輔酶Q10/兩親性木聚糖納米懸浮劑的制備以及生物利用度

張曉雪 趙修華 劉艷杰 王玲玲 張 茜

（東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

據(jù)統(tǒng)計表明，在美國藥典中有30%以上的藥物為難溶性藥物；在NCE（New chemical entities）研究中，有一半以上由于溶解度小而不能達(dá)到效果［1］。另一方面，藥物的吸收與釋放也存在較大問題。其中口服給藥是目前比較常用、易被患者接受的一種給藥體系［2］。因此如何增加這類藥物的溶解度以及提高其口服生物利用度成為當(dāng)前面臨的巨大挑戰(zhàn)。在過去的幾十年里，關(guān)于輔酶Q10（CoQ10）開發(fā)其相關(guān)劑型來有效地提高藥物的溶解度、穩(wěn)定性和通透性，從而提高藥物的口服生物利用度成為人們的研究熱點。固體分散體、環(huán)糊精包合物、微囊脂質(zhì)體或納米懸浮劑作為口服給藥系統(tǒng)被越來越多地進(jìn)行研究［3］，其中納米混懸劑可有效改善難溶藥物的穩(wěn)定性以及提高難溶性藥物的生物利用度。納米混懸劑制備工藝簡單，可以通過介質(zhì)研磨、高壓均質(zhì)和超臨界流體等技術(shù)用于制備，亦可以通過多種途徑進(jìn)行遞送。納米混懸劑能夠增強藥物的分散性和穩(wěn)定性，可以通過減小粒徑，增加其表面積進(jìn)而增加其溶解度［4］。CoQ10 是一種脂溶性醌類化合物，對心血管疾病和肝臟疾病有良好的輔助作用，近期研究發(fā)現(xiàn)，CoQ10 是人體細(xì)胞中重要的生化輔酶之一，具有抗氧化和清除自由基、維持細(xì)胞膜的通透性、抗腫瘤以及提高人體免疫功能等作用。但由于CoQ10相對分子量大，水溶性差，生物利用度低，限制了其良好的體內(nèi)生物活性。且CoQ10 穩(wěn)定性差，口服生物利用度低而導(dǎo)致其功效的發(fā)揮受到局限［5～7］。本文通過高壓均質(zhì)法制備CoQ10納米懸浮劑，制備并優(yōu)化CoQ10 納米懸浮劑能明顯增加難溶性藥物的溶出速率，并顯著提高CoQ10 的口服生物利用度，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

木聚糖（xylan，來自于玉米芯，阿拉丁試劑有限公司），二水槲皮素（Quercetin dihydrate，≥97%，阿拉丁試劑有限公司），二甲亞砜（DMSO，≥98%），輔酶Q10（CoQ10，≥99%），丁二酸酐（Succinic anhydride，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸（EDC·HCl，≥98%，麥克林試劑有限公司），DMAP（4-甲氨基吡啶，≥99%，阿拉丁試劑有限公司），N-羥基丁二酰亞胺（NHS，≥98%），芘（≥98%），肝素鈉（麥克林試劑有限公司），玻璃毛細(xì)管（北京友誠生物科技有限公司），甲醇為色譜級純（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），實驗所用水均為去離子水。

1.2 儀器

激光粒度儀（LLS，美國布魯克海文）；HPLC色譜儀（日本島津公司）；FSH2A 可調(diào)剪切式高速勻漿機(jī)（常州市國旺儀器制造有限公司）；F-7000 FL220-240V 熒光分光光度計；Scientz18N 型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；傅立葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）。

