趙夢(mèng)瑤 李思源 肖志偉 藺茹君 趙曉偉 李 軍

1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科(石河子 832000) 2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院(石河子 830000) 3 新疆軍區(qū)69296部隊(duì)(喀什 844000)

塞來(lái)昔布作為環(huán)氧化酶- 2 (COX- 2) 的特異性抑制劑,在多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中均被證明其對(duì)肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌等都具有抑制作用[1- 5]，在抗腫瘤領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但塞來(lái)昔布在食管癌中的作用及機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)人食管癌EC109細(xì)胞，并測(cè)定COX- 2抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)食管癌EC109細(xì)胞系COX- 2蛋白表達(dá)及凋亡能力的影響，旨在為食管癌的預(yù)防和治療提供新的依據(jù)，為食管癌的靶向治療拓寬空間。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管癌EC109細(xì)胞系(購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))，塞來(lái)昔布(購(gòu)自美國(guó)瑞輝公司)，人COX- 2酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自上海雙贏生物科技有限公司)，胎牛血清(FBS，購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)，DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)，二甲基亞砜(DMSO，購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司)，流式細(xì)胞儀(購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司)。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

體外培養(yǎng)EC109細(xì)胞，使用終濃度100 μmol/L塞來(lái)昔布原液，加入DMSO溶液將細(xì)胞分為對(duì)照組(0 μmol/L)及干預(yù)實(shí)驗(yàn)組(20、60、100 μmol/L)。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)測(cè)定COX- 2蛋白表達(dá)。

常規(guī)處理EC109細(xì)胞，將調(diào)整好濃度的EC109細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板，使用DEME沖洗孔底細(xì)胞并加入0、20、60、100 μmol/L不同濃度塞來(lái)昔布溶液各1 mL后繼續(xù)孵育；24 h后將其放入- 20℃冰箱反復(fù)凍融并離心后使用。ELISA法測(cè)定COX- 2蛋白表達(dá)。

圖1 不同濃度塞來(lái)昔布對(duì)EC109細(xì)胞凋亡率的影響A.對(duì)照組 B.塞來(lái)昔布20 μmol/L C.塞來(lái)昔布60 μmol/L D.塞來(lái)昔布100 μmol/L

1.2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定不同濃度塞來(lái)昔布對(duì)EC109細(xì)胞凋亡的影響。

將加入0、20、60、100 μmol/L不同濃度塞來(lái)昔布溶液的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，只加入DMSO溶液為對(duì)照組；將細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后離心，加入PBS溶液洗滌吹打后再離心，調(diào)整細(xì)胞為合適濃度后加入顯影劑孵育15 min，再加入10 μL PI溶液混勻后孵育5 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度塞來(lái)昔布對(duì)EC109細(xì)胞COX- 2蛋白表達(dá)的影響

塞來(lái)昔布在不同濃度(0,20,60,100 μmol/L)情況下處理EC109細(xì)胞24 h后，EC109細(xì)胞中COX- 2蛋白的表達(dá)依次是1.581±0.116，1.226±0.089，0.846±0.076，0.521±0.082，分別與0 μmol/L塞來(lái)昔布組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)COX- 2蛋白表達(dá)隨著塞來(lái)昔布濃度遞增而逐漸減少(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 EC109細(xì)胞不同濃度塞來(lái)昔布處理后COX- 2 蛋白表達(dá)

注：均與0 μmol/L的塞來(lái)昔布組相比較

2.2 不同濃度塞來(lái)昔布對(duì)食管癌EC109細(xì)胞凋亡的影響

用不同濃度(0、20、60、100 μmol/L)塞來(lái)昔布處理EC109細(xì)胞24小時(shí)。EC109細(xì)胞凋亡率依次是1.700±0.557，13.400±1.735，18.766±1.301，28.100±1.997。四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=161.843,P<0.05)；可見(jiàn)隨著塞來(lái)昔布濃度的增加，EC109細(xì)胞的凋亡率逐漸增加。(見(jiàn)圖1、圖2)

圖2 不同濃度塞來(lái)昔布組凋亡率比較 注：VS 0 μmol/L塞來(lái)昔布組*P<0.05

3 討 論

食管癌(esophageal cancer:EC)是一種惡性程度高的消化道腫瘤。它存在非常顯著的地理分布和遺傳特色。近年來(lái)在中國(guó)，食管癌的死亡率雖然逐年下降[6]，但其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)仍處于較高水平，發(fā)病率位于世界惡性腫瘤發(fā)病率第9位，死亡率位于世界惡性腫瘤死亡率第5位，發(fā)病率及死亡率男性均高于女性[7]。食管癌的發(fā)生機(jī)制目前被認(rèn)為是多種致癌因素共同作用，干擾了細(xì)胞正常增殖和凋亡，從而使癌細(xì)胞過(guò)度增殖，阻礙細(xì)胞凋亡，但具體機(jī)制不明。

