢為：先顯著下降（PB2-ETH、PB3-MeJA、PB4-低溫），最后PB5-IAA、PB6-GA 缺失區(qū)域均顯著上升。這些現(xiàn)象表明，在BpUGDH 基因啟動子-1 304～-244 區(qū)域不存在負調(diào)控元件，此區(qū)域間的ETH、MeJA、低溫、GA、IAA 等順式作用元件對調(diào)控Pro.BpUGDH 的活性可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

圖2 pORE R1-PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS重組載體鑒定A. pORE R1-PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS 重組載體菌落PCR 鑒定（M. 200 bp DNA Ladder；2～6：Pro. BpUGDH 缺失片段PB2-PB6；B.pORE R1-PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS重組載體雙酶切鑒定（M.200 bp DNA Ladder，1、3、5、7、9.pORE R1-PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS重組質(zhì)粒，2、4、6、8、10.pORE R1-PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物）Fig.2 pORE R1-PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS recombinant vector identificationA. Colony PCR identification of pORE R1-PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS recombinant vector（M. 200 bp DNA Ladder；2-6. Pro. BpUGDH deletion fragment PB2-PB6；B.Digestion identification of pORE R1-PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS recombinant vector（M.200 bp DNA Ladder；1，3，5，7，9.pORE R1-PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS recombination Plasmid；2，4，6，8，10.Digestion product of pORE R1-PB2/PB3/PB4/PB5/PB6：：GUS recombinant plasmid）

圖3 Pro.BpUGDH 5'端缺失片段在煙草葉片中的GUS活性分析A.Pro.BpUGDH 5'端缺失片段；B.Pro.BpUGDH 5'端缺失片段在煙草葉片中的GUS活性測定；C.Pro.BpUGDH 5'端缺失片段在煙草葉圓片的GUS染色，其中PB1是Pro.BpUGDH 片段 誤差線表示具有六種指標的三個獨立生物重復(fù)的標準偏差（SD）；不同的字母分別表示每組樣本間的顯著性差異（P＜0.05）Fig.3 Analysis of GUS activity of the 5'-end deletion fragment of Pro.BpUGDH in tobacco leavesA. Pro. BpUGDH 5'-end deletion fragment；B. Pro. BpUGDH 5'-end deletion fragment GUS activity determination in tobacco leaves；C. GUS staining of the 5'-end deletion fragment of the Pro. BpUGDH in tobacco leaf discs，PB1 is a fragment of Pro. BpUGDH Error bars represent the standard deviation（SD）of three independent biological replicates.Different letters indicate significant differences at P＜0.05

2.4 亞細胞定位分析

2.4.1 亞細胞定位預(yù)測

Target P 預(yù)測結(jié)果顯示，BpUGDH 蛋白的線粒體靶向肽（mTP）的分值為0.077，其他部位前導(dǎo)肽（other）分值為0.390，葉綠體轉(zhuǎn)運肽（cTP）分值為0.031，分泌通道信號肽（SP）分值為最高，因此推測BpUGDH 蛋白是分泌蛋白，定位于（S）分泌途徑中。Cell-PLoc 2.0 對BpUGDH 蛋白亞細胞定位進行預(yù)測，顯示其定位于葉綠體中。

一個基因的功能及其所參與的代謝途徑，很大程度上和該基因編碼的蛋白在細胞器中的所處位置有關(guān)。本研究為了證實其在細胞中的具體表達位置，利用DNA 重組技術(shù)構(gòu)建BpUGDH 與GFP基因融合，構(gòu)建35S：：BpUGDH-GFP 表達載體，進一步進行煙草葉片的瞬時轉(zhuǎn)化，觀察了35S：：BpUGDH-GFP在煙草葉片表皮細胞中的表達。

2.4.2 表達載體pCAMBIA1300-35S-BpUGDHGFP的鑒定

圖4 pCAMBIA1300-35S-BpUGDH-GFP載體的構(gòu)建A. 重組載體pCAMBIA1300-35S-BpUGDH-GFP 菌落PCR 鑒定；B. 重組載體pCAMBIA1300-35S-BpUGDH-GFP 雙酶切鑒定（M.200 bp DNA Ladder）Fig.4 Construction of pCAMBIA1300-35S-BpUGDHGFP vectorA. Colony PCR identification of recombinant vector pCAMBIA1300-35S-BpUGDH-GFP；B. Digestion identification of recombinant vector pCAMBIA1300-35S-BpUGDH-GFP（M.200 bp DNA Ladder）

