呂冬雪 張學(xué)杰 張洛艷 樊守金

（山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院逆境植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250014）

二色補(bǔ)血草（Limonium bicolor（Bag.）Kuntze）是越年生草本植物，隸屬白花丹科（Plumbaginaceae）補(bǔ)血草屬（Limonium）［1］，典型的鹽生植物［2］，二色補(bǔ)血草分布在黃河流經(jīng)省區(qū)，江蘇北部等。它常生長(zhǎng)在較低的斜坡、丘陵、平原和沿海地區(qū)，生于含鹽的鈣質(zhì)土壤和砂地［2］。專家對(duì)其研究主要集中在生理抗鹽機(jī)制、化學(xué)成分、栽培技術(shù)方面，但對(duì)其遺傳多樣性研究較少。為了探討黃河三角洲鹽漬生境下，二色補(bǔ)血草的遺傳多樣性水平及其成因，探究二色補(bǔ)血草居群遺傳分化的程度與遺傳結(jié)構(gòu)的形成機(jī)制，為二色補(bǔ)血草種質(zhì)資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。SSR 分子標(biāo)記是由2～6 個(gè)核苷酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列，根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR 技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星DNA 序列，再經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳獲得長(zhǎng)度的多態(tài)性［3］。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)具有多種優(yōu)勢(shì)，共顯性遺傳、重復(fù)性好、位點(diǎn)豐富。結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)，智能化較高，真正實(shí)現(xiàn)大量數(shù)據(jù)快速收集處理，有效避免人工讀帶誤差，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，對(duì)于物種資源收集，保護(hù)改良［4］具有重要意義。隨著NCBI中EST 數(shù)據(jù)庫(kù)的豐富與完善，序列開(kāi)發(fā)SSR 標(biāo)記在眾多植物中得到廣泛應(yīng)用［5］。這樣避免了傳統(tǒng)標(biāo)記開(kāi)發(fā)需要構(gòu)建基因組DNA 文庫(kù)等繁瑣步驟，成為種質(zhì)資源多樣性、遺傳作圖、物種起源與進(jìn)化等研究常用方法［6］。

1 材料及實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料采集

在黃河三角洲一定地理區(qū)域內(nèi)，調(diào)查發(fā)現(xiàn)50個(gè)二色補(bǔ)血草居群，采用隨機(jī)取樣的方式對(duì)50 個(gè)地點(diǎn)均勻、分散、有間距的取樣，選出12 個(gè)自然居群。根據(jù)自然居群現(xiàn)有分布規(guī)模以“株”為單位隨機(jī)取樣，個(gè)體間距10 m，采集新鮮葉片。共202 份樣品。在這12 個(gè)地點(diǎn)，進(jìn)行土壤樣品采集。在每處耕層垂直挖掘30 cm 的深度，沿著切割表面從底部到頂部取適量土壤樣品。每處采集3份。用電導(dǎo)率儀（DDS-307）測(cè)量土壤浸出液的電導(dǎo)率（見(jiàn)表1）。

1.2 DNA提取

瓊脂糖電泳質(zhì)量檢測(cè)（Agarose gel electrophoresis，AE），采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)基因組DNA 的完整性和降解情況。將其置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，DNA 具有清晰的主條帶無(wú)斷裂、拖尾、降解現(xiàn)象，拍照記錄。濃度檢測(cè)使用微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop2000 測(cè)量DNA 提取物的濃度與純度。