1.3 QT-Xylan共聚物的合成與表征

1.3.1 QT-Xylan共聚物的合成方法

通過水溶性的木聚糖與槲皮素的碳二亞胺反應(yīng)，制備了槲皮素-木聚糖偶聯(lián)物。簡而言之，就是在5 mL DMSO 中加入丁二酸酐（琥珀酸酐∶QT=1.3∶1.0，摩爾比）。反應(yīng)混合物在40℃下攪拌過夜。然后將EDC·HCl 和NHS（EDC∶NHS=1∶1，按摩爾比）在1 mL DMSO 中加入到室溫下的攪拌溶液中。30 min 后，將100 mg 木聚糖加入到反應(yīng)溶液中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?4 h。然后通過反溶劑沉淀法在混合物中加入乙醇，5 000 r·min-1離心10 min 將所得沉淀經(jīng)凍干得到槲皮素—木聚糖偶聯(lián)物［8］。

1.3.2 紅外光譜的結(jié)構(gòu)鑒定與檢測（FT-IR）

采用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，F(xiàn)ourier transform infrared spectrometer），以空白溴化鉀做為背景，采用壓片法將Xylan、QT-Xylan 共聚物凍干粉以及Xylan 與QT 的物理混合三個樣品分別掃描FT-IR圖譜，即稱取2 mg樣品分別與200 mg KBr混合壓片，研磨混勻，移置壓模。分辨率為2.0 cm-1，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.3 核磁共振的結(jié)構(gòu)鑒定與檢測（1H NMR）

利用核磁共振光譜儀測定聚合物氫譜，以重水為檢測核磁的溶劑，對所合成聚合物載體和xylan分別進(jìn)行測試。

1.4 單因素優(yōu)化納米懸浮劑的制備工藝

高剪切均質(zhì)機(jī)工作的主要原理是利用髙壓泵將物料輸送到均質(zhì)閥中，物料瞬間失去壓力并以極高的流速被噴出，之后碰撞到碰撞環(huán)上，最終得到納米混懸劑［9］。以平均粒徑為指標(biāo)［10］，分別對均質(zhì)循環(huán)次數(shù)、均質(zhì)循環(huán)壓力、共聚物濃度、共聚物與CoQ10的質(zhì)量比4個因素進(jìn)行優(yōu)化考察。

1.4.1 循環(huán)次數(shù)

精密稱取共聚物QT-Xylan 凍干粉50 mg 將其加入在50 mL 蒸餾水中充分溶解，隨后加入50 mg CoQ10，此時凍干粉與原藥的質(zhì)量比為1∶1。首先使用可調(diào)高速勻漿機(jī)勻漿2 min 使CoQ10 原藥與QT-Xylan 偶聯(lián)物充分于水中分散，形成粗混懸劑，再將制備好的粗混懸劑加入到均質(zhì)機(jī)中，在均質(zhì)壓力500 bar 下，分別循環(huán)1、3、5、7、9、11 和13 次，得到CoQ10 納米懸浮劑。并在相同的條件下進(jìn)行3次重復(fù)實驗，用激光粒度儀測定所得的CoQ10納米懸浮劑的粒徑，取3 次平均值，最終得到平均粒徑。

1.4.2 循環(huán)壓力

精密稱取共聚物QT-Xylan 凍干粉50 mg 將其加入在50 mL 蒸餾水中充分溶解，隨后加入50 mg的CoQ10，此時凍干粉與原藥的質(zhì)量比為1∶1。首先使用可調(diào)高速勻漿機(jī)勻漿2 min 使CoQ10 原藥與QT-Xylan 偶聯(lián)物充分于水中分散，形成粗混懸劑，再將制備好的粗混懸劑加入到均質(zhì)機(jī)中，在均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為7 次時，設(shè)置均質(zhì)壓力分別為200、300、400、500、600、700和800 bar，得到CoQ10納米懸浮劑。并在相同的條件下進(jìn)行3次重復(fù)實驗，用激光粒度儀測定所得的CoQ10 納米懸浮劑的粒徑，取3次平均值，最終得到平均粒徑。

