劉建新 歐曉彬 王金成

(甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室/隴東學院生命科學與技術學院,慶陽 745000)

種子萌發(fā)是作物生活周期的開始，也是抵御環(huán)境脅迫最為脆弱的階段。裸燕麥(Avenanuda)禾本科(Gramineae)燕麥屬(Avena)一年生雜糧作物，在我國北方廣泛種植，土壤較高的鹽堿含量成為其種子萌發(fā)和成苗的重要脅迫因素[1]。硫化氫(Hydrogen sulfide,H2S)是近幾年在植物體內發(fā)現(xiàn)的一種新型氣體信號分子，它參與植物生長發(fā)育和逆境響應調節(jié)。如H2S作為下游信號與生長素共同誘導番茄(Lycopersiconesculentum)側根的形成[2]，維持鹽脅迫下紫花苜蓿(Medicagosativa)胞內K+/Na+平衡[3]，通過減輕光抑制增強黃瓜(Cucumissativus)幼苗的耐冷性[4]等。外源H2S在植物種子萌發(fā)過程中發(fā)揮著重要的調控作用。研究表明，外源H2S通過提高β-淀粉酶活性促進小麥(Triticumaestivum)種子萌發(fā)[5]并提高干旱脅迫下小麥萌發(fā)苗存活率[6]；外源H2S還通過促進種子吸脹和提高活性氧清除能力緩解干旱對水稻(Oryzasativa)種子萌發(fā)的抑制[7～8]；并促進銅脅迫小麥萌發(fā)種子淀粉酶和酯酶活性[9]；激活鹽脅迫下苜蓿種子萌發(fā)過程中抗氧化酶同工酶活性和提高相應轉錄物水平[10]。然而，H2S調控植物種子萌發(fā)對逆境響應的信號傳導機制目前尚不十分清楚。

鈣離子(Ca2+)作為第二信使，參與植物對逆境響應的調節(jié)。植物遭受鹽脅迫時質膜Ca2+/H+反向轉運蛋白表達增強[11]，導致細胞溶質Ca2+濃度改變[12]，并通過鈣調蛋白級聯(lián)傳導調控細胞的分裂和伸長[13]。有研究表明，Ca2+和H2S通過調控重金屬離子轉運蛋白增強谷子(Setariaitalica)對鉻脅迫的耐受性[14]；Ca2+還參與H2S調控的煙草(Nicotianatabacum)耐熱過程[15]及鹽堿脅迫下NO和H2O2對植物種子萌發(fā)的促進[16～17]。H2S在調控植物逆境響應過程中與NO、H2O2、Ca2+等信號存在相互作用，如H2S作為H2O2的上游信號促進綠豆(Vignaradiata)種子的萌發(fā)[18]等。那么，鹽堿脅迫下H2S能否緩解對作物種子萌發(fā)的抑制，胞質Ca2+是否參與這一過程，目前尚未見報道。本研究以裸燕麥為材料，模擬其在甘肅栽培地的鹽堿環(huán)境，探討胞質Ca2+對H2S調控鹽堿脅迫下種子萌發(fā)的影響，旨為揭示H2S調控種子萌發(fā)機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試裸燕麥品種為“定莜9號”(種子購自甘肅省定西市農業(yè)科學研究院)。H2S供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)、胞外Ca2+螯合劑乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸[ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid,EGTA]、質膜Ca2+通道阻斷劑氯化鑭(lanthanum chloride,LaCl3)、液泡Ca2+釋放抑制劑釕紅(ruthenium red,RR)和內質網(wǎng)鈣泵阻斷劑毒胡蘿卜素(thapsigargin,Thaps)均為美國Sigma公司產(chǎn)品。參考文獻[16～17,19]及預實驗篩選，所用EGTA、LaCl3、RR和Thaps濃度分別為5 mmol·L-1、10 μmol·L-1、0.2 mmol·L-1和15 μmol·L-1。模擬甘肅省中部裸燕麥種植地鹽堿組成，按NaCl∶Na2SO4∶Na2CO3∶NaHCO3摩爾比為12∶8∶1∶9配制不同濃度的鹽堿混合溶液。