表1 采集地信息和土壤鹽度Table 1 Geographic location and soil salinity at the study sites

1.3 引物設(shè)計(jì)及PCR體系流程

在NCBI 網(wǎng)站下載4 892 條EST 序列，通過(guò)SSRhunter 在線搜索得到340 條符合條件的序列，通過(guò)Primer premier5.0 軟件，共設(shè)計(jì)得到92 對(duì)引物。華大基因有限公司合成上下游引物。實(shí)驗(yàn)建立陰性對(duì)照，并使用ddH2O 代替模板DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)使用10 μL 體系。包括2 μL MIX，5 μL ddH2O，正反引物各1 μL，DNA 模板1 μL，反應(yīng)流程為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，退火時(shí)間設(shè)置30 s，72℃延伸80 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.4 SSR實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行PAGE 凝膠電泳及銀染，利用熒光標(biāo)記引物進(jìn)行PCR，用3730XL 毛細(xì)管電泳檢測(cè)STR 分子標(biāo)記的方法對(duì)目的群體進(jìn)行多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選。熒光PCR 產(chǎn)物信號(hào)檢測(cè)的結(jié)果由Gene Marker v2.2.0軟件解釋，毛細(xì)管電泳圖譜以PDF的形式呈現(xiàn)［7］（見(jiàn)圖1）。毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)由上海邁浦生物科技有限公司完成并得到18 對(duì)具有多態(tài)性的位點(diǎn)（見(jiàn)表2）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

圖1 二色補(bǔ)血草部分樣品在SSRLB1引物處擴(kuò)增的毛細(xì)管電泳檢測(cè)Fig.1 Capillary electropherogram obtained by SSRLB1 primer of some samples from Limonium bicolor

表2 18個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列和等位基因多樣性信息Table 2 Primer sequences and allelic diversity information for 18 microsatellite loci

運(yùn)用遺傳數(shù)據(jù)分析軟件GENAIEX6.502 計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)，可得出平均等位基因數(shù)目（Na）、有效等位基因數(shù)目（Ne）、平均觀察雜合度（Ho）、平均期望雜合度（He）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）等遺傳多樣性參數(shù)，主成分分析（PCoA）結(jié)果；F-統(tǒng)計(jì)量和基因流（Nm）等遺傳分化參數(shù)。利用ARLEQUIN version3.5.2.2軟件進(jìn)行分子遺傳方差分析即AMOVA分析［8］。使用IBM SPSS statistics19.0 做出遺傳多樣性參數(shù)（He）、（I）與鹽度的差異顯著性分析。遺傳結(jié)構(gòu)使用STRUCTUREv2.3.4 馬爾科夫鏈（Markov Chain Monie Corfo，MCMC）完成［9］。MEGAv6.0軟件做出聚類分析圖。

2 數(shù)據(jù)結(jié)果

2.1 平衡檢測(cè)

12個(gè)種群的18個(gè)SSR 位點(diǎn)共獲得216個(gè)種群位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，其中134 個(gè)與哈迪-溫伯格平衡（HWE）一致，76 個(gè)顯著偏離（P＜0.01）HWE 平衡，而余下的6個(gè)則為單態(tài)。

2.2 遺傳多樣性結(jié)果分析

居群水平遺傳多樣性：得到二色補(bǔ)血草居群平均等位基因數(shù)目（Na）介于4.111～5.167，平均是4.644，最高群體是XD；有效等位基因數(shù)目（Ne）介于2.49～3.197，平均2.729，最高群體是XL。香農(nóng)信息指數(shù)（I）介于0.967～1.14，平均1.037，最高群體是XL。平均觀察雜合度（Ho）范圍是0.305～0.540，平均0.430，最高群體是XL。平均期望雜合度（He）在0.486～0.556，平均為0.529，最高的群體是WZ。平均觀察雜合度與平均預(yù)期雜合度之間的差異最小是種群XL，其次是XT，最大的是BQ，固定指數(shù)（F）是正的，其中居群XL最小，說(shuō)明此居群相比于其他群體其雜合子較多（見(jiàn)表3）。

