付 濤 王志龍* 林樂靜 林 立 李 文 袁冬明

（1. 寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院/浙江園林綠化技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，寧波 315100；2. 寧波市鄞州區(qū)林業(yè)技術(shù)管理服務(wù)站，寧波 315100）

櫻花為櫻屬（Cerasus）植物栽培品種的統(tǒng)稱，經(jīng)過幾百年的培育，已有幾百個(gè)品種，目前國內(nèi)主栽的櫻花大多數(shù)是日本品種，很多景區(qū)、公園、學(xué)校、街道甚至是家庭都有日本櫻花的種植，最常見的有染井吉野櫻（俗稱早櫻）和關(guān)山櫻（俗稱晚櫻），然而，有許多品種親本來源不明、種系定位不一、命名不規(guī)范等諸多問題，不利于櫻花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［1～3］。我國擁有豐富的野生資源，遠(yuǎn)超日本和朝鮮等國家［4］，然而我國重視食用櫻桃的栽培，對(duì)具有觀賞性的櫻屬植物關(guān)注甚少，育成品種更少，但近幾年國內(nèi)“櫻花熱”持續(xù)升溫，對(duì)自主櫻花品種的培育也在如火如荼地進(jìn)行中，依托我國豐富的野生資源（我國約50 種櫻屬植物），不久的將來，將會(huì)擁有一大批具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的櫻花新品種，逐漸將日本品種替換成我國自主栽培櫻花品種［5］。

日本人Kawasaki 將日本櫻花分為7 個(gè)群，得到了國際社會(huì)的一致認(rèn)可，但對(duì)于雜交或來源不明的品種分類和鑒定有一定的局限性［6～7］。國內(nèi)南京林業(yè)大學(xué)王賢榮團(tuán)隊(duì)提出了櫻花品種分類的五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，但該標(biāo)準(zhǔn)易受生長環(huán)境、栽培管理、砧木選擇等因素的影響，其應(yīng)用也受到一定的影響［8］。因此，單純依靠形態(tài)分類很難將所有品種正確分類，需要借助分子手段加以輔助鑒定。目前，DNA 條形碼廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的分類鑒定研究［9～17］，并取得了很好的結(jié)果，其中核DNA 序列ITS 和葉綠體DNA 序列rbcL、matK 以及psbA-trnH應(yīng)用比較多，但rbcL 和matK 為葉綠體功能基因，序列變異較小，因此主要應(yīng)用于屬及以上水平的分類鑒定研究，而ITS 和psbA-trnH 主要由非功能基因構(gòu)成，序列變異相對(duì)較大，因此可應(yīng)用于種及種以水平的分類鑒定研究［18-19］。本研究利用ITS和psbA-trnH 對(duì)國內(nèi)引進(jìn)的櫻花品種進(jìn)行測序分析，探究彼此間的分子差異，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，旨在為日本櫻花的分類和種系定位以及糾正形態(tài)學(xué)分類的不足甚至錯(cuò)誤提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016～2017年從寧波、武漢和上海等地采集了88個(gè)櫻花品種樣品，采集不同品種櫻花的健康、無病害的幼葉，硅膠處理，4℃保存，詳細(xì)樣品信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Samples information and source of the 88 cherry blossoms

續(xù)表1Continued table 1

續(xù)表1Continued table 1

1.2 方法

利用試劑盒（上海萊楓生物科技有限公司）進(jìn)行88個(gè)樣品的總DNA提取，提取的DNA稀釋后放入冰箱-20℃保存、備用。

選用核基因ITS和葉綠體基因trnH-psbA 進(jìn)行DNA條形碼分析，2個(gè)DNA片段引物序列詳見表2。PCR 反應(yīng)體系為50μL，其中含預(yù)混合液25μL，模板DNA 1μL，引物對(duì)4μL，最后補(bǔ)加ddH2O 20μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55或58℃退火30 s（ITS 為58℃；trnH-psbA 為55℃），72℃延伸1 min，45個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。擴(kuò)增完成后直接取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行點(diǎn)樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（1.5%），驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果，之后將有目標(biāo)條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到測序公司進(jìn)行測序。