1.4.3 共聚物濃度

精密稱取共聚物在蒸餾水中充分溶解，將其濃 度 分 別 配 制 成0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 及3.0 mg·mL-1，此時凍干粉與原藥的質(zhì)量比均為1∶1。首先使用可調(diào)高速勻漿機(jī)勻漿2 min 使CoQ10 原藥與QT-Xylan 偶聯(lián)物充分于水中分散，形成粗混懸劑，再將制備好的粗混懸劑加入到均質(zhì)機(jī)中，在均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為7次時，均質(zhì)壓力為500 bar時，得到CoQ10 納米懸浮劑。并在相同的條件下進(jìn)行3次重復(fù)實驗，用激光粒度儀測定所得的CoQ10 納米懸浮劑的粒徑，取3 次平均值，最終得到平均粒徑。

1.4.4 共聚物與CoQ10的質(zhì)量比

精密稱取共聚物QT-Xylan 凍干粉50 mg 于50 mL蒸餾水中充分溶解，之后分別加入與共聚物質(zhì)量比為1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1 和4∶1 的CoQ10原藥。首先使用可調(diào)高速勻漿機(jī)勻漿2 min使CoQ10 原藥與QT-Xylan 偶聯(lián)物充分于水中分散，形成粗混懸劑，再將制備好的粗混懸劑加入到均質(zhì)機(jī)中，在均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為7 次時，均質(zhì)壓力為500 bar 時，得到CoQ10 納米懸浮劑。并在相同的條件下進(jìn)行3次重復(fù)實驗，用激光粒度儀測定所得的CoQ10 納米懸浮劑的粒徑，取3 次平均值，最終得到平均粒徑。

1.5 體外釋放

1.5.1 人工胃液的制備

取5 mL 濃鹽酸（37%）加水稀釋，定容至1 L。調(diào)節(jié)pH至1.2，使用前用0.22μm的濾膜過濾。

1.5.2 人工腸液的制備

稱取磷酸二氫鉀6.805 g，加入500 mL 的超純水中，超聲使其溶解完全。稱量0.5 g 氫氧化鈉到100 mL 的超純水中，使其完全溶解，即5 mg·mL-1的氫氧化鈉溶液。調(diào)節(jié)pH 至6.8，加水定容至1 L，使用前用0.22μm的濾膜過濾。

1.5.3 體外溶出檢測

由于輔酶Q10 的胃腸液中的飽和溶解度僅為0.157 和0.188 μg·mL-1，在實驗中無法精準(zhǔn)稱量，因此均過量投入介質(zhì)，將制備出的納米懸浮劑凍干粉（10 mg）、CoQ10原藥（5 mg）和物理混合藥（原藥5 mg、共聚物載體5 mg），分別放入900 mL 人工胃和人工腸液中，置于恒溫攪拌器內(nèi)，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，在37℃恒溫下釋放。分別在5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 和48 h 的時間點取樣5 mL，取樣后同時補回5 mL 的人工胃液和人工腸液介質(zhì)。樣品經(jīng)離心后取上清液，用0.22 μm 的濾膜過濾后，用高效液相色譜儀檢測CoQ10的含量。

1.6 生物利用度檢測

1.6.1 CoQ10的高效液相色譜檢測

CoQ10 液 相 色 譜 柱 反 相C18 柱（250 mm×4.6 mm，5μmol·L-1），柱溫為25℃。流動相為甲醇和乙醇，體積比為10∶90，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為275 nm，進(jìn)樣量為20 μL。稱取10 mg CoQ10溶于50 mL純甲醇配成0.2 mg·mL-1的母液，稀釋母液濃度，配成標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測不同濃度下峰面積，根據(jù)檢測血樣的峰面積計算出血樣中所含CoQ10的濃度。

1.6.2 大鼠取血

SD 大鼠10 只（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物中心，清潔Ⅱ級），體重200±50 g，喂食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～25℃，濕度保持在45%～70%。挑選9 只大鼠，隨機(jī)分成3組，每組3 只，采取灌胃方式給藥，CoQ10 濃度為50 mg·kg-1。在灌胃前12 h 開始禁食，保證飲水充足，第二天同時灌胃給藥CoQ10 原粉、納米懸浮劑凍干粉、物理混合藥3 種藥物，在0.083、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 和24.0 h 時從大鼠的眼眶靜脈處取血，滴入裝有20μL 1%肝素鈉的離心管中，均勻混合，5 000 r·min-1的條件下離心10 min，取出上清血漿，放入冰箱4℃保存，當(dāng)天處理。

