曹 梅，胡 珊，崔 瑜，尹 恒，張晶晶，樊秦娥，劉雪琴

(十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 十堰 442000)

盆腔炎(PID)是由多種細(xì)菌感染引起的女性上生殖道炎癥，通常涉及子宮，輸卵管和卵巢，嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量，可導(dǎo)致嚴(yán)重的后遺癥，如輸卵管性不孕，異位妊娠和慢性盆腔疼痛[1-2]。研究表明[3]，盆腔炎是卵巢癌的潛在危險(xiǎn)因素，尤其是亞洲女性，最常見的病原體為淋病奈瑟球菌、沙眼衣原體、解脲脲支原體,此外金黃色葡萄球菌、大腸桿菌也與盆腔炎的發(fā)病有關(guān)[4]。目前臨床上對(duì)盆腔炎的主要治療方法是抗生素治療，其中阿奇霉素單藥治療或阿奇霉素與甲硝唑聯(lián)合治療具有良好的治療效果[5]。此外，包括頭孢曲松，頭孢西丁，多西環(huán)素和甲硝唑在內(nèi)的幾種抗生素也對(duì)盆腔炎癥提供了良好的抗菌效果和較高的臨床治愈率。但細(xì)菌耐藥性和藥物副作用是臨床使用抗生素不可忽視的問題，因此，迫切需要找到新的補(bǔ)充和替代治療盆腔炎的藥物。加味大黃牡丹皮湯由大黃10 g、牡丹皮10 g、桃仁10 g、赤白芍10 g、紅藤25 g、忍冬藤20 g、敗醬草15 g、酒延胡索15 g、丹參10 g，生甘草6 g組成，方中大黃和牡丹皮具有良好的抗炎作用；桃仁促進(jìn)血液循環(huán)，消除血瘀；冬瓜仁排膿消腫；芒硝軟堅(jiān)散積，諸藥合用蕩熱祛瘀[6-7]。本研究采用急性盆腔炎大鼠模型，研究加味大黃牡丹皮湯對(duì)大鼠子宮、卵巢的保護(hù)作用及NF-κB信號(hào)通路的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器CryoStarTMNX70型病理冰凍切片機(jī)(美國賽默飛世爾公司)；9700型PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)；SD-987型數(shù)顯電子天平(德國默克公司)；奧林巴斯CKX53型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；EPS-300 /HE90 /VE-186型電泳系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；ImagePro plus6.0圖像分析軟件(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2 試藥加味大黃牡丹皮湯購自重慶市中醫(yī)院中藥房；潑尼松(廣東眾生藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20110107)；黃體酮(浙江仙琚制藥有限公司，批號(hào)：20180124)；大腸桿菌(北納生物科技有限公司，菌種號(hào)22162)；金黃色葡萄球菌(北納生物科技有限公司，菌種號(hào)38113)；解脲脲原體(北納生物科技有限公司，菌種號(hào)23011)；IL-6、IL-8、TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：112311、150279、152279)；兔抗大鼠NF-κBp65、IκB-α多克隆抗體(美國Sigma公司，批號(hào)：9323、9121)；Trizol試劑盒(美國Santa Cruz公司，批號(hào)：112311)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(美國ABCAM公司，批號(hào)：RQ118A)；引物序列(美國Invitrogen公司，批號(hào)：SC-522、KB-118、CA-445)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取成年雌性健康SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物證書號(hào)：SCXK2012-0042。在受控溫度和濕度的環(huán)境下，將大鼠圈養(yǎng)在12 h光照/黑暗循環(huán)且相對(duì)濕度在60%～65%的環(huán)境中，自由進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)批準(zhǔn)，符合美國國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和管理指南。

1.4 分組與造模方法在40只SD大鼠中隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組，剩余30只SD大鼠建立模型。參照文獻(xiàn)[7]制備大鼠急性盆腔炎模型，大鼠在造模前1周皮下注射10 mg黃體酮，并適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，通過腹膜內(nèi)注射20%的氨基甲酸乙酯麻醉，用注射器插入子宮腔并沿著子宮壁來回拉動(dòng)造成子宮內(nèi)膜組織損傷。制備0.3 mL的多病原體溶液(金色葡萄球菌1×108CCU/mL、大腸桿菌1×108CCU/L、解脲脲原體1×108CCU/L)，將溶液注射進(jìn)大鼠卵巢后倒置大鼠5 min。該感染過程每2天進(jìn)行1次，共進(jìn)行4次，每次感染后用70%酒精進(jìn)行表面消毒。對(duì)照組大鼠采取同樣操作，用同等體積的生理鹽水代替多病原體溶液，且不用注射器造成子宮內(nèi)膜損傷。大鼠造模成功后，隨機(jī)分為模型組、加味大黃牡丹皮湯組、阿奇霉素組，每組10只。第1次感染8 d后，加味大黃牡丹皮湯組大鼠灌胃給予加味大黃牡丹皮湯提取物6 g/kg體質(zhì)量，阿奇霉素組大鼠灌胃給予阿奇霉素1.7mg/kg體質(zhì)量，模型組和對(duì)照組大鼠灌胃給予相同體積的生理鹽水。