表2 DNA條形碼引物名稱及其序列Table 2 Primer names and sequences of DNA barcoding

1.3 數(shù)據(jù)分析

在NCBI 中搜索有關(guān)櫻屬植物的ITS 和trnHpsbA 的全長，以此作為標(biāo)準(zhǔn)序列，再將測序得到的序列運(yùn)用DNAman 軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，以確認(rèn)測序的準(zhǔn)確性，然后對(duì)合格的序列進(jìn)行修剪，獲得完整的片段序列。利用MEGA 6.0 軟件計(jì)算出88 份材料的ITS 和trnH-psbA 各基因序列的組成、G+C 含量（%）等，此外還計(jì)算了各序列中的堿基的變異位點(diǎn)率和信息位點(diǎn)率以及轉(zhuǎn)換/顛換比率等，并通過2 000 次重復(fù)的bootstrap 值來確定每個(gè)分支的支持率，構(gòu)建鄰接樹（NJ），選擇K2-P 模型遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 88 個(gè)櫻花品種ITS 和trnH-psbA 序列特點(diǎn)分析

由表3可知，ITS序列長度在605～606 bp，變異很小，其中僅有寒緋櫻、才力櫻、大漁櫻、橫濱緋櫻和陽光櫻的ITS 序列長度為605 bp，其余品種ITS序列長度皆為606 bp。trnH-psbA序列長度在288～306 bp，其中內(nèi)里櫻trnH-psbA 序列長度為289 bp，江戶彼岸櫻、染井吉野櫻、小松乙女櫻、神代曙櫻、澳博拉大葉早櫻、咲耶姬櫻、御帝吉野櫻、陽春櫻、白花真櫻、赤實(shí)大島櫻、寒緋櫻和鵯櫻trnH-psbA序列長度為296 bp，陽光櫻trnH-psbA 序列長度為306 bp，其余品種trnH-psbA序列長度均為288 bp。

由表3 還可知，ITS 的G+C 平均百分含量較高（59.6.%），而trnH-psbA 的G+C 平均百分含量卻較低（21.8%）；ITS 和trnH-psbA 的保守位點(diǎn)百分含量相差不大（分別為94.6%和94.5%），而變異位點(diǎn)百分含量相差較大，其中ITS 為5.3%（簡約信息位點(diǎn)為3.3%，單突變位點(diǎn)為2.0%），而trnH-psbA 僅為2.0%（簡約信息位點(diǎn)為0.7%，單突變位點(diǎn)為1.3%），ITS 的簡約信息位點(diǎn)百分含量顯著高于trnH-psbA；ITS插入/缺失序列最少，僅為1個(gè)堿基，而trnH-psbA 高達(dá)19 個(gè)堿基；此外，ITS 轉(zhuǎn)換/顛換比率為0.7，而trnH-psbA卻為0。

2.2 88個(gè)櫻花品種變異位點(diǎn)分析

88 個(gè)櫻花品種通過ITS 序列比對(duì)得到32 個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)有20個(gè)，單突變位點(diǎn)有12 個(gè)。通過trnH-psbA 序列比對(duì)得到6 個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)有2 個(gè)，單突變位點(diǎn)有4個(gè)。由表4 可知，ITS 變異位點(diǎn)中有18 個(gè)是顛換，有14個(gè)是轉(zhuǎn)換，顛換要高于轉(zhuǎn)換，其中顛換中A 突變成C、C 突變?yōu)锳 和G 突變成T 出現(xiàn)頻率相對(duì)較高，轉(zhuǎn)換中G 突變成T 出現(xiàn)頻率較高。trnH-psbA 的6 個(gè)變異位點(diǎn)都是顛換，無轉(zhuǎn)換。由此說明88 個(gè)櫻花品種的ITS 的變異程度明顯高于trnH-psbA，ITS 的分辨率要明顯高于trnH-psbA，ITS可作為櫻花品種系統(tǒng)發(fā)育研究、品種鑒定等的核心條形碼，而trnH-psbA可作為輔助序列予以應(yīng)用。

2.3 88 個(gè)櫻花品種ITS 和trnH-psbA 插入/缺失序列分析

本研究共得到ITS 的排列位點(diǎn)607 個(gè)，在排列位點(diǎn)437 處，寒緋櫻含有1 個(gè)單堿基（G）的插入。trnH-psbA 有307 個(gè)排列位點(diǎn)，在41～58 排列位點(diǎn)處，陽光含有18 個(gè)堿基（CTTGTAAGTTTATCATTA）的插入；在51～58 排列位點(diǎn)處，澳博拉大葉早櫻、白花真櫻、赤實(shí)大島櫻、寒緋櫻、江戶彼岸櫻、染井吉野櫻、神代曙櫻、小松乙女櫻、咲耶姬櫻、鵯櫻、陽春櫻和御帝吉野櫻含有8 個(gè)堿基（TATCATTA）的插入，此外，在202 排列位點(diǎn)處，內(nèi)里櫻含有1個(gè)單堿基（A）的插入。