1.6.3 血樣處理與測定

精確吸取血清100μL 于1.5 mL 離心管中，加入2 倍體積正丙醇200μL，渦旋2 min，再加入2 倍體積正己烷200 μL，再次渦旋2 min，離心（10 000 r·min-1）5 min，取上清用氮氣吹干。殘渣用100μL流動相（甲醇∶乙醇）復(fù)溶，渦旋3 min，10 000 r·min-1條件下離心5 min，取上清用0.22 μmol·L-1的濾膜過濾后，吸取20μL 經(jīng)高效液相色譜儀檢測，測定CoQ10 濃度。并以大鼠空白血漿中混合不同濃度的CoQ10 標(biāo)準(zhǔn)溶液（理論濃度為100，50，25，20，10，5，1，0.5，0.1 ng·mL-1）得到的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，研究該方法的選擇性、線性、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 QT-Xylan共聚物的表征

2.1.1 紅外光譜的結(jié)構(gòu)鑒定與檢測（FT-IR）

首先合成QT-單琥珀酸鹽引入羧酸（-COOH）的功能，然后通過碳二亞胺反應(yīng)與xylan 偶聯(lián)，傅立葉變換紅外光譜如圖1 所示，在木聚糖的光譜（見圖1a），在3 420 cm-1是歸因于-OH 拉伸振動的特征，在890 cm-1的峰值歸因于β-糖苷單位之間的聯(lián)系［12～13］。除了Xylan 和QT（見圖1b）的主要峰外，QT-Xylan 偶聯(lián)聚合物（載體）的FT-IR 光譜（見圖1c）在1 735 cm-1處出現(xiàn)了一個新的特征峰，與CO 基團(tuán)的頻率相對應(yīng)，CO 基團(tuán)賦予了xylan 和qt-單琥珀酸酯鍵的形成。

圖1 紅外光譜圖a.Xylan；b. 槲皮素（QT）；c.QT-XylanFig.1 Infrared spectraa.Xylan；b.QT；c.QT-Xylan

2.1.2 核磁共振的結(jié)構(gòu)鑒定與檢測（1H NMR）

利用核磁共振氫譜進(jìn)一步驗證了聚合物載體的合成。圖2 描繪了氫譜qt-xyl 共軛，木聚糖（見圖2a）的特征峰出現(xiàn)在5.2～3.0 mg·L-1是由于質(zhì)子之間（1-4）-β-糖苷鍵［14］，此外，特征峰值在2.4 mg·L-1是由于琥珀酸鹽中琥珀?；腃H2質(zhì)子。與Xylan（見圖2a）的1HNMR 譜相比，QT 的特征峰出現(xiàn)在6.5～8.0 mg·L-1（見圖2b），這些特征峰屬于QT的苯環(huán)［15］。這一特征峰出現(xiàn)在qt-xyl 共軛光譜中，證明了成功合成了qt-xyl共軛聚合物載體。

2.2 納米懸浮劑的制備和優(yōu)化工藝

采用高壓均質(zhì)法制備載藥納米懸浮劑［16］，通過單因素實驗對4個因素分別進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化工藝使粒徑減小并增大其表面積而增加藥物溶解度和其生物利用度［17］，其結(jié)果如下。

2.2.1 均質(zhì)循環(huán)次數(shù)

在均質(zhì)壓力為500 bar，共聚物載體濃度為1 mg·mL-1，載體凍干粉與原藥的質(zhì)量比為1∶1，改變均質(zhì)循環(huán)次數(shù)，進(jìn)行實驗優(yōu)化。結(jié)果如圖3 所示，在均值次數(shù)在7次之前粒徑大小從228.3 nm不斷減小，當(dāng)均值次數(shù)達(dá)到7 次時粒徑大小基本不變，因此為減少能源損耗，當(dāng)次數(shù)為7 次時是最佳循環(huán)次數(shù)。