位點(diǎn)水平遺傳多樣性：通過(guò)使用具有顯著多態(tài)性的18 對(duì)SSR 引物進(jìn)行202 個(gè)二色補(bǔ)血草樣品的擴(kuò)增，得到176 條帶。每對(duì)擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶是4～27 條，平均每對(duì)是9.7 條。擴(kuò)增得到平均等 位 基 因 數(shù) 目（Na）范 圍 是2.083（SSRLB18）～11.667（SSRLB1），平均4.644；有效等位基因數(shù)目（Ne）范圍是1.176（SSRLB18）～7.952（SSRLB1），平均2.729；香農(nóng)信息指數(shù)（I）范圍是0.255～2.221，平均1.037；平 均 觀 察 雜 合 度（Ho）范 圍 是0.055～0.829，平均0.430；平均期望雜合度（He）范圍是0.137～0.869，平均0.529。固定指數(shù)（F）總體介于-0.545（SSRLB53）～0.836（SSRLB31），平 均 為0.198，其中4個(gè)位點(diǎn)為負(fù)值，負(fù)值出現(xiàn)位點(diǎn)為SSRLB2、SSRLB18、SSRLB53、SSRLB54，說(shuō)明這四個(gè)位點(diǎn)雜合子過(guò)量；其余為正值，說(shuō)明含有雜合子較少（見(jiàn)表4）。

2.3 遺傳分化

二色補(bǔ)血草群體近交系數(shù)（FIS），范圍為-0.546～0.835，SSRLB2、SSRLB18、SSRLB53、SSRLB54 四個(gè)位點(diǎn)為負(fù)值，平均為0.196。基因流（Nm）為2.188～13.741，平均4.106。遺傳分化系數(shù)（FST）平均為0.067，范圍是0.018（SSRLB53）～0.103（SSRLB14）（見(jiàn)表5）。在本研究中，使用ARLEQUINv.3.5 對(duì)所有居群在物種水平和分組水平進(jìn)行AMOVA 分析。結(jié)果為96%的遺傳變異來(lái)自居群內(nèi)，4%的遺傳變異來(lái)自于居群間（見(jiàn)表6）。

表3 二色補(bǔ)血草居群遺傳多樣性參數(shù)Table 3 The parameter of genetic diversity for L.bicolor populations

表4 18個(gè)位點(diǎn)遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Diversity information parameters at 18 SSR loci

表5 18個(gè)位點(diǎn)遺傳分化參數(shù)Table 5 Genetic differentiation parameters at 18 SSR loci

表6 18個(gè)位點(diǎn)分子方差分析結(jié)果Table 6 AMOVA results as a weighted average over eighteen microsatellite loci

2.4 遺傳結(jié)構(gòu)

使用GENAIEX6.502 軟件對(duì)12 個(gè)居群進(jìn)行基于遺傳距離構(gòu)建的主成分（PCoA）分析，可以反映親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。圖中兩點(diǎn)之間的距離，代表兩個(gè)居群間的遺傳距離，兩點(diǎn)之間的距離越近，說(shuō)明兩個(gè)居群間的遺傳距離越近。圖中距離相近的群體，實(shí)際地理距離并不接近，結(jié)果表明二色補(bǔ)血草的遺傳距離與地理距離無(wú)相關(guān)性（見(jiàn)圖2）。

通過(guò)Mantel 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：黃河三角洲二色補(bǔ)血草居群的遺傳距離與地理距離之間無(wú)相關(guān)性（R2＝0.001 2，P=0.374）（見(jiàn)圖3）；遺傳距離與土壤鹽度差異沒(méi)有相關(guān)性（R2＝0.005 8，P=0.4）（見(jiàn)圖4）；土壤鹽度與遺傳參數(shù)He、參數(shù)I關(guān)系結(jié)果顯示：（R2＝0.001，P=0.918），說(shuō)明土壤鹽度和遺傳參數(shù)I沒(méi)有相關(guān)性；（R2＝0.005 9，P＝0.821），說(shuō)明土壤鹽度和遺傳參數(shù)He沒(méi)有相關(guān)性（見(jiàn)圖5）。

圖2 基于SSR方法的主成分分析Fig.2 Principal component analysis based on SSR

圖3 SSR分析的遺傳距離矩陣與地理位置矩陣的相關(guān)性Fig.3 The relevance between genetic distance matrix and geography distance matrix based on SSR

