孫陶利,周芫宇,黎綾
(長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,新型藥物制劑研發(fā)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,湖南長(zhǎng)沙 410219)
綠茶是中國(guó)主要茶類(lèi)之一,廣受歡迎,其中兒茶素約占其干重的30%。兒茶素中含量最高的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)約占兒茶素質(zhì)量的50%[1]。研究表明,EGCG具有多種藥理活性,包括明顯的消除體內(nèi)自由基、抗癌、抗炎、抗突變、抗衰老及改善肝功能等生物活性,現(xiàn)已列為潛在的抗癌藥物在中國(guó)和美國(guó)等國(guó)被研究[2]。
因EGCG屬于黃烷醇類(lèi)化合物,結(jié)構(gòu)中的酚羥基極易氧化為鄰醌,而鄰醌又很不穩(wěn)定,易發(fā)生復(fù)雜的聚合、縮合反應(yīng),而形成雙黃烷醇類(lèi)、茶黃素類(lèi)和茶紅素類(lèi)等。EGCG被氧化后,其藥理活性會(huì)隨之降低[3]。因此,阻止EGCG在體外被氧化,提高EGCG的體外穩(wěn)定性是保留EGCG藥理活性的有效方法。
β-乳球蛋白(β-LG)是反芻動(dòng)物分泌的乳液中的一種乳清蛋白,屬純天然材料。研究表明,自然狀態(tài)下的β-LG可以直接結(jié)合脂肪酸、維生素A以及各種芳香族化合物等低級(jí)分子,且這些分子多位于β-LG中央空腔內(nèi),是一種優(yōu)良的包埋材料[4]。但β-LG對(duì)親水性的分子(EGCG等)裝載效率較低,可以通過(guò)熱誘導(dǎo)改變蛋白結(jié)構(gòu),提高β-LG裝載水溶性藥物的效率[5]。本課題將利用納米技術(shù)將EGCG包封在β-LG中央空腔內(nèi),以提高EGCG的穩(wěn)定性。
EGCG原料藥(98%,酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司),EGCG對(duì)照品(98%,北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院商城分院,批號(hào):060509),β-LG(純度>90%,上海源葉生物科技有限公司),(TritonX-100,分析純天津市恒興化學(xué)試劑有限公司),甲醇(色譜純),磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、冰乙酸、磷酸等試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。
DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司),AL204電子天平(梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司),DP1100高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司),WH-2微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠),HZ-9211K恒溫?fù)u床(太倉(cāng)華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),激光粒度分析儀(ZetaPALS美國(guó)布克海文儀器公司),Sino Chrome ODS-BP色譜柱(C18柱,250mm×4.6mm,5μm)。
1.2.1 色譜條件
色 譜 柱:C18柱,5μm,4.6 mm×250 mm;流動(dòng)相:甲醇-水-乙酸(30∶68∶2);流速:1.0 mL/min;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng) 276nm;進(jìn)樣量20μL。
1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱(chēng)取EGCG對(duì)照品25mg于25mL容量瓶中,配置為1mg/mL的EGCG母液,精密吸取0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、2.0mL EGCG 母 液于10mL容量瓶中,配制一系列濃度的EGCG的對(duì)照品溶液,在1.2.1色譜條件下測(cè)定。以EGCG進(jìn)樣濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X),峰面積(mV.sec)為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),得回歸方程為Y=33232X-540.66,R2=0.996。結(jié)果表明,EGCG在0.08~0.20 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