2.2.2 均質(zhì)循環(huán)壓力

圖2 核磁共振氫譜圖（1H-NMR）a.Xylan；b.QT-xylanFig 2 Nuclear magnetic resonance hydrogen spectraa.Xylan；b.QT-Xylan

圖3 均質(zhì)次數(shù)對粒徑大小的影響Fig 3 The influence of homogenization degree on particle size

在均質(zhì)次數(shù)為7 次，共聚物載體濃度為1 mg·mL-1，載體凍干粉與原藥的質(zhì)量比為1∶1，改變均質(zhì)循環(huán)壓力，進(jìn)行實驗優(yōu)化。結(jié)果如圖4 所示，在均質(zhì)壓力在600 bar 之前，粒徑隨著壓力的不斷增大而減小，當(dāng)壓力達(dá)到600 bar 時歷經(jīng)達(dá)到最小，從292.6 nm 減小到162.6 nm，之后大小基本不變，因此為節(jié)約能耗，當(dāng)均值壓力為600 bar 時為最佳均質(zhì)壓力。

2.2.3 共聚物濃度

圖4 均質(zhì)壓力對粒徑大小的影響Fig 4 The influence of homogeneous pressure on particle size

圖5共聚物載體濃度對粒徑大小的影響Fig 5 The influence of copolymer carrier concentration on particle size

在均質(zhì)次數(shù)為7次，載體凍干粉與原藥的質(zhì)量比為1∶1，均質(zhì)循環(huán)壓力為500 bar，改變載體濃度，進(jìn)行實驗優(yōu)化。結(jié)果如圖5 所示，在共聚物濃度從0.2～1.0 mg·mL-1時，粒徑從297.9 nm 減小到164.1 nm，之后基本維持不變，因此共聚物濃度為1 mg·mL-1為制備的最佳濃度。

2.2.4 共聚物與CoQ10的質(zhì)量比

在均質(zhì)次數(shù)為7次，共聚物載體濃度為1 mg·mL-1，均質(zhì)循環(huán)壓力為500 bar，改變載體凍干粉與原藥的質(zhì)量比，進(jìn)行實驗優(yōu)化。結(jié)果如圖6 所示，藥物與載體的質(zhì)量比為1∶4 時，粒徑為203.6 nm，并隨著質(zhì)量比的不斷增大而逐漸減小，當(dāng)質(zhì)量比為1∶1時，其粒徑大小為176.8 nm，之后隨著質(zhì)量比的增加而發(fā)生較小的改變，因此為節(jié)約原料，當(dāng)質(zhì)量比為1∶1時為最佳比例。

圖6 藥物與載體的質(zhì)量比對粒徑大小的影響Fig 6 The influence of mass ratio between drug and carrier on particle size

2.3 最佳工藝驗證

經(jīng)單因素實驗優(yōu)化得到的最佳條件如下：均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為7 次、均質(zhì)循環(huán)壓力為600 bar、共聚物濃度為1 mg·mL-1、共聚物與CoQ10 的質(zhì)量比為1∶1。為了準(zhǔn)確驗證其制備的平均粒徑，因此在所得優(yōu)化條件下反復(fù)實驗5次，激光粒度儀測得的平均粒徑為166.7 nm，電位為-14.54 mv，與單因素優(yōu)化實驗下的最小粒徑基本一致，達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。