圖5 BpUGDH-GFP融合蛋白的亞細胞定位A.GFP綠色熒光；B. 葉綠素自發(fā)熒光；C. 疊加后的結(jié)果Fig.5 Subcellular localization of BpUGDH-GFPA.GFP green fluorescence；B.ChloroPhyll autofluorescence；C.Overlapping

利用添加了酶切位點（kpnI 和XbaI）的特異性引物，PCR 擴增獲得1 440 bp 的BpUGDH 的ORF序列。將PCR 擴增產(chǎn)物回收，連接pEASY?-Tl 載體、轉(zhuǎn)化Transl-Tl，并對菌落PCR 進行鑒定正確的重組質(zhì)粒pEASY?-Tl-BpUGDH 和載體pCAMBIA1300-35S-GFP 用限制性內(nèi)切酶QuickCut kpnI和XbaI 進行雙酶切、連接，使BpUGDH 處于35S 啟動子及GFP 蛋白之間，構(gòu)建pCAMBIA1300-35SBpUGDH-GFP 載體。對重組質(zhì)粒進行菌落PCR 驗證（見圖4A），同時雙酶切重組質(zhì)粒，獲得1 400 bp的目的片段和pCAMBIA1300-35S-GFP 載體片段（見圖4B）。對于檢測都顯示正確的重組質(zhì)粒送測序，證實了，BpUGDH 基因己正確的插入到pCAMBIA1300-35S-GFP載體，而且無移碼突變。

2.4.3 BpUGDH蛋白定位于葉綠體

通過對農(nóng)桿菌浸染4d 的煙草葉片下表皮進行熒光檢測，發(fā)現(xiàn)GFP綠色熒光在葉綠體中分布，且與葉綠素自發(fā)熒光重疊（見圖5），說明BpUGDH-GFP融合蛋白表達在葉綠體中，與預(yù)測結(jié)果相一致。

3 討論

3.1 BpUGDH基因啟動子的功能缺失分析

UGDH 是半纖維素和果膠生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化UDP-Glc 生成多糖合成過程中的關(guān)鍵前體物質(zhì)，參與多種糖代謝過程。UGDH 的幾種同種型（isoforms）通常存在于植物中，并且每種同種型在植物發(fā)育期間表現(xiàn)出不同的表達模式，如擬南芥［23］、甘薯（Ipomoea batatas）［27］、興安落葉松［19，28］等。在我們之前的研究中，在雜交構(gòu)樹的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了5 個UGDH 轉(zhuǎn)錄物。有關(guān)UGDH 基因的研究目前主要集中在克隆、表達及少數(shù)的功能分析方面，關(guān)于UGDH 基因啟動子的克隆及其功能、順式作用元件的活性分析報道尚少。啟動子的5'端缺失分析是研究分析啟動子表達特性及其調(diào)控元件功能的最常用方法之一［29］。本研究中以BpUGDH 基因啟動子作用元件在線預(yù)測結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)常見的順式作用元件及低溫響應(yīng)元件位置，構(gòu)建了5 個缺失載體并同時在煙草葉片中瞬時表達。對煙草葉圓片GUS組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)5 個含有不同作用元件的缺失載體均可激活GUS 基因的表達且表達強度有所差異，與5 個缺失片段相比BpUGDH 全長啟動子片段表達最強，并且5 個缺失片段中PB5-IAA 和PB6-GA 的GUS 染色與全長啟動子的相當，而PB2-ETH、PB3-MeJA 和PB4-低溫均較弱（見圖3C）。對各個缺失片段進一步GUS 含量測定，將會更好的比較分析各個順式作用元件的GUS 活性［30］，因此本研究下一階段對瞬時表達的煙草葉片進行GUS 含量測定，發(fā)現(xiàn)BpUGDH 全長啟動子片段GUS含量最高，其他5 個缺失片段的GUS 活性均較低，其中PB2-ETH、PB3-MeJA、PB4-低溫缺失片段的GUS 活性顯著降低（見圖3B），與GUS 染色結(jié)果基本一致。此結(jié)果進一步證明BpUGDH 基因啟動子的-973、-465、-355、-281 和-244 bp 的區(qū)域均可能對調(diào)控其活性發(fā)揮著重要的作用，并且BpUGDH 基因啟動子所缺失的各個順式作用元件不能使其失去活性。基因表達調(diào)控是多層次的、復(fù)雜的過程?；騿幼由系捻樖阶饔迷c對應(yīng)于該元件的轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，精確的調(diào)控著下游基因的轉(zhuǎn)錄，并且啟動子不同順式作用元件有著不同的啟動轉(zhuǎn)錄的能力，因此，致使下游基因蛋白的表達產(chǎn)生差異。例如：Xue［31］的研究顯示，HvCBF1轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合LTRE1（CCGAAA）、LTRE15（CCGAC）順式作用元件來調(diào)控大麥的冷應(yīng)答基因。Feng［32］等從蘋果（Malus×domestica）中分離鑒定的低溫響應(yīng)的MdCIbHLH1 基因能夠特異的結(jié)合到擬南芥（Arabidopsis）CBFs 啟動子的MYC 識別位點，并且激活其表達。本研究中的這些順式作用元件是否促進或者抑制BpUGDH 基因的轉(zhuǎn)錄效果以及作用順式作用元件之間相互的關(guān)系、各個響應(yīng)元件如何調(diào)控BpUGDH 基因啟動子的活性等還需要進一步的深入研究。

