錢玉梅，孫藝爽

（1.河南省腫瘤醫(yī)院 藥學部，河南 鄭州 450008；2.武漢大學 基礎醫(yī)學院，湖北 武漢 430071）

北芪五加片收載于中國藥典2015年版一部[1]，是由黃芪和刺五加浸膏加工而成的中成藥復方制劑，具有益氣健脾、寧心安神的功效，臨床多用于心脾兩虛、心神不寧所致的失眠多夢、體虛乏力、食欲不振等病癥的治療?，F(xiàn)行質(zhì)量標準中僅以黃芪甲苷作為質(zhì)量控制指標，未對處方中其他成分進行定量檢測，單一成分難以全面反映北芪五加片的整體質(zhì)量，文獻中也僅檢索到對該制劑中紫丁香苷的含量檢測[2]。中成藥復方制劑其臨床治療效果往往都是多個有效成分共同作用的結(jié)果，多指標控制模式已逐步應用于中成藥復方制劑的質(zhì)量控制。該制劑方中黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，性甘，味微溫，具有補氣升陽、固表止汗、生津養(yǎng)血等功效，主要含黃酮類、多糖類、皂苷類等成分，其中毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素等為其黃酮類主要成分，黃芪甲苷為其皂苷類主要成分，中國藥典2015年版一部黃芪藥材項下以黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡糖苷為其控制指標；方中刺五加浸膏為五加科植物刺五加的干燥根和根莖或莖經(jīng)加工制成的浸膏，中國藥典2015年版一部刺五加浸膏項下以紫丁香苷、刺五加苷E和異嗪皮啶為其控制指標。本試驗首次采用高效液相色譜（HPLC）波長切換技術，同時對北芪五加片中毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的含量進行測定，所建立的方法準確、簡便、靈敏，為北芪五加片質(zhì)量標準的提高和完善提供有力的實驗基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AG285型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-400KDE型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

毛蕊異黃酮葡糖苷對照品（批號：111920-201606，含量97.6 %），芒柄花素對照品（批號：111703-201504，含量100.0 %），紫丁香苷對照品（批號：111574-201605，含量95.2 %），刺五加苷E對照品（批號：111713-201804，含量97.9 %），異嗪皮啶對照品（批號：110837-201608，含量100.0 %，中國食品藥品檢定研究院）；芒柄花苷（批號：486-62-4，含量95.0 %），毛蕊異黃酮（批號：20575-57-9，含量98.0 %，上海純優(yōu)）；北芪五加片（規(guī)格：每片重0.5 g，批號：180805，181025，190127，山西晉新雙鶴藥業(yè)）；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為30 ℃；流動相為乙腈-0.1 %磷酸溶液，梯度洗脫（0～11.0 min，29.0 %A；11.0～34.0 min，29.0 %A→37.0 %A；34.0～49.0 min，37.0 %A→42.0 %A；49.0～55.0 min，42.0 %A→ 29.0 %A），流速為1.0 ml/min；檢測波長分別為254 nm（0～34.0 min，檢測毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素）[3-4]和220 nm（34.0～55.0 min，檢測紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶）[1,5]；進樣量為10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶對照品適量，用50 %甲醇制成每1 ml含毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶分別為0.676，0.932，0.894，2.736，0.598，0.352，0.138 mg的單成分對照品儲備溶液；再分別精密吸取上述單成分對照品儲備溶液各2.5 ml，用50 %甲醇制成混合對照品溶液（各對照品濃度分別為：毛蕊異黃酮葡糖苷33.8 mg/L、芒柄花苷46.6 mg/L、毛蕊異黃酮44.7 mg/L、芒柄花素136.8 mg/L、紫丁香苷29.9 mg/L、刺五加苷E17.6 mg/L、異嗪皮啶6.9 mg/L）。

2.2.2 供試品溶液 取北芪五加片適量，除去薄膜衣，研細，取1.0 g，精密稱定，加50 %甲醇25 ml，密塞，稱重，超聲提取30 min，放冷，50 %甲醇補重，搖勻，過濾，制成北芪五加片供試品溶液，備用。

2.2.3 陰性樣品溶液 按中國藥典2015年版一部北芪五加片項下的處方比例及工藝，分別制備缺黃芪、缺刺五加浸膏的陰性樣品，按2.2.2項方法操作，制成兩種陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應性試驗

分別精密吸取2.2項下制備的4種溶液各適量，按2.1項色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。結(jié)果顯示所記錄色譜圖基線平穩(wěn)，北芪五加片中所測定成分毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶與其他峰均能達到有效分離，分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)按所測定成分色譜峰計均大于4000；陰性樣品在所測各成分的保留時間處無色譜峰干擾，色譜圖見圖1。

圖1 北芪五加片HPLC色譜圖

2.4 線性關系考察

分別精密吸取2.2.1項下單成分對照品儲備溶液各0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 ml，用50 %甲醇稀釋成系列混合對照品溶液，依法進樣檢測，以毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶峰面積y為縱坐標，質(zhì)量濃度x為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程，以10倍信噪比計算各待測成分的定量限（LOQ），結(jié)果見表1。