圖1 EGCG的標(biāo)準(zhǔn)曲線
用磷酸鹽緩沖液配制一定濃度的β-LG溶液,室溫下在搖床(200r/min)中過(guò)夜,使其充分溶解。用pH為2.5的磷酸鹽緩沖液配制一定濃度的EGCG溶液。取β-LG溶液(9.5mL)水浴加熱20min,然后加入0.5mLEGCG溶液,快速渦旋混合20s,并馬上置于25℃的水浴鍋中,冷卻3h即得。
包封率計(jì)算公式如(1)所示:
式中,W總表示加入的EGCG的總質(zhì)量,mg;W游表示上清液中游離的EGCG質(zhì)量,mg。
固定EGCG濃度為0.4mg/mL,緩沖液pH為6.8,熱激溫度為75℃,β-LG濃度見(jiàn)表1。參照1.3中方法制備,根據(jù)公式(1)計(jì)算包封率。由表1可知,β-LG的濃度為3mg/mL時(shí),包封率最大,選擇β-LG的濃度為3mg/mL進(jìn)行下一因素考察。
表1 β-LG濃度對(duì)包封率的影響
固定β-LG的濃度為3mg/mL,緩沖液pH為6.8,熱激溫度為75℃,不同EGCG濃度下的包封率如表2所示。EGCG濃度為0.8mg/mL時(shí)包封率較大,選擇EGCG濃度0.8mg/mL進(jìn)行下一因素考察。
表2 EGCG濃度對(duì)包封率的影響
固定β-LG的濃度為3mg/mL,EGCG濃度為0.8mg/mL,熱激溫度為75℃,測(cè)量不同緩沖液pH(6.3、6.5、6.8)下的包封率。由表3可知,緩沖液pH為6.5時(shí),包封率最大,選擇緩沖液pH為6.5進(jìn)行下一因素考察。
表3 緩沖液pH對(duì)包封率的影響
固定β-LG的濃度為3mg/mL,EGCG濃度為0.8mg/mL,緩沖液pH為6.5,測(cè)量不同熱激溫度下的包封率。由表4可知,熱激溫度為75℃時(shí)包封率最大。
表4 熱激溫度對(duì)納米粒包封率的影響
綜上所述,最終選擇制備EGCG-β-LG納米粒的條件是:β-LG的濃度為3mg/mL,EGCG濃度0.8mg/mL,緩沖液pH為6.5,熱激溫度75℃。
用pH為6.5的磷酸鹽緩沖液配制濃度為3 mg/mL的β-LG溶液,室溫下?lián)u床(200 r/min)過(guò)夜,使其充分溶解。用pH為2.5的磷酸鹽緩沖液配制濃度為0.8 mg/mL的EGCG溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。取β-LG溶液(9.5 mL)在溫度 75℃下水浴加熱 20 min然后加入0.5mL濃度為0.8 mg/mLEGCG溶液,快速渦旋混合20s,并馬上置于25℃的水浴鍋中,冷卻3h。即得EGCG-β-LG納米粒。按照公式(1)進(jìn)行計(jì)算,納米粒的包封率為82.61%,激光粒度分析儀測(cè)定得粒徑為94.46 nm(圖2),Zeta電位為-27.9mV(圖3)。
圖2 EGCG-β-LG納米粒的粒徑
圖3 EGCG-β-LG納米粒的Zeta電位
取最優(yōu)條件下制備的EGCG-β-LG納米粒到10mL容量瓶中,在高溫堿性條件下加入等量的TritonX-100破壞納米粒,旋渦震蕩使納米粒充分解體,定容,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,HPLC測(cè)定溶液中EGCG的含量。EGCG保留率計(jì)算公式如(2)所示。由圖1可知,EGCG-β-LG納米粒的EGCG保留率明顯高于EGCG水溶液。
以EGCG水溶為對(duì)照組,取2mL的EGCG納米粒樣品加入到透析袋內(nèi),置于0.05 mol/L、100mL的緩沖液(pH5.5、pH7.4)中,37℃下避光緩慢攪拌。每隔1h定點(diǎn)取樣一次,直至完全釋放。通過(guò)HPLC測(cè)定EGCG含量,繪制釋放曲線,見(jiàn)圖2。由圖2可知,EGCG納米粒在pH5.5和pH7.4條件下的釋放率均比EGCG水溶液慢。
圖1 EGCG納米粒保留率
圖2 EGCG納米粒體外釋放率
通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究不同因素對(duì)β-LG和EGCG結(jié)合成納米粒的影響。β-LG濃度、EGCG濃度、緩沖液pH、熱激溫度對(duì)制備出的納米粒的粒徑、穩(wěn)定性、包封率和載藥量均有顯著影響。
穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和體外釋放率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,β-LG濃度為3mg/mL、EGCG濃度為0.8mg/mL、緩沖液pH為6.5、熱激溫度為75℃條件下制備的EGCG納米粒的保留率明顯高于EGCG水溶液,在pH5.5和為pH7.4條件下釋放率均小于EGCG水溶液,說(shuō)明EGCG-β-LG納米粒有一定的緩釋性能。