1.5 標(biāo)本采集與測(cè)定方法各組大鼠第1次感染8 d后皮下注射戊巴比妥30 mg/kg體質(zhì)量進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL，收集右側(cè)子宮和卵巢保存于-80℃冰箱中，將左側(cè)子宮和卵巢浸入10%福爾馬林溶液中，頸椎脫臼處死大鼠。(1)組織學(xué)評(píng)價(jià)：將大鼠左側(cè)子宮和卵巢進(jìn)行石蠟包埋，切成2 μm切片，用蘇木精和伊紅(HE)染色，光鏡下(×200)檢查每個(gè)載玻片的三個(gè)組織結(jié)構(gòu)和病變特點(diǎn)，通過評(píng)估炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)程度(0分～3分)，對(duì)每個(gè)子宮和卵巢的炎癥進(jìn)行評(píng)分[8]。(2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：將大鼠血液靜置30 min，離心后取上層血清，按ELISA試劑盒按說明書步驟檢測(cè)血清中IL-6、IL-8、TNF-α的含量。(3)蛋白質(zhì)印跡法(Western-Blot)檢測(cè)NF-κBp65、IκBα蛋白表達(dá)水平：將子宮和卵巢組織在含有1%苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液中勻漿，勻漿后取上清液，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，并在4℃下與NF-κB/IκBα一抗(1∶1 000)孵育過夜，洗滌后添加辣根過氧化物酶的二抗(1∶1 000)溫育2 h。二抗孵育后顯色、曝光、顯影。并以β-actin 為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)光密度值(ROD)。(4)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：通過Trizol試劑提取大鼠子宮和卵巢組織中的總RNA(20 mg)，按試劑盒說明書操作進(jìn)行，用氯仿處理RNA，在4℃，12 000 r/min離心20 min,并用75%乙醇沉淀，將來自子宮樣品的總RNA(1 μg)在20 μL的反應(yīng)體積中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將合成的cDNA保存在-20℃中，并使用SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)得各組大鼠子宮中NF-κBp65、IκBα RNA的表達(dá)水平。子宮組織中的NF-κBp65的序列為：上游5′-CAAGATGGTCGCTCGTAATT-3′，下游5′-ACGGCATTGCTGATCTGGAT-3′；IκB-α的序列為：上游5′-ACTCCCATAAGCCTGCTGAT-3′,下游5′-ATGCCCTTGGGTTGATCGTG-3′；β-actin 的序列為：上游 5′-TGACCCAACTTGCAGCTCCA-3′，下游 5′-TCATCCACATGAACTAGGTC-3′。擴(kuò)增條件：95℃持續(xù)10 s用于變性，55℃持續(xù)10 s用于復(fù)性，72℃持續(xù)15 s用于延長(zhǎng)。β-actin擴(kuò)增條件：95℃持續(xù)1 min用于變性，57℃持續(xù)45 s用于復(fù)性，72℃持續(xù)45 s用于延長(zhǎng)，在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮和卵巢的組織學(xué)切片比較模型組大鼠子宮和卵巢可見大量炎癥細(xì)胞，包括大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，表明上生殖道炎癥的發(fā)生。與對(duì)照組比較，模型組、加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組大鼠子宮和卵巢炎癥細(xì)胞的組織學(xué)半定量評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，加味大黃牡丹皮湯組、阿奇霉素組大鼠子宮和卵巢中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)減少，子宮和卵巢炎癥細(xì)胞組織學(xué)半定量評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表示，見圖1-2。

表1 各組大鼠子宮、卵巢炎癥細(xì)胞組織學(xué)半定量評(píng)分比較 分)

注：與對(duì)照組比較：▲P<0.05；與模型組比較：▲#P<0.05。

2.2 各組大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量比較與對(duì)照組比較，模型組、加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

對(duì)照組

模型組

加味大黃牡丹皮湯組

阿奇霉素組

圖1 子宮組織病理檢測(cè)結(jié)果(HE染色,×200)