圖4 SSR分析的遺傳距離矩陣和土壤鹽度矩陣的相關(guān)性Fig.4 The relevance between genetic distance matrix and salinity matrix based on SSR

圖5 土壤鹽度和居群遺傳多樣性參數(shù)（I）與（Ho）的相關(guān)性Fig.5 Correlation between soil salinity and population genetic diversity in YRD

通過(guò)運(yùn)行軟件并使用類平均聚類法（UPGMA）計(jì)算遺傳距離。這種非加權(quán)算術(shù)平均聚類法靈敏度高，真實(shí)性強(qiáng)，具有單調(diào)性，應(yīng)用廣泛，聚類效果較好。XD 和XT 之間的遺傳距離最小，遺傳關(guān)系最接近，但地理距離不是最近的。說(shuō)明遺傳距離與地理距離無(wú)相關(guān)性，聚類結(jié)果見(jiàn)圖6。

運(yùn)行STRUCTUREv2.3.4 軟件，設(shè)置Length of burn-in-period 為100 000，Number of MCMC replications after burn in 為1 000 000，K值定義為16，每個(gè)K 值運(yùn)行10 次。點(diǎn)擊Bar plot 出現(xiàn)彩圖結(jié)果。將運(yùn)行完的結(jié)果壓縮（Result.zip），使用Structure Harvester 在線工具，判斷群體的Clusters 即最可能的K 值。通過(guò)deltaK 確定最佳K 值［10］，CLUSTERS重 復(fù) 抽 樣 分 析，利 用CLUMPP1.1.2［11］軟 件 和CLUMPAK 文件推斷最佳K 值，運(yùn)行次數(shù)10 次，將上步所得結(jié)果置于Distruct1.1［12］軟件目錄下，圖形化顯示結(jié)果。隨著K 值增加，當(dāng)K=5 時(shí)，△K 值達(dá)到峰值，當(dāng)K 值繼續(xù)增大，△K 值急劇下降。表明K=5 時(shí)，是比較適合的分組。不同的顏色代表不同的組，顏色的比例越大，二色補(bǔ)血草資源被分成相應(yīng)組的可能性越大。屬于相同顏色的群體顯示出相對(duì)明顯的區(qū)域特征［7］（見(jiàn)圖7～8）。

圖6 二色補(bǔ)血草12個(gè)分布居群基于SSR分析的UPGMA聚類Fig.6 UPGMA dendrogram of twelve populations in L.bicolor base on SSR analysis using Nei’s unbiased genetic distances

圖7 K值與LnP（D）、△K值變化趨勢(shì)圖Fig.7 Line chart of K with LnP（D）and △K

圖8 基于EST-SSR標(biāo)記的12份二色補(bǔ)血草種質(zhì)群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.8 Population structure of 12 L. bicolor germplasms based on EST-SSR markers

3 討論

3.1 遺傳多樣性討論分析

SSR 分子標(biāo)記揭示了分子水平上的遺傳多樣性［13］。平均等位基因數(shù)（Na）平均是4.644，說(shuō)明二色補(bǔ)血草居群具有一定遺傳多樣性。采用香農(nóng)多樣性指數(shù)評(píng)價(jià)種質(zhì)資源的遺傳多樣性，平均是1.037，也表明二色補(bǔ)血草居群具有一定的遺傳多樣性。一般認(rèn)為雜合度高于0.5 的種群具有較高的遺傳多樣性［14］，二色補(bǔ)血草種群平均期望雜合度平均是0.529，并且12個(gè)群體的平均期望雜合度只有WD 是0.486，其余最小0.505，說(shuō)明其具有較高的遺傳多樣性。觀察雜合度和期望雜合度的差值可用于測(cè)量居群的遺傳多樣性［14］，在本研究中，期望雜合度與觀察雜合度之間差值最小的是XL，表明遺傳多樣性最高，差值最大的是BQ，說(shuō)明遺傳多樣性最低，居群間的遺傳多樣性比較可以指導(dǎo)二色補(bǔ)血草的種質(zhì)資源收集。觀察雜合度易受樣本量的影響。在利用SSR 位點(diǎn)進(jìn)行遺傳分析時(shí)，要求居群個(gè)體在20～40，本研究每個(gè)居群為10～25 個(gè)個(gè)體，能夠滿足篩選多態(tài)性微衛(wèi)星引物要求［15］。