表1 線性關系試驗結(jié)果

2.5 精密度試驗

取2.2.1項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的峰面積。結(jié)果所測定成分峰面積的RSD分別為0.72 %，0.66 %，1.61 %，0.54 %，1.12 %，0.89 %和1.31 %。

2.6 重復性試驗

取同一批次北芪五加片樣品，按2.2.2項下方法平行制備供試品溶液6份，依法測定測得毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的峰面積，計算所測定成分含量。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的平均含量分別為0.885，1.221，1.031，3.679，0.718，0.391，0.148 mg/g，RSD分別為1.17 %，1.08 %，0.25 %，1.24 %，1.73 %，0.86 %和1.92 %。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗

取同一份北芪五加片供試品溶液，于0，2，4，8，16，24 h依法進樣測定，記錄毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的峰面積。結(jié)果北芪五加片供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定（室溫），毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶峰面積的RSD分別為0.69 %，0.73 %，1.59 %，0.56 %，1.08 %，1.72 %和1.29 %。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶峰對照品適量，用50 %甲醇制成每1 ml分別含上述對照品0.446，0.608，0.522，1.836，0.352，0.198，0.074 mg的加標用混合對照品溶液。取同一批次已知含量的北芪五加片9份，除去薄膜衣，研細，每份0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入加標用混合對照品溶液0.5 ml 3份、1.0 ml 3份、1.5 ml 3份（對照品加入量約相當于樣品含有量的50 %，100 %，150 %），按2.2.2項方法制成加樣回收樣品溶液，依法進樣檢測毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的峰面積，計算回收率及RSD值，結(jié)果見表2。

表2 毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的回收率試驗結(jié)果

續(xù)表接上頁

2.9 樣品測定

取3個批次的北芪五加片，分別按2.2.2項下方法每個批次平行制備3份供試品溶液，按2.1項下色譜條件檢測毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的峰面積，計算測定成分的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 北芪五加片制備方法的優(yōu)化

試驗中首先考察提取溶劑對毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶提取率及色譜峰峰形的影響。在超聲提取60 min的同一條件下，選取甲醇[1,3-4,6]、50 %甲醇[1-2,5,7]、乙醇、50 %乙醇為提取溶劑，結(jié)果以50 %甲醇為提取溶劑時，毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶綜合提取率最佳，同時待測成分色譜峰峰形較好；采用50 %甲醇為提取溶劑，對比了超聲提取[1-7]、加熱回流提取[8]、微波輔助提取的提取效率，結(jié)果3種提取方式下待測定成分毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶綜合提取率差異不大，考慮到供試品溶液制備的便捷性和試驗操作的可普及性，選取超聲提取作為北芪五加片供試品溶液的制備方式；同時對超聲時間進行了進一步摸索，最終確定采用50 %甲醇超聲提取30 min用于制備北芪五加片供試品溶液。

表3 含量測定結(jié)果（n=3，mg/g）

3.2 流動相的優(yōu)化

在確定流動相時，首先考察了乙腈-水[4,8]、甲醇-水[2]流動相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水為流動相時待測定成分芒柄花苷、芒柄花素達不到基線分離，以乙腈-水為流動相時待測成分毛蕊異黃酮、紫丁香苷、異嗪皮啶峰存在拖尾；對此作者又考察乙腈-0.1 %甲酸溶液[1,3]、乙腈-0.1 %磷酸溶液[1,5-6]流動相系統(tǒng)，最終確定采用乙腈-0.1 %磷酸溶液為流動相，按2.1項下流動相比例對待測成分毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶進行梯度洗脫，在該流動相條件下，所記錄色譜圖基線平穩(wěn)，待測成分毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶峰形對稱，分離度符合規(guī)定要求。

3.3 檢測波長的選擇

在檢測波長的選擇過程中，分別取待測成分對照品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果毛蕊異黃酮葡糖苷在219，254 nm和290 nm處有較大吸收，毛蕊異黃酮在218，253 nm和291 nm處有較大吸收，芒柄花苷在255 nm和301 nm處有較大吸收、芒柄花素在254 nm和300 nm處有較大吸收，紫丁香苷在220 nm和264 nm處有較大吸收，刺五加苷E在221 nm和272 nm處有較大吸收，異秦皮啶在223 nm和341 nm處有較大吸收，同時參考相關文獻[1,3-5]，最終確定采用波長切換法，毛蕊異黃酮葡糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的檢測波長為254 nm，紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的檢測波長為220 nm，在此波長條件下，待測成分色譜峰分離效果較好，峰形較佳，雜質(zhì)峰干擾少，靈敏度較高。

本研究首次建立一種HPLC波長切換法同時測定北芪五加片中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的含量，方法簡便，準確，重現(xiàn)性好，可實現(xiàn)對北芪五加片多種有效成分的質(zhì)量控制，為其質(zhì)量標準的提高提供了可靠的數(shù)據(jù)依據(jù)。