郭慧慧，林叢發(fā)，蔣元斌，李志剛

(福建省寧德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 寧德 355017)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng)是安徽大別山特有的名貴珍中草藥，是蘭科多年生附生草本植物，含有活性多糖、生物堿等多種化合物[1]?，F(xiàn)代藥理研究證明，霍山石斛多糖具有抑制人胃癌細(xì)胞生長、延緩糖尿病性白內(nèi)障發(fā)展、保護(hù)四氯化碳致小鼠急性肝損傷等作用[2-4]。但由于霍山石斛種子繁殖力極低，生長周期長，生長環(huán)境要求極為苛刻，加上人為的過度采挖，自然資源已瀕臨滅絕[5]。隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，許多研究者開始利用這項(xiàng)技術(shù)解決石斛苗繁殖率低問題，而試管苗繁殖一般需經(jīng)過原球莖階段。原球莖是霍山石斛體細(xì)胞胚，具有和植株同樣的形態(tài)發(fā)育和物質(zhì)代謝的潛能[6]，且其具有生長周期短、繁殖率高等特點(diǎn)，可進(jìn)一步進(jìn)行代謝產(chǎn)物調(diào)控、生化、分子及蛋白質(zhì)組學(xué)分析[7-9]。因而探索原球莖增殖技術(shù)將是可持續(xù)開發(fā)霍山石斛資源的重要技術(shù)環(huán)節(jié)。

響應(yīng)面設(shè)計是以試驗(yàn)測量、經(jīng)驗(yàn)公式和數(shù)值分析為基礎(chǔ)，采用多元二次方程來擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系以尋求最優(yōu)工藝的一種統(tǒng)計學(xué)方法。相比于正交設(shè)計和均勻設(shè)計，具有試驗(yàn)次數(shù)少、精度高和模型預(yù)測性好等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛運(yùn)用于提取工藝和方法優(yōu)化等領(lǐng)域，能夠反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[10-12]。

本研究應(yīng)用響應(yīng)面分析法從不同濃度萘乙酸(NAA)、6-芐氨基嘌呤(簡稱6-BA)和馬鈴薯組合中確定最優(yōu)的霍山石斛原球莖增殖培養(yǎng)基，旨在為可持續(xù)開發(fā)霍山石斛資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萘乙酸與6-芐氨基嘌呤購于北京康倍斯科技有限公司；土豆購于福建寧德福安永輝超市；石斛種苗經(jīng)浙江大學(xué)董海濤教授鑒定為霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J Che)，試驗(yàn)所用原球莖由其種子誘導(dǎo)而來。

1.2 儀器與設(shè)備

JB-CJ-2FXS超凈工作臺，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；YXQ-LS-100G立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KJ-JD501榨汁機(jī)，康佳集團(tuán)股份有限公司；FA2204電子天平，上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1培養(yǎng)方法與條件 在無菌條件下將霍山石斛原球莖分別接種到所配制的增殖培養(yǎng)基中。設(shè)NAA濃度、6-BA濃度和馬鈴薯用量3個變量。每一個處理組均含：1/2MS+蔗糖30.0 g/L+瓊脂5.0 g·L-1+變量因子，pH 5.7～5.8,每處理10個平行，每瓶3簇，組培室培養(yǎng)條件為室溫(26±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx左右，光照時間12 h·d-1。

1.3.2單因素試驗(yàn)設(shè)計 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別探討NAA濃度、6-BA濃度和馬鈴薯用量對霍山石斛原球莖增殖率的影響?？刂茥l件6-BA、馬鈴薯和NAA的用量分別為1.0 mg·L-1、150 g·L-1和0.1 mg·L-1，變量因子水平設(shè)置見表1[13]。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計方案Table 1 Single factor experiment design