環(huán)氧化酶- 2(COX- 2)作為前列腺素產(chǎn)生過(guò)程中的一種誘導(dǎo)酶，在生理狀態(tài)下較少表達(dá)。多項(xiàng)研究證實(shí)，COX- 2蛋白是與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的重要分子[8],其在多種癌癥組織中存在異常高表達(dá)[9-11]。近年來(lái)，亦有研究證實(shí)COX- 2在多種惡性腫瘤的早期診斷及預(yù)后評(píng)估也有重要作用。據(jù)報(bào)道，COX- 2蛋白的高表達(dá)對(duì)胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的預(yù)后呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[12]，并且COX- 2誘導(dǎo)的慢性炎癥可進(jìn)一步增強(qiáng)致癌細(xì)胞信號(hào)活性[13]。胡真真[14]的研究證實(shí)COX- 2可作為鼻腔鼻竇鱗狀細(xì)胞癌早期診斷的分子生物標(biāo)志物，而且COX- 2的表達(dá)強(qiáng)度對(duì)于該惡性腫瘤的惡性程度及預(yù)后的評(píng)估也有重要作用。呂歆[15]的研究表明COX- 2蛋白的表達(dá)情況能有效預(yù)測(cè)食管鱗癌的預(yù)后。COX- 2在惡性腫瘤的關(guān)系研究中越來(lái)越重要，對(duì)惡性腫瘤中COX- 2的研究也越來(lái)越深入。

COX- 2的過(guò)度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過(guò)抑制COX- 2的表達(dá)可以抑制腫瘤的發(fā)展[16-17]。本研究通過(guò)應(yīng)用不同濃度(0,20,60,100 μmol/ L)的塞來(lái)昔布對(duì)EC109細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果顯示藥物濃度為0 μmol/ L時(shí)，COX- 2蛋白的表達(dá)水平最高為1.581±0.116；藥物濃度為100 μmol/ L時(shí)，COX- 2蛋白的表達(dá)水平最低為0.521±0.082，總體上，COX- 2蛋白的表達(dá)水平隨著塞來(lái)昔布藥物濃度遞增而逐漸減少，提示塞來(lái)昔布能夠有效抑制COX- 2蛋白的表達(dá)水平,這與Liu[18]等使用美洛昔康作用于食管鱗癌的研究結(jié)果相似。國(guó)內(nèi)藺茹君、李紅濤等人的研究同樣證實(shí)了經(jīng)塞來(lái)昔布具有抑制食管癌細(xì)胞增殖的作用。

塞來(lái)昔布對(duì)食管癌的抑制機(jī)制尚不清楚。Sui W等[19]人的研究發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布通過(guò)作用在血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制腫瘤組織的血管生成，降低腫瘤細(xì)胞侵襲力。李紅濤等[20]人的研究表明塞來(lái)昔布誘導(dǎo)EC109細(xì)胞凋亡可能與其阻滯細(xì)胞周期的有序進(jìn)行有關(guān)。本研究通過(guò)使用不同濃度塞來(lái)昔布處理食管癌EC109細(xì)胞24 h后，觀察到藥物濃度為0 μmol/ L時(shí)，EC109細(xì)胞凋亡率最低為1.700±0.557；藥物濃度為100 μmol/ L時(shí)，EC109細(xì)胞凋亡率最高為28.100±1.997，四組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=161.843,P<0.05)，細(xì)胞的凋亡率隨著藥物濃度的增高而逐漸增加，說(shuō)明塞來(lái)昔布對(duì)EC109細(xì)胞具有濃度依賴性。張康[21]等通過(guò)對(duì)不同時(shí)間不同濃度的塞來(lái)昔布食管癌Eca-109細(xì)胞增殖及凋亡研究同樣顯示塞來(lái)昔布對(duì)EC109細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。藺茹君[22]等人在研究COX- 2與MMP-14對(duì)食管癌的可能作用機(jī)制中，結(jié)果表明塞來(lái)昔布對(duì)ECa109細(xì)胞增殖具有抑制作用。陳小龍的研究發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布可減少CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例并且促進(jìn)CD3+、CD4+T細(xì)胞增殖，進(jìn)而增強(qiáng)免疫應(yīng)答，對(duì)食管鱗癌具有潛在治療作用[23]。李紅濤[20]等人通過(guò)體外研究選擇性環(huán)氧化酶- 2(COX- 2)抑制劑塞來(lái)昔布對(duì)人食管癌細(xì)胞株Eca-109增殖和凋亡的影響結(jié)果同樣顯示能夠顯著抑制EC109增殖，誘導(dǎo)凋亡。而本實(shí)驗(yàn)使用塞來(lái)昔布作用于食管癌EC109細(xì)胞，結(jié)論提示塞來(lái)昔布可能通過(guò)抑制COX- 2的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)EC109細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，塞來(lái)昔布可以在濃度梯度下抑制EC109細(xì)胞系中COX- 2蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)食管癌EC109細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而起到抗腫瘤的作用。以此為靶點(diǎn)，可為食管癌的診斷及靶向治療提供依據(jù)。