表3 序列堿基組成及變異率Table 3 Sequence base composition and mutation rate

表4 變異位點(diǎn)分析Table 4 Analysis of variable

圖1 基于ITS+trnH-psbA組合序列構(gòu)建88個(gè)櫻花品種的NJ樹Fig. 1 The NJ tree of the 88 cherry blossoms with the concatenated ITS+trnH-psbA sequencesT

2.4 88個(gè)櫻花品種的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用分析軟件MEGA 6.0 構(gòu)建了88 個(gè)櫻花品種的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖1），由圖1 可知，88 個(gè)櫻花品種可分為4 大類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ），其中第Ⅰ類有Ⅰa、Ⅰb 和Ⅰc 三小類，Ⅰa 包含市原虎尾櫻、朱雀櫻、雨宿櫻、伊豆櫻、一葉櫻、維多利富士櫻、太白櫻、手弱女櫻、十月紅櫻、三島富士櫻、嘉獎(jiǎng)櫻、紅玉錦櫻、八重紅大島櫻、阿麗亞娜富士櫻、澳博拉大葉早櫻、郁金櫻、內(nèi)里櫻、白雪櫻、紅豐櫻、雨晴枝垂櫻、駿河臺(tái)香櫻、十月櫻、松前紅緋衣櫻、奈良八重櫻和仙臺(tái)屋櫻，Ⅰb 包含白山2 號(hào)櫻和大島櫻，Ⅰc 包含白妙櫻、赤實(shí)大島櫻、大提燈櫻、花笠櫻、蘭蘭櫻、普賢象櫻、松月櫻、御車返櫻和御帝吉野櫻；第Ⅱ類有Ⅱa 和Ⅱb 兩小類，Ⅱa 含有梅護(hù)寺數(shù)珠掛櫻、旭山、朝日山櫻、山櫻枝垂櫻、福祿壽櫻、大村櫻、紅笠櫻和紅時(shí)雨櫻，Ⅱb 含有菊垂櫻、潘多拉櫻、冬櫻、關(guān)山櫻、弘前三段咲櫻、紅葉櫻、蝴蝶櫻、麒麟櫻、苔清水櫻和天川櫻；第Ⅲ類有御衣黃櫻、東錦櫻、紅華櫻、紅手毬櫻、日暮櫻和楊貴妃櫻；第Ⅳ類有Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc 和Ⅳd 4 小類，Ⅳa 含有江戶彼岸櫻、神代曙櫻、紅枝垂櫻、八重紅枝垂櫻、越之彼岸櫻、小彼岸櫻、鵯櫻、思川櫻、白花真櫻、陽春櫻、小松乙女櫻、染井吉野櫻和咲耶姬櫻，Ⅳb 含有才力櫻、河津櫻、兼六園菊櫻、千里香櫻、青肌櫻、修繕?biāo)潞畽押头劬奕藱?，Ⅳc含有寒櫻、高妙櫻和初美人櫻，Ⅳd含有大寒櫻、大漁櫻、橫濱緋櫻、陽光櫻、寒緋櫻和琉球寒緋櫻。

3 討論

對(duì)于確定的植物品種，一般均采用扦插［20～21］、嫁接［22～23］或組培［24～25］等無性繁殖進(jìn)行擴(kuò)大再生產(chǎn)，才能保持特定品種的穩(wěn)定性狀，其遺傳物質(zhì)完全不會(huì)改變（排除基因突變），因此，可以通過比較不同櫻花品種的基因差異用于品種鑒定。本研究中僅有寒緋櫻群里的寒緋櫻、才力櫻、大漁櫻、橫濱緋櫻和陽光櫻等5個(gè)品種的ITS序列長度為605 bp，其余83 個(gè)品種的ITS 序列長度均為606 bp，此外，trnH-psbA 序列為基因間隔區(qū)域，進(jìn)化選擇壓力較小，其長度變異較大，往往有大量插入/缺失片段，根據(jù)結(jié)果可知，陽光櫻的trnH-psbA 序列長度為306 bp，內(nèi)里櫻trnH-psbA 序列長度為289 bp，江戶彼岸群的江戶彼岸櫻、染井吉野櫻、小松乙女櫻、神代曙櫻、澳博拉大葉早櫻、咲耶姬櫻、御帝吉野櫻、陽春櫻和山櫻群的白花真櫻、赤實(shí)大島櫻、鵯櫻以及寒緋櫻群的寒緋櫻的trnH-psbA 序列長度為289 bp。因此，可依據(jù)DNA 片段長度多態(tài)性對(duì)部分品種進(jìn)行分子鑒定。