2.4 體外溶出結(jié)果分析

圖7為CoQ10原藥、納米懸浮劑載輔酶Q10和物理混合物在人工胃液中的溶出曲線，根據(jù)液相所測得原藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=15 879 876.29x-868.820 3，R2=0.999 5，結(jié)果可知載藥納米懸浮劑在胃液中的釋放效果較CoQ10 原粉、物理混合物都有明顯提高，但由于輔酶Q10 的飽和溶解度很低，因此過量稱取后的溶出最終累計釋放量較低。在溶出實驗開始后，CoQ10 原藥和物理混合物在人工胃液中的最終釋放累積量僅有2.30% 和2.39%，而納米懸浮劑在人工胃液中的最終釋放累積量為4.35%，分別是原藥和物理混合物的1.89和1.82 倍。圖8 為CoQ10 原藥、納米懸浮劑載輔酶Q10 和物理混合物在人工腸液中的溶出曲線。載藥納米懸浮劑在人工腸液中的釋放效果較CoQ10原粉、物理混合物都有明顯提高。在溶出實驗開始后，CoQ10 原藥和物理混合物在人工腸液中的最終釋放累積量僅有2.49%和2.70%，而納米懸浮劑在人工胃液中的最終釋放累積量為3.72%，分別是原藥和物理混合物的1.49和1.38倍［18］。

圖7 胃液中的累計釋放速率Fig.7 Dissolution rate of SGF

圖8 腸液中的累計釋放速率Fig.8 Dissolution rate of SIF

圖9 血藥濃度Fig.9 Blood concentration

2.5 生物利用度的研究

根據(jù)口服CoQ10 后在大鼠血液中的藥物濃度評估其在體內(nèi)的生物利用度［19］，結(jié)果如圖9 所示，CoQ10原藥在4 h時血藥濃度達(dá)到最高為0.6 mg·L-1，物理混合物在4 h 時血藥濃度達(dá)到最高為0.68 mg·L-1，而納米懸浮劑在120 min 時血藥濃度達(dá)到最高為1.77 mg·L-1，出峰時間略有提前且其血藥濃度遠(yuǎn)高于CoQ10 原藥的血藥濃度。CoQ10 的AUC 值（濃度—時間曲線下面積）為8.26 mg·L-1·h，物理混合物AUC 值為10.72 mg·L-1·h，納米懸浮劑AUC 值為21.81 mg·L-1·h，是原藥的2.64 倍。這可能是由于經(jīng)高壓均質(zhì)后粒徑變小，表面積增大，口服用藥時納米懸浮劑中的藥物與胃腸壁的接觸面積增大，可以有效地提高藥物的生物利用度，更容易被機(jī)體快速吸收［20～22］，因此利用納米懸浮劑負(fù)載輔酶Q10 是一種理想的口服遞送形式。其方法學(xué)驗證結(jié)果如下：曲線擬合y=6 896 617.790 8x+8 399.375 0，線性范圍0.1～100 ng·mL-1，回歸系數(shù)為0.999 6，具有良好的穩(wěn)定性與精確度，因此可被廣泛用于檢測樣品血漿。

3 討論

本小結(jié)通過合成的QT-Xylan載體具有良好的表面活性劑性質(zhì)，而應(yīng)用于制備納米混懸劑。首先，采用高壓均質(zhì)法包載輔酶Q10，并進(jìn)行單因素實驗對制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過均質(zhì)循環(huán)次數(shù)、均質(zhì)循環(huán)壓力、共聚物濃度、共聚物與CoQ10 的質(zhì)量比4種因素對其粒徑大小的影響，得到最佳優(yōu)化工藝，當(dāng)均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為7 次、均質(zhì)循環(huán)壓力為600 bar、共聚物濃度為1 mg·mL-1、共聚物與CoQ10 的質(zhì)量比為1∶1 時得到最小粒徑，為了其準(zhǔn)確性，進(jìn)行5 次平行實驗，所測得的平均粒徑為166.7 nm，電位為-14.54 mv，與單因素優(yōu)化實驗下的最小粒徑基本一致，形成了一種新型載藥納米懸浮劑，并對其進(jìn)行一系列體外實驗評價。實驗結(jié)果表明，通過制備以及優(yōu)化包載輔酶Q10 的新型納米懸浮劑能夠增加CoQ10 的水溶性，并且有效提高其口服生物利用度為原藥的2.64 倍，具有廣泛的應(yīng)用前景。