附圖1 BpUGDH基因啟動子序列和順式作用元件A 代表轉(zhuǎn)錄起始位點，ATG 表示起始密碼子。重要的順式作用元件用不同顏色的方框表示，其中ERE 是乙烯響應(yīng)元件；GARE-motif 是赤霉素響應(yīng)元件；TGA-element是參與生長素的順式反應(yīng)元件；CGTCA-motif是水楊酸響應(yīng)元件；LTR是參與低溫反應(yīng)的順式作用元件。Attached fig.1 The sequences of BpUGDH promoter and cis-elementsA represents the transcriptional start site，ATG represents the starting codon. Important cis-acting elements are represented by boxes of different colors，where ERE is an ethylene-responsive element；GARE-motif is a gibberellin-responsive element；TGA-element is an auxin-responsive element；CGTCA-motif is a cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness；LTR is a cis-acting element involved in low-temperature responsiveness.

3.2 雜交構(gòu)樹BpUGDH位于葉綠體

利用GFP 融合報告基因融合目的基因進行蛋白質(zhì)的亞細胞定位是為了定位此蛋白質(zhì)在細胞中表達的具體位置，從而推測其功能及所參與的代謝途徑［33］。綠色熒光蛋白GFP 靈敏度高、對活細胞無毒害作用而且能在目的蛋白質(zhì)的N 端（C 端）融合，保持其天然蛋白的特性，從而被眾多研究者廣泛應(yīng)用［28，34～36］。目前，UGDH 的亞細胞定位相關(guān)的研究并不多見。利用在線軟件Target P 預(yù)測興安落葉松UGDH 基因，猜測其定位在細胞質(zhì)中［37］。本研究中，我們同樣利用Target P 預(yù)測顯示，BpUGDH 定位于分泌途徑中，但RC值為4，預(yù)測可信度偏低。正因為如此，我們再尋找一個最近備受歡迎的在線軟件Cell-PLoc 2.0 再次對BpUGDH蛋白亞細胞定位進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其定位于葉綠體中。本研究為了證實BpUGDH 在細胞中的具體表達位置，構(gòu)建35S 驅(qū)動的BpUGDH 與GFP 融合基因表達載體，進一步進行煙草葉片的瞬時轉(zhuǎn)化，觀察到了35S：：BpUGDH-GFP 在煙草葉片表皮細胞的葉綠體中表達。葉綠體是植物進行光合作用的重要場所，是光合作用所需酶類主要的存在部位［33］，說明雜交構(gòu)樹UGDH 可能在細胞繁衍過程中提供所必需的能量物質(zhì)［38］。BpUGDH 基因編碼蛋白的亞細胞定位研究為今后深入分析該基因功能、篩選其合作蛋白以及了解BpUGDH 基因奠定了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

（1）將不同長度的BpUGDH 啟動子5'端缺失片段與GUS基因連接，進行表達活性分析，結(jié)果顯示BpUGDH 啟動子的5'端缺失-1 304～-973、-1 304～-465、-1 304～-355、-1 304～-281 和-1 304～-244 bp 均不能使Pro.BpUGDH 失去活性，并且-973、-465、-355、-281、-244 bp 的 區(qū) 域 可 能 對BpUGDH 基因啟動子的活性發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

（2）利用DNA 重組技術(shù)將BpUGDH 與GFP 融合，構(gòu)建pCAMBIA 1300-35S：：BpUGDH-GFP 表達載體，并觀察了35S：：BpUGDH-GFP 在煙草葉片表皮細胞中的表達。結(jié)果顯示35S：：BpUGDHGFP 的綠色熒光在葉綠體中分布，并且與葉綠素的自發(fā)熒光重疊，說明BpUGDH 蛋白表達在葉綠體中。

致謝感謝內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林曉飛老師實驗室提供交流學(xué)習的實踐平臺。