1.3.3增殖率 未分化原球莖質(zhì)量為接種60 d后所得的未分化原球莖質(zhì)量，未分化的原球莖呈淡綠色，頂端有葉原基，但無真葉分化[14]。

原球莖增殖率=[(未分化原球莖質(zhì)量-接種質(zhì)量)/接種質(zhì)量] ×100%

接種質(zhì)量=接種后瓶重-接種前瓶重

1.3.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計 在單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定NAA濃度、6-BA濃度、馬鈴薯用量3個因素的適宜范圍(表2)，以原球莖增殖率為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)原理進(jìn)行設(shè)計，確定試驗(yàn)所需總試驗(yàn)點(diǎn)[15-18]。

N=2f(f-1)+n

式中，N為所需試驗(yàn)點(diǎn)，f為需要優(yōu)化的因素數(shù)，n為中心點(diǎn)的個數(shù)。

本試驗(yàn)中f為3，n為5，共17個隨機(jī)試驗(yàn)運(yùn)行優(yōu)化。隨后對響應(yīng)面法得到的最優(yōu)方案進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計因素水平Table 2 Design level table of response surface methodology

1.3.5數(shù)據(jù)分析 單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理運(yùn)用的軟件為DPS7.05，采用最小顯著差數(shù)法(P<0.05，LSD)進(jìn)行不同處理間均值的顯著性差異比較。響應(yīng)面分析采用Design Expert 8.06軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NAA對霍山石斛原球莖增殖率的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑在培養(yǎng)基中的用量雖然微小，但是其作用很大。生長素在組織培養(yǎng)中的用途主要有誘導(dǎo)愈傷組織形成、誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂[19]。石斛生長發(fā)育過程中主要使用的生長素有IAA、NAA、IBA[20]。如圖1所示，NAA的不同添加量對霍山石斛原球莖增殖的影響。當(dāng)NAA濃度為0.1 mg ·L-1時，原球莖增殖率最大，NAA濃度太高或太低都會降低原球莖增值率。隨著NAA濃度的增加可觀察到分化的原球莖越來越多。

注：不同字母表示在不同處理下差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。Note: Different letters in the figure mean significant difference among treatments at P<0.05 level.圖1 NAA添加量對霍山石斛原球莖增殖率的影響Fig.1 Effect of NAA dose on protocorm proliferation rate of Dendrobium huoshanense

注：不同字母表示在不同處理下差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。Note: Different letters in the figure mean significant difference among treatments at P<0.05 level.圖2 6-BA添加量對霍山石斛原球莖增殖率的影響Fig.2 Effect of 6-BA dose on protocorm proliferation rate of Dendrobium huoshanense

2.2 不同濃度6-BA對霍山石斛原球莖增殖率的影響

細(xì)胞分裂素是由根尖合成而向上運(yùn)輸，主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂和器官分化，促進(jìn)側(cè)芽分化和生長，抑制頂端優(yōu)勢，延緩組織衰老等[21]。石斛生長發(fā)育過程中主要使用的細(xì)胞分裂素有ZT、KT和BA[20]。如圖2可知，6-BA濃度在0.5～1 mg·L-1時，隨著6-BA濃度的增加，原球莖增殖率也在增加；6-BA濃度在1～2 mg·L-1時，隨著6-BA濃度的增加，原球莖增殖率呈下降趨勢。

2.3 馬鈴薯對霍山石斛原球莖增殖率的影響

天然復(fù)合物對細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物[21]。石斛生產(chǎn)中常使用的天然復(fù)合物有香蕉汁、馬鈴薯汁及椰子汁等[22]。由圖3可知，隨著馬鈴薯濃度的增加，原球莖增殖率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，濃度為150 g·L-1時原球莖增殖率最高。

注：不同字母表示在不同處理下差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。Note: Different letters in the figure mean significant difference among treatments at P<0.05 level.圖3 馬鈴薯添加量對霍山石斛原球莖增殖率的影響Fig.3 Effect of potato dose on protocorm proliferation rate of Dendrobium huoshanense

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

三因素三水平的二次響應(yīng)面結(jié)果見表3?？梢钥闯?，NAA 0.1 mg·L-1，6-BA 1.5 mg·L-1，馬鈴薯添加量150 g·L-1時，原球莖增殖率最高，其均值2 820%～3 260%在之間。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken

利用Design Expert 8.06對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到的擬和全變量二次回歸方程各變量的方差分析如表4所示。

通過Design Expert 8.06軟件對表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬和，以原球莖增殖率(Y)為響應(yīng)值，NAA濃度(X1)、6-BA濃度(X2)和馬鈴薯用量(X3)為自變量，獲得回歸方程為：

Y=10 380X1+9 337X2+75.99X3-400X1X2-34.8X1X3-30.68X2X3-38 750X12-2 634X22-0.142 6X32-7 343.5

如表4所示，回歸模型的P=0.005 4，表明該模型是極顯著的。模型失擬項(xiàng)的P=0.118 4，表明模型失擬不顯著，而模型失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測值與實(shí)際值不擬合的概率[23]，即模型失擬項(xiàng)不顯著表明模型穩(wěn)定。模型的R2為0.914 4，說明回歸擬和程度較好。變異系數(shù)(C.V.)值為13.03%，說明模型方程能夠較好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)值。所以，可以使用該模型來預(yù)測NAA濃度、6-BA濃度和馬鈴薯濃度對霍山石斛原球莖增殖的影響。

從表4可見，NAA(X1)和6-BA(X2)濃度的一次項(xiàng)對原球莖增殖率的影響顯著(P<0.05)，而馬鈴薯用量(X3)的一次項(xiàng)對原球莖增殖率的影響不顯著(P>0.05)，可能是由于通過單因素試驗(yàn)已將馬鈴薯的濃度范圍縮小在一個較合適的區(qū)間，在這區(qū)間內(nèi)馬鈴薯濃度的變化對原球莖增殖率的影響不顯著。NAA濃度(X1)的二次項(xiàng)對原球莖增殖率的影響顯著(P<0.05)；6-BA濃度(X2)的二次項(xiàng)對原球莖增殖率的影響極顯著(P<0.01)；馬鈴薯用量(X3)的二次項(xiàng)對原球莖增殖率的影響不顯著(P>0.05)。6-BA濃度和馬鈴薯用量的交互項(xiàng)(X2X3)對原球莖增殖率的影響極顯著(P<0.01)，而NAA和6-BA濃度的交互項(xiàng)(X1X2)與NAA濃度和馬鈴薯用量的交互項(xiàng)(X1X3)對原球莖增殖率的影響不顯著(P>0.05)。

表4 響應(yīng)面模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface model

2.5 二次擬合響應(yīng)面分析

由回歸方程得到NAA濃度、6-BA濃度和馬鈴薯用量這3個因素間交互作用對霍山石斛原球莖增殖培養(yǎng)基影響的響應(yīng)曲面和等高線圖，如圖4～6所示。圖中等高線最小橢圓中心點(diǎn)即擬合曲面的最高點(diǎn)；而等高線的形狀又能反應(yīng)交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，越接近圓形表示兩因素交互作用越不顯著，越接近橢圓形表示兩因素交互作用越顯著[15]。由圖4～6可知，三個擬合曲面都具有最高點(diǎn)。從等高線形狀來看，6-BA濃度和馬鈴薯用量兩者交互作用變化非常明顯(圖6)，相比于NAA濃度和6-BA濃度(圖4)、NAA濃度和馬鈴薯用量(圖5)，交互作用非常顯著(P<0.01)。NAA濃度和6-BA濃度對增殖率的交互影響不顯著(圖4)，當(dāng)馬鈴薯用量位于中心水平(150 g·L-1)時，增殖率隨6-BA濃度和NAA濃度的增加均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。NAA濃度和馬鈴薯用量對增殖率的交互影響也不顯著(圖5)，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1時，增殖率隨NAA濃度和馬鈴薯濃度的增加均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

圖4 NAA和6-BA添加量對原球莖增殖率影響的響應(yīng)面曲面和等高線Fig.4 Response surface plot and contour plot showing the effects of NAA and 6-BA dose on protocorm proliferation rate

圖5 NAA和馬鈴薯添加量對原球莖增殖率影響的響應(yīng)面曲面和等高線Fig.5 Response surface plot and contour plot showing the effects of NAA and potato dose on protocorm proliferation rate