遺傳多樣性的高低與物種壽命、地理分布、繁殖特性和傳播媒介等有密切的關(guān)系［16］。二色補(bǔ)血草通常使用種子繁殖，但其遺傳性非常特殊，具有大量不育分枝，具有純合不育的特征［17］。二色補(bǔ)血草是兩年生植物，花期較長(zhǎng)，種子較小，花萼宿存，風(fēng)力傳粉，使得二色補(bǔ)血草具有較高的遺傳多樣性。保證二色補(bǔ)血草長(zhǎng)期生存應(yīng)減少人為干擾，合理利用資源［18］，在此基礎(chǔ)上，擴(kuò)大居群數(shù)量，加快收集和育種工作［19］。研究二色補(bǔ)血草遺傳多樣性，可以為保育策略的制定、保持進(jìn)化潛力措施的制定提供一定科學(xué)依據(jù)［20］。針對(duì)黃河三角洲應(yīng)該完善種質(zhì)資源收集的配置工作，恢復(fù)天然種群［21］。

3.2 遺傳分化討論分析

當(dāng)測(cè)得FST在0.05～0.15時(shí)，表明居群間存在著中等程度的遺傳分化。研究得到二色補(bǔ)血草FST為0.067，表明群體間存在6.7% 的遺傳變異。93.3%的遺傳變異存在于居群內(nèi)。Nm＞4，每代移動(dòng)的個(gè)體數(shù)（Nm）＞4，表明較大的基因流有效抵抗遺傳漂變，居群間交流頻繁。分子差異分析96%的遺傳差異來(lái)自居群內(nèi)，只有4%的遺傳差異屬于居群間。不同的居群間存在頻繁的基因交流?；蛄骺梢允惯z傳信息產(chǎn)生新的遺傳組合，使得個(gè)體適應(yīng)性更強(qiáng)［22］。黃河三角洲河流眾多，黃河水域的傳播作用，使二色補(bǔ)血草種子沿著黃河向不同地區(qū)延伸，不同居群的基因交流頻繁，居群間遺傳變異微弱［23］。

3.3 遺傳結(jié)構(gòu)討論分析

主成分分析、Mantel-test檢驗(yàn)、UPGMA 聚類分析、STRUCTURE 結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致，均表明黃河三角洲二色補(bǔ)血草遺傳距離和地理距離無(wú)相關(guān)性，居群間遺傳信息交流頻繁，遺傳差異較小。12個(gè)二色補(bǔ)血草居群的遺傳距離和土壤鹽度無(wú)相關(guān)性，再次驗(yàn)證二色補(bǔ)血草是典型的鹽生植物。雖然對(duì)二色補(bǔ)血草的培育進(jìn)行了大量的研究，但未進(jìn)行過(guò)大量的人工栽培和一些項(xiàng)目的推廣［2］，在此基礎(chǔ)上，我們建議保持居群的完整性，建立保護(hù)點(diǎn)以保護(hù)自然種群，建立種質(zhì)資源庫(kù)、基因庫(kù)等［24］。

4 結(jié)論

黃河三角洲二色補(bǔ)血草SSR 分析結(jié)果表明，二色補(bǔ)血草具有較高水平遺傳多樣性。遺傳分化是中度的。遺傳差異主要來(lái)自居群內(nèi)部。并且遺傳結(jié)構(gòu)分析表明12 個(gè)居群間地理位置與土壤鹽度均和遺傳距離無(wú)相關(guān)性。下一步有待在其表型水平上進(jìn)行多樣性探索，以期獲得更全面的二色補(bǔ)血草遺傳多樣性信息［7］。