1.2 種子發(fā)芽試驗

1.2.1 鹽堿脅迫濃度和NaHS濃度篩選

挑選100粒裸燕麥健康種子，均勻擺放在直徑120 mm的培養(yǎng)皿中，濾紙作萌發(fā)床，分別加入6 mL濃度為15、30、45、60、75 mmol·L-1的鹽堿混合溶液或100、200、400、600、800、1 000 μmol·L-1的NaHS溶液，以加等量蒸餾水作對照，在培養(yǎng)箱中20℃培養(yǎng)，3次重復。以胚芽突破種皮2 mm為發(fā)芽標準，每隔12 h統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，共統(tǒng)計7 d。篩選適宜的鹽堿脅迫濃度和促進種子萌發(fā)的NaHS濃度。

1.2.2 鹽堿脅迫、NaHS和胞質Ca2+抑制劑交叉試驗

以篩選的鹽堿脅迫濃度溶液、NaHS濃度溶液與LaCl3、EGTA、RR、Thaps進行單一或交叉處理，蒸餾水作對照，用1.2.1發(fā)芽方法觀察對裸燕麥種子萌發(fā)的影響，重復3次。

發(fā)芽試驗7 d結束后測量胚根、胚芽長度和各自干重，方法見文獻[17]。然后分別計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽速率。

發(fā)芽勢(%)=發(fā)芽前3 d種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100

(1)

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽7 d后種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100

(2)

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt

(3)

式中：Gt為t天的種子發(fā)芽數(shù)；Dt為相應發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)(VI)=GI×S

(4)

式中：S為胚根和胚芽干重之和。

平均發(fā)芽速率(GV)=∑(D·n)/∑n

(5)

式中：D為種子置床起的天數(shù)，n為相應各天發(fā)芽的種子數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計分析

為綜合評價不同處理對種子萌發(fā)的影響，用公式U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽速率、胚根長和胚芽長的隸屬函數(shù)值：

U(Xi)，i=1,2,3,…,n

(6)

式中：Xi為發(fā)芽指標值；Xmin和Xmax為不同處理下相應發(fā)芽指標的最小值和最大值。

每一發(fā)芽指標的權重應用客觀賦權法進行計算：

Ij=Sj/Cj

(7)

式中：Ij是一個無量綱數(shù)；Sj是不同處理某一發(fā)芽指標的隸屬函數(shù)值U(Xi)；Cj是對照組某一發(fā)芽指標隸屬函數(shù)值U(Xi)的均值。

最后通過歸一化計算出每個發(fā)芽指標的權重Wj=Ij/∑Ij，隸屬函數(shù)綜合評價值D=[U(Xi)×Wj]。百分率數(shù)據(jù)均經(jīng)反正弦平方根轉換(y=arc sin[sqrt(x/100)])，采用SPSS 20.0軟件對所有數(shù)值進行單因素方差分析，SSR法差異顯著性檢驗(顯著性水平α=0.05)。所有數(shù)據(jù)結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 不同濃度鹽堿脅迫對裸燕麥種子萌發(fā)的影響

隨著鹽堿脅迫濃度增大，裸燕麥種子萌發(fā)受到明顯抑制，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽速率、胚根長和胚芽長顯著下降(表1)。與0 mmol·L-1對照相比，15 mmol·L-1鹽堿脅迫除平均發(fā)芽速率外即引起其他發(fā)芽指標的顯著下降，當鹽堿濃度為75 mmol·L-1時發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽速率、胚根長和胚芽長分別下降了87.4%、77.0%、89.3%、95.4%、83.0%、78.4%和44.2%。

表1 不同濃度鹽堿脅迫對裸燕麥種子萌發(fā)的影響

注：同列不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note：Different letters in the same column indicate significant difference between treatments atP<0.05,the same as below.

圖1 鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的隸屬函數(shù)綜合評價值 不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Fig.1 The comprehensive evaluation value of membership function for seed germination of naked oat under saline-alkali stress Different letters indicate significant difference at P<0.05,the same as below.