核基因ITS 包含ITS1、5.8S 和ITS2，其中ITS1和ITS2 為非編碼區(qū)，而基因非編碼區(qū)所承受的選擇壓力較小，因此，ITS 突變位點(diǎn)（簡約信息位點(diǎn)和單突變位點(diǎn)）多位于ITS1 和ITS2［26］。葉綠體DNA呈單親遺傳（母系遺傳），不存在像核基因那樣的基因重組，編碼基因往往非常保守，但像trnH-psbA等基因間隔序列變異較大，但變異率往往要遠(yuǎn)低于核基因［27］。本研究ITS 變異位點(diǎn)百分率（5.3%）遠(yuǎn)高于trnH-psbA（2.0%），因此ITS 在櫻屬植物種或種下水平的鑒定率顯著高于trnH-psbA，ITS可作為核心條形碼序列用于系統(tǒng)發(fā)育研究，trnH-psbA可作為輔助序列予以應(yīng)用。此外，插入/缺失現(xiàn)象在葉綠體基因非編碼區(qū)較常出現(xiàn)，如陽光櫻有18個(gè)堿基（CTTGTAAGTTTATCATTA）的插入，江戶彼岸群的大多數(shù)品種都有8 個(gè)堿基（TATCATTA）的插入，根據(jù)這些特定序列長度也可用于品種的分子鑒定。

本研究88 個(gè)品種均引自于日本，而日本的櫻花品種其原始親本均來自9 個(gè)野生種［山櫻（Cerasus serrulata）、大山櫻（Cerasus sargentii）、霞櫻（Cerasus verecunda）、江戶彼岸（Cerasus subhirtella）、豆櫻（Cerasus incisa）、大島櫻（Cerasus speciosa）、高嶺櫻（Cerasus nipponica）、深山櫻（Cerasus maximowiczii）和丁字櫻（Cerasus apetala）］以及2 個(gè)栽培種［寒緋櫻（Cerasus campanulata）和櫻桃（Cerasus pseudocerasus）］，尤其是日本晚櫻大多是反復(fù)雜交所得，其遺傳背景比較復(fù)雜，很多日本晚櫻品種親本不詳［7］。日本人Kawasaki 在本田正次和林彌榮［28］分類標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)之上，按種系將日本櫻花品種分為7 個(gè)群，即山櫻群、江戶彼岸群、寒緋櫻群、豆櫻群、丁字櫻群、櫻桃群、深山櫻群。本研究有54個(gè)品種屬于山櫻群，有18個(gè)品種屬于江戶彼岸群，有12 個(gè)品種屬于寒緋櫻群，有4 個(gè)屬于豆櫻群，依據(jù)ITS+trnH-psbA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ主要是山櫻群的櫻花品種，Ⅳ主要是江戶彼岸群和寒緋櫻群的櫻花品種，而豆櫻群的品種不構(gòu)成單系，與山櫻群混合在一起。因此，利用ITS+trnH-psbA可以較好地將不同品種的櫻花品種合理歸類，作為形態(tài)分類的輔助手段。