圖6 6-BA和馬鈴薯添加量對原球莖增殖率影響的響應(yīng)面曲面和等高線Fig.6 Response surface plot and contour plot showing the effects of 6-BA and potato dose on protocorm proliferation rate

應(yīng)用Design Expert 8.06軟件對二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行計算，確定最佳三因素組合為NAA濃度0.05 mg·L-1、6-BA濃度0.67 mg·L-1、馬鈴薯用量188.96 g·L-1，此條件下霍山石斛原球莖增殖率為3 193.79%?？紤]實(shí)際操作，將NAA濃度、6-BA濃度、馬鈴薯用量分別修正為：0.05 mg·L-1、0.70 mg·L-1、185 g·L-1。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到霍山石斛平均增殖率為2 989.82%±205.55%，與模型預(yù)測值3 193.79%非常接近。

3 討論

隨著野生資源的過度開采及市場需求的增加，利用離體快繁技術(shù)進(jìn)行原球莖增殖被認(rèn)為是解決霍山石斛藥源的有效途徑。而原球莖的生長受到植物生長調(diào)節(jié)劑、添加物、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基滲透壓等諸多因素的影響。戴傳云等[24]研究表明，高濃度的6-BA與低濃度的NAA組合，原球莖增殖系數(shù)大，增殖效果較好，NAA對原球莖增殖的影響大于6-BA。謝純[25]研究表明，當(dāng)NAA濃度固定時，隨6-BA濃度不斷升高，原球莖增殖速度加快，但當(dāng)濃度高于1.5 mg·L-1時，原球莖生長速度反而減慢；當(dāng)6-BA濃度固定時，NAA對原球莖增殖速度的影響表現(xiàn)為先增后減，濃度為0.5 mg·L-1時原球莖長勢最好，這與本研究的結(jié)果相似。肖小君等[26]研究表明，馬鈴薯汁可促進(jìn)鐵皮石斛原球莖增殖，且原球莖飽滿，顏色濃綠，長勢旺盛。蘇江[27]研究表明，甘露醇可用來調(diào)節(jié)石斛培養(yǎng)基滲透壓，添加低濃度的甘露醇可促進(jìn)石斛原球莖的生長。侯丕勇等[28]研究表明，減低固體基本培養(yǎng)基元素的含量有利于原球莖的生長，但不利于原球莖的分化。萬珠珠等[29]研究表明，相比塑料杯，玻璃瓶中的原球莖增殖系數(shù)大，萌發(fā)度高，生長健壯。

目前，石斛原球莖增殖因素優(yōu)化使用的方法多為單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計法，利用響應(yīng)面法優(yōu)化原球莖增殖培養(yǎng)基的方法尚未見報道。單因素試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計簡單，但忽略了因素之間的交互作用。正交試驗(yàn)可同時考慮幾種因素，尋求最佳組合，但無法找到整個區(qū)域的最優(yōu)值。本研究使用的響應(yīng)面法即可考察因素之間的交互作用，又可尋找到整個區(qū)域內(nèi)的最優(yōu)解，進(jìn)一步降低了培養(yǎng)基用量，從而降低成本。試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)確定了主要因素及因素最佳濃度存在的范圍后，再通過響應(yīng)面分析充分考慮NAA、6-BA和馬鈴薯之間的交互作用，并通過相應(yīng)曲面尋找最優(yōu)解。臧琛等[30]研究表明響應(yīng)面法可用于石斛真空冷凍干燥工藝條件的優(yōu)化，其建立的模型預(yù)測性較好。彭文書等[12]研究表明響應(yīng)面法建立的模型預(yù)測性良好，可用于石斛生根培養(yǎng)基的優(yōu)化。荊晶等[31]研究表明響應(yīng)面法可對微波輔助法提取石斛多糖工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，所得工藝穩(wěn)定可靠，方便可行。本研究應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化霍山石斛原球莖增殖培養(yǎng)基，以期為霍山石斛藥源工廠化生產(chǎn)提供理論和實(shí)踐依據(jù)。