不同發(fā)芽指標對鹽堿脅迫濃度的響應存在差異，為綜合反映鹽堿濃度對裸燕麥種子萌發(fā)的影響，采用隸屬函數(shù)方法計算的上述發(fā)芽指標綜合評價值D隨鹽堿濃度的變化如圖1。從圖1可知，與0 mmol·L-1對照相比，15 mmol·L-1鹽堿脅迫引起D值顯著降低38.5%； 30 mmol·L-1處理D值降幅達73.1%，且與15 mmol·L-1處理的D值差異顯著；45～75 mmol·L-1處理的D值降幅為89.9%～97.9%。因此，選用30 mmol·L-1作為進一步實驗的鹽堿脅迫濃度。

2.2 不同濃度NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的影響

圖2A顯示，與0 μmol·L-1對照相比，100～1 000 μmol·L-1NaHS處理的裸燕麥種子萌發(fā)D值均有不同程度提高，其中200～800 μmol·L-1處理的差異顯著，而1 000 μmol·L-1處理的D值顯著低于200～800 μmol·L-1處理的D值并與100 μmol·L-1處理的D值差異不顯著。因此，用100～800 μmol·L-1NaHS分別與30 mmol·L-1鹽堿溶液共處理觀察對種子萌發(fā)的影響。結果如圖2B所示：100 μmol·L-1NaHS與鹽堿溶液共處理(C處理)的D值顯著高于單獨鹽堿溶液處理(B處理)，200、400和600 μmol·L-1NaHS與鹽堿溶液共處理(D、E、F)的D值與單獨鹽堿溶液處理(B)或C處理的D值差異不顯著，而800 μmol·L-1NaHS與鹽堿溶液共處理(G處理)的D值則顯著降低。表明外源H2S可緩解鹽堿脅迫對裸燕麥種子萌發(fā)的抑制，其中100 μmol·L-1NaHS的效果最好。

圖2 不同濃度NaHS(A)及NaHS與30 mmol·L-1鹽堿溶液共處理(B)對裸燕麥種子萌發(fā)的影響 A.對照；B.鹽堿脅迫；C.鹽堿脅迫+100 μmol·L-1 NaHS；D.鹽堿脅迫+200 μmol·L-1 NaHS；E.鹽堿脅迫+400 μmol·L-1 NaHS；F.鹽堿脅迫+600 μmol·L-1 NaHS；G.鹽堿脅迫+800 μmol·L-1 NaHSFig.2 Effects of different concentrations of NaHS and the co-treatment of NaHS and saline-alkali solution(30 mmol·L-1) on seed germination of naked oatA.Control；B.Saline-alkali stress；C.Saline-alkali stress+100 μmol·L-1 NaHS；D.Saline-alkali stress+200 μmol·L-1 NaHS；E.Saline-alkali stress+400 μmol·L-1 NaHS；F.Saline-alkali stress+600 μmol·L-1 NaHS；G.Saline-alkali stress+800 μmol·L-1 NaHS

圖3 EGTA對H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的影響 A.對照Control；B.EGTA；C.NaHS；D.NaHS+EGTA；E.鹽堿脅迫；F.鹽堿脅迫+EGTA；G.鹽堿脅迫+NaHS；H.鹽堿脅迫+NaHS+EGTAFig.3 Effects of EGTA on seed germination of naked oat promoted by H2S under saline-alkali stress A.Control; B.EGTA; C.NaHS; D.NaHS+EGTA; E.Saline-alkali stress; F.Saline-alkali stress+EGTA; G.Saline-alkali stress+NaHS; H.Saline-alkali stress+NaHS+EGTA

2.3 EGTA對H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的影響

與對照(A)相比，EGTA處理(B)使D值顯著下降了22.9%。EGTA與NaHS共處理(D)的D值顯著低于單獨NaHS處理(C)；EGTA與鹽堿脅迫共處理(F)的D值顯著低于單獨鹽堿脅迫處理(E)。鹽堿脅迫導致D值顯著下降(E與A相比)，增添NaHS顯著提高鹽堿脅迫下的D值(G與E相比)，EGTA顯著逆轉NaHS提高鹽堿脅迫下D值的作用(H與G相比)。EGTA是胞外Ca2+專一性螯合劑(圖3)。上述結果表明，胞外Ca2+水平下降顯著降低H2S對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的促進作用。

圖4 LaCl3對H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的影響 A.對照；B.LaCl3；C.NaHS；D.NaHS+LaCl3；E.鹽堿脅迫；F.鹽堿脅迫+LaCl3；G.鹽堿脅迫+NaHS；H.鹽堿脅迫+NaHS+LaCl3Fig.4 Effect of LaCl3 on seed germination of naked oat promoted by H2S under saline-alkali stress A.Control; B.LaCl3; C.NaHS; D.NaHS+LaCl3; E.Saline-alkali stress; F.Saline-alkali stress+LaCl3; G.Saline-alkali stress+NaHS; H.Saline-alkali stress+NaHS+LaCl3