對(duì)照組

加味大黃牡丹皮湯組

阿奇霉素組

圖2 卵巢組織病理檢測(cè)結(jié)果(HE染色,×200)

表2 各組大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α的含量比較

注：與正常對(duì)照組比較：▲P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

2.3 各組大鼠子宮組織中NF-κBp65、IκBα相對(duì)蛋白表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較，模型組大鼠子宮組織中NF-κBp65、IκBα相對(duì)蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組大鼠子宮組織中NF-κBp65、IκBα相對(duì)蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 各組大鼠子宮組織中NF-κBp65、IκBα相對(duì)蛋白表達(dá)水平比較

注：與正常對(duì)照組比較,▲P<0.05；與模型組比較,#P<0.05。

2.4 各組大鼠卵巢組織中NF-κBp65、IκBα相對(duì)蛋白表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較，模型組大鼠卵巢組織中NF-κBp65、IκBα相對(duì)蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組大鼠卵巢組織中NF-κBp65、IκBα相對(duì)蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

圖3 各組大鼠子宮組織中NF-kBp65、IκBα蛋白表達(dá)電泳圖

表4 各組大鼠子宮組織中NF-κBp65、IκB-α相對(duì)蛋白表達(dá)水平比較

注：與正常對(duì)照組比較：▲P<0.05；與模型組比較：#P<0.05。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為盆腔炎癥主要病因是盆腔組織中細(xì)菌或萄球菌、大腸桿菌、解脲脲原體在內(nèi)的病原體的直接或間接感染[9]。研究表明中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到脂多糖誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎小鼠的子宮內(nèi)膜，當(dāng)大量中性粒細(xì)胞達(dá)到感染部位的組織時(shí)，會(huì)導(dǎo)致組織損傷并導(dǎo)致上生殖道結(jié)構(gòu)性疾病[10-11]。本研究病理結(jié)果顯示模型組大鼠子宮和卵巢中可見大量的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)到上生殖道，通過對(duì)炎癥細(xì)胞的組織學(xué)半定量評(píng)分比較發(fā)現(xiàn)，模型組的評(píng)分最高，提示急性盆腔炎大鼠模型制備成功。在經(jīng)加味大黃牡丹皮湯和阿奇霉素治療后中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)相對(duì)減少，加味大黃牡丹皮湯組和阿奇霉素組組織學(xué)半定量評(píng)分降低，提示加味大黃牡丹皮湯對(duì)急性盆腔炎大鼠具有較好的抗炎作用。在炎性細(xì)胞因子中起主要作用的是TNF-α、IL-6、IL-8等[12]，其中TNF-α是炎癥過程中最早和最重要的炎癥介質(zhì)，它能夠激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[13]；IL-6可誘導(dǎo)T細(xì)胞活化、增殖和分化，B細(xì)胞分化和抗體產(chǎn)生，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，是炎癥反應(yīng)的誘發(fā)因素[14]；IL-8可破壞內(nèi)皮細(xì)胞，使微循環(huán)血瘀，組織壞死，并引起器官功能損害[15]。這些炎癥細(xì)胞因子在血清中的水平隨病原體感染和局部Toll樣受體識(shí)別免疫原而增加。有研究表明[16]，大黃可以通過降低血清中炎癥細(xì)胞因子如IL-6、IL-8和TNF-α的水平，起到對(duì)盆腔炎模型大鼠良好的治療效果。

NF-κB是促進(jìn)參與炎癥和免疫反應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子[17-18]。在大多數(shù)靜息細(xì)胞中，NF-κB因子和IκB因子共價(jià)結(jié)合并位于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)這些細(xì)胞表面的Toll樣受體識(shí)別病原體后，導(dǎo)致IκB因子磷酸化而降解，同時(shí)NF-κB因子將易位至細(xì)胞核并與NF-κB基因的順式原件發(fā)生反應(yīng)相結(jié)合，促進(jìn)其表達(dá)[19]。NF-κBp65和IκBα分別是子宮和卵巢中NF-κB因子和IκB因子的代表[20]，因此選擇其作為檢測(cè)NF-κB途徑是否在本次研究中被激活的指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)加味大黃牡丹皮湯對(duì)急性盆腔炎具有保護(hù)作用，能夠減少中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，抑制細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-α的過量產(chǎn)生,此外大鼠子宮內(nèi)多次感染病原體后，NF-κB信號(hào)通路被激活，大黃牡丹湯發(fā)揮其抗炎作用，具有阻斷NF-κB通路活化的作用。