大島櫻為日本原生種，因其花最大，花量最多，且花朵帶有香味，被廣泛喜愛，培育出的園藝品種也最多（包括變異品種和雜交品種）［1］，我國所說的日本晚櫻其實(shí)指的就是具有大島櫻血統(tǒng)的櫻花雜交品種，因此，日本晚櫻中的雜交品種拉丁文本應(yīng)為Cerasus speciosa，但國內(nèi)習(xí)慣將日本晚櫻花拉丁文描述為Cerasus serrulata，因此本文對(duì)日本晚櫻中的雜交品種采用了后一種描述。山櫻群的櫻花品種比較復(fù)雜，其絕大多數(shù)品種原始親本是大島櫻、山櫻、大山櫻和霞櫻，然后通過彼此間反復(fù)雜交形成了今天諸多的山櫻群櫻花品種，從系統(tǒng)發(fā)育樹可知，它們彼此間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較混亂，無規(guī)律可循。在第Ⅰ類的Ⅰa 中包含3 個(gè)豆櫻（變異）品種，說明ITS+trnH-psbA 組合序列對(duì)豆櫻、山櫻（紅山櫻）和大島櫻的分辨率較低，而冬櫻為雜交品種，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與豆櫻變異品種相差較大。江戶彼岸群大部分品種能夠單獨(dú)構(gòu)成一系，但其中有部分雜交品種混入到山櫻群，如十月紅櫻、嘉獎(jiǎng)櫻、澳博拉大葉早櫻、雨晴枝垂櫻、十月櫻、御帝吉野櫻和潘多拉櫻，因此，這些雜交品種遺傳物質(zhì)更多受到山櫻、大山櫻、大島櫻、霞櫻和豆櫻的影響，這7個(gè)江戶彼岸群雜交品種分類地位有待進(jìn)一步確認(rèn)，此外，江戶彼岸群還混有白花真櫻和鵯櫻，這2 個(gè)品種可能具有江戶彼岸櫻的血統(tǒng)。寒緋櫻群的12 個(gè)品種全部單獨(dú)構(gòu)成一系，但其中混有青肌櫻、千里香、兼六園菊櫻和高砂櫻，其中青肌櫻為我國原生種（山櫻），與寒緋櫻關(guān)系較近，其余兼六園菊櫻和高砂櫻均是花色淡紅的重瓣櫻花，推測均具有寒緋櫻血統(tǒng)，而千里香花色潔白又與青肌櫻較近，且香氣濃郁，推測其是大島櫻或其品種與寒緋櫻品種的雜交品種。本研究中系統(tǒng)不確定的白山2號(hào)與大島櫻關(guān)系最近，可將其歸類為大島櫻影響的日本晚櫻，其拉丁名可更改為Cerasus serrulata‘Hakusan-nigo’，弘前三段咲櫻拉丁名可更改為Cerasus serrulata‘Hirosaki-sandanzaki’，陽春櫻拉丁名可更改為Cerasus subhirtella‘Yoshun’，粉巨人櫻拉丁名可更改為Cerasus campanulata‘Pin giant’，而潘多拉櫻與山櫻群混在一起，因此建議將其拉丁名更改為Cerasus serrulata‘Pandora’。白雪櫻一般認(rèn)為是江戶彼岸櫻反復(fù)雜交所得，這與本團(tuán)隊(duì)前期利用ISSR 分子標(biāo)記法所得結(jié)果一致，但本研究結(jié)果與前期研究結(jié)果有所出入，表明利用ITS 和trnH-psbA 兩個(gè)條形碼序列不能將白雪正確分類，做出了錯(cuò)誤的結(jié)論，也可能是白雪櫻遺傳背景比較復(fù)雜，也表明DNA 條形碼用于物種系統(tǒng)發(fā)育有其不足和缺陷。

ITS 和trnH-psbA 可用于種以及以上水平的系統(tǒng)發(fā)育研究，可以取得較好結(jié)果，但對(duì)于種下水平結(jié)果往往不理想［29］。本研究結(jié)果表明，山櫻群中的各系櫻花品種彼此混亂的聚合在一起，尤其是各類的日本晚櫻，除了山櫻群大部分品種遺傳背景比較復(fù)雜以外，還可能是因?yàn)樯綑讶旱母飨灯贩N其原始親本系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系本就很近造成的，這也是雜交育種的基礎(chǔ)，因此，我們推測日本的山櫻、大山櫻、大島櫻、霞櫻、豆櫻等原種為近期分化出的物種，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近，并未完全出現(xiàn)生殖隔離。但很多江戶彼岸群和寒緋櫻群的櫻花品種很多也是與山櫻、大山櫻、大島櫻、霞櫻、豆櫻等雜交所得，但能夠與山櫻群品種彼此分離，由此可知，江戶彼岸櫻和寒緋櫻與山櫻、大山櫻、大島櫻、霞櫻、豆櫻系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，但日本櫻屬植物原種彼此間都能夠雜交形成可育后代，嚴(yán)格來說都可并為一個(gè)種，但形態(tài)分類專家依據(jù)其形態(tài)差異分為了不同種，櫻屬植物是個(gè)比較年輕的屬，屬間物種大多可以彼此雜交，根據(jù)種的定義，嚴(yán)格而言都是亞種。

4 結(jié)論

本研究利用ITS和trnH-psbA對(duì)88個(gè)櫻花品種進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究，結(jié)果表明，山櫻群櫻花品種系統(tǒng)發(fā)育比較混亂，這與其遺傳背景比較復(fù)雜以及原始親本系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近有關(guān)，江戶彼岸群和寒緋櫻群的大多數(shù)櫻花品種能夠聚類在一起，與山櫻群品種能分得開，但涉及到很多雜交品種，ITS 和trnH-psbA 難以區(qū)分，表明DNA 條形碼技術(shù)難以應(yīng)用到雜交品種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，因此，對(duì)于櫻花的雜交品種可采用SSR、ISSR 等分子標(biāo)記技術(shù)，探討彼此間親緣關(guān)系。本研究結(jié)果可作為櫻花品種分類、嫁接繁殖、系統(tǒng)發(fā)育等研究的參考依據(jù)。