圖5 RR對H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的影響 A.對照；B.RR；C.NaHS；D.NaHS+RR；E.鹽堿脅迫；F.鹽堿脅迫+RR；G.鹽堿脅迫+NaHS；H.鹽堿脅迫+NaHS+RRFig.5 Effect of RR on seed germination of naked oat promoted by H2S under saline-alkali stress A.Control; B.RR; C.NaHS; D.NaHS+RR; E.Saline-alkali stress; F.Saline-alkali stress+RR; G.Saline-alkali stress+NaHS; H.Saline-alkali stress+NaHS+RR

2.4 LaCl3對H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的影響

由圖4可知，與對照(A)相比，LaCl3處理(B)顯著降低了D值。LaCl3與鹽堿脅迫共處理(F)的D值顯著低于單獨鹽堿脅迫處理(E)。LaCl3顯著消減NaHS對鹽堿脅迫下D值的提升作用(H與G相比)。LaCl3阻斷胞外Ca2+的內流。說明限制胞外Ca2+向胞內的流動將抑制H2S對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的促進作用。

2.5 釕紅對H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的影響

由圖5可知，與對照(A)相比，釕紅RR處理(B)使D值顯著下降，NaHS處理下增添RR也使D值顯著降低(D與C相比)。鹽堿脅迫下增添RR導致D值有所下降(F與E相比)，且NaHS提高鹽堿脅迫下D值(G與E相比)的作用，在添加RR后被完全逆轉(H與G相比)。RR抑制液泡Ca2+向胞質的釋放。表明阻斷液泡Ca2+向胞質的轉移將降低H2S對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的促進作用。

2.6 Thaps對H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的影響

毒胡蘿卜素Thaps處理(B)與對照(A)相比，D值顯著下降。NaHS處理下添加Thaps也使D值顯著降低(D與C相比)。但鹽堿脅迫下添加Thaps處理(F)的D值與單獨鹽堿脅迫處理(E)的D值差異不顯著；NaHS提高鹽堿脅迫下D值(G與E比較)的作用在增添Thaps后也無顯著影響(H與G相比)(圖6)。Thaps是內質網(wǎng)鈣泵阻斷劑，單向抑制胞質Ca2+向內質網(wǎng)的轉運，從而誘導胞質Ca2+濃度的提高。表明阻斷胞質Ca2+向內質網(wǎng)的轉運對H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的影響不大。

圖6 Thaps對H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的影響 A.對照；B.Thaps；C.NaHS；D.NaHS+Thaps；E.鹽堿脅迫；F.鹽堿脅迫+Thaps；G.鹽堿脅迫+NaHS；H.鹽堿脅迫+NaHS+ThapsFig.6 Effect of thapsigargin(Thaps) on seed germination of naked oat promoted by H2S under saline-alkali stress A.Control; B.Thaps; C.NaHS; D.NaHS+Thaps; E.Saline-alkali stress; F.Saline-alkali stress+Thaps; G.Saline-alkali stress+NaHS; H.Saline-alkali stress+NaHS+Thaps

3 討論

種子萌發(fā)是植物完成生活周期的關鍵，也是對鹽堿脅迫最敏感的時期。已有的研究多以單一或少數(shù)萌發(fā)指標來反映鹽堿脅迫的影響[1,16]。本研究模擬甘肅鹽堿地鹽分組成，以發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽速率、胚根長和胚芽長七項發(fā)芽指標，采用隸屬函數(shù)綜合評價鹽堿脅迫對裸燕麥種子萌發(fā)的影響。結果表明，裸燕麥種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽速率、胚根長和胚芽長隨鹽堿脅迫強度提高明顯下降(表1)，隸屬函數(shù)綜合評價值D顯著降低(圖1)，其中30 mmol·L-1鹽堿脅迫的種子發(fā)芽率下降至對照的54.4%，D值降至對照的26.9%，表明鹽堿混合脅迫顯著抑制裸燕麥種子的萌發(fā)。這與前人以單一鹽脅迫抑制燕麥種子萌發(fā)的研究結果類似[1]，但鹽堿混合脅迫對種子萌發(fā)的抑制程度更大。

H2S作為植物內源新型氣體信號分子，參與植物種子萌發(fā)過程的調控[3]。外源H2S供體NaHS處理可緩解干旱脅迫對小麥[6]和水稻[7～8]種子萌發(fā)的抑制。10～130 μmol·L-1NaHS浸種能不同程度緩解100 mmol·L-1NaCl脅迫下小麥種子萌發(fā)指數(shù)和幼苗生長量的下降，其中以50 μmol·L-1NaHS的作用效果最好[20]。本試驗表明，100～1 000 μmol·L-1NaHS能不同程度增強裸燕麥種子萌發(fā)的隸屬函數(shù)綜合評價值D(圖2A)，30 mmol·L-1鹽堿脅迫下外施100～800 μmol·L-1NaHS不同程度提高了裸燕麥種子萌發(fā)的D值(圖2B)，其中100 μmol·L-1NaHS的效果最好。說明適宜濃度的H2S能夠緩解鹽堿脅迫對裸燕麥種子萌發(fā)的抑制。其原因一方面可能與外源H2S能夠提高脅迫條件下萌發(fā)種子淀粉酶和酯酶活性、增強種子抗氧化能力有關[21]；另一方面可能是H2S能夠抑制鹽誘導的K+外流和增強Na+外排，維持K+/Na+平衡，從而減輕鹽離子毒害所致[22]。有研究表明，H2S通過NO途徑提高紫花苜蓿種子萌發(fā)過程中對鹽脅迫的耐受性[10]；NO促進干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)的過程通過Ca2+信號傳導通路[23]；鹽脅迫下NO促進玉米種子萌發(fā)的過程有Ca2+參與[16]；Ca2+也參與H2O2對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的促進[17]。而H2S調控植物種子萌發(fā)對逆境響應的過程通常與NO、H2O2及Ca2+等信號存在“交叉對話”[18]；H2S和植物激素脫落酸(ABA)在調節(jié)植物根生長和氣孔運動中也相互影響[24]。那么，胞質Ca2+濃度改變對H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的作用有無影響，本研究利用藥理學實驗發(fā)現(xiàn)，在100 μmol·L-1NaHS顯著促進30 mmol·L-1鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的過程中，當分別添加EGTA(胞外Ca2+螯合劑)、氯化鑭(細胞膜Ca2+通道阻斷劑)和釕紅(液泡Ca2+釋放抑制劑)后均顯著逆轉了NaHS的作用(圖3～5)，而添加毒胡蘿卜素(內質網(wǎng)鈣泵阻斷劑)對NaHS的作用無顯著影響(圖6)。說明胞質Ca2+參與H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的信號傳導過程，且胞質Ca2+主要來源于胞外Ca2+的內流和液泡中Ca2+的釋放。

Knight[25]指出，鹽脅迫引發(fā)的細胞質Ca2+增加除來自胞外Ca2+內流外還有三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-triphosphate,IP3)介導的液泡Ca2+的釋放。李洪旺等[19]研究表明，H2S通過促進胞外Ca2+內流和胞內鈣庫Ca2+釋放提高了保衛(wèi)細胞胞質Ca2+濃度，從而促進H2O2產(chǎn)生，誘導擬南芥氣孔關閉。H2S增強擬南芥根系耐鹽性需要H2O2的參與[26]。液泡膜上Ca2+通道有2種：一種是受IP3調節(jié)的Ca2+通道；另一種是受電壓門控的Ca2+通道[27]。在谷子響應鉻離子(Cr6+)脅迫的過程中，胞內H2S的產(chǎn)生受Ca2+調控，并以H2S依賴方式增強重金屬螯合劑編碼基因的表達，外施H2S促進Ca2+感知基因的表達[14,28]。而H2S緩解鹽堿脅迫對植物種子萌發(fā)抑制的過程中是如何調控質膜Ca2+內流以及通過什么方式調節(jié)液泡膜Ca2+釋放通道，外施H2S是否也通過提高內源H2S含量增強Ca2+感知基因表達以及這些過程中是否有H2O2等信號的介導等問題尚需進一步探究。

綜上所述，外源H2S能夠促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子的萌發(fā)；限制胞外Ca2+內流和液泡Ca2+向胞質釋放將消減H2S對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的促進作用。表明胞質Ca2+參與外源H2S促進鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)過程的調控。