陳祺, 顏帥帥, 許強華,2,3,4*

(1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院, 上海 201306; 2.上海海洋大學(xué)大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點實驗室, 上海 201306; 3.國家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心, 上海 201306;4.遠(yuǎn)洋漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 201306)

MicroRNAs廣泛存在于各種動植物基因組中，其長度約為21～23 nt，在物種進化過程中保持高度同源性和保守性，并且在物種中具有嚴(yán)格的表達特異性和時序性。到目前為止，已有數(shù)以千計的microRNAs在果蠅、線蟲、小鼠和人等多個物種中被發(fā)現(xiàn)[1]。研究顯示，microRNAs是一類重要的非編碼RNA, 不僅能在轉(zhuǎn)錄后mRNA水平上起調(diào)控作用，也能在轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)很多關(guān)鍵的生理進程和病理過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞命運決定、細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡等[2]。microRNAs在血管發(fā)育中也起重要作用，主要通過調(diào)控其靶基因來調(diào)控血液血管系統(tǒng)中的血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而抑制血管發(fā)育或使血管增生。

血管是生物體生存密不可分的一個器官，研究生物體血管發(fā)育能更進一步了解血管，并且能為治療血管的相關(guān)疾病提供一定基礎(chǔ)。雖然目前有眾多與血管發(fā)育相關(guān)的microRNAs被報道，但是仍有許多與血管發(fā)育相關(guān)的microRNAs未被發(fā)現(xiàn)。獨角雪冰魚(Chionodracohamatus) 是生活在南極深海零度以下水域的底棲性魚類，其血液中不含血紅蛋白和功能性血紅細(xì)胞。與含血紅蛋白的南極魚相比，獨角雪冰魚的心臟明顯增大，血管明顯變粗[3]。本課題組前期將獨角雪冰魚與相同生境下其他近緣南極魚血管中microRNAs的表達進行對比，發(fā)現(xiàn)包括miR-204在內(nèi)的多個microRNAs的表達存在顯著差異，推測miR-204可能參與了南極獨角雪冰魚的血管發(fā)育調(diào)控。

目前關(guān)于miR-204調(diào)控血管發(fā)育的研究較多，Jakob等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-204可以通過調(diào)控促血管生成素-1(angiopoienin-1)來調(diào)控小鼠角膜新生血管的發(fā)育。Cui 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-204-3p調(diào)控纖維連接蛋白1(fibronectin 1，F(xiàn)N1)抑制miR-204表達，從而阻塞FN1的附著能力，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在鈣化性主動脈瓣的疾病研究中，沉默表達?；撬嵘险{(diào)基因1(taurine upregulated gene 1，TUG1)會增加miR-204-5p的表達進而調(diào)控runt-related transcription factor 2(Runx2)的表達從而促進成骨分化[6]。而在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-204 mimics，會使血管內(nèi)皮生長因子和血小板生長因子表達降低[7]。不僅如此，在胃癌研究中，miR-204能調(diào)控JAK2-STAT3信號通路從而降低血管生成[8]。這些研究大多數(shù)都在細(xì)胞中進行，未能從機體層面進行研究。本研究擬在魚體上探究miR-204在血管發(fā)育初期對血管生成的作用，進一步探究miR-204對血管生成的調(diào)控機制。

本研究利用模式生物斑馬魚(Barchydaniorerio)，通過注射miR-204 antagomir抑制miR-204的表達，觀察斑馬魚胚胎血管發(fā)育情況，并對miR-204的靶向基因進行預(yù)測及驗證，探究miR-204在血管發(fā)育中的功能及調(diào)控機制，為后續(xù)揭示南極獨角雪冰魚血管補償性增生機制提供一定的基礎(chǔ)，有助于探索脊椎動物血管發(fā)育的作用機制，以期未來能應(yīng)用于與血管相關(guān)的疾病治療。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型斑馬魚(AB型)以及轉(zhuǎn)基因斑馬魚(kdrl: EGFP)在斑馬魚飼養(yǎng)實驗室(上海海生生物實驗設(shè)備有限公司)的封閉超濾超凈化水系統(tǒng)中飼養(yǎng)，循環(huán)水維持在28 ℃，光周期14 h/10 h(光照/黑暗)。

293細(xì)胞是轉(zhuǎn)染腺病毒的人腎上皮細(xì)胞系，293T細(xì)胞則是由SV40大型T抗原轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后得到。293T細(xì)胞容易轉(zhuǎn)染，且傳代速度快。采用含谷氨酰胺的 DMEM 高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，配以10%的胎牛血清以及1%的雙抗充分混合，培養(yǎng)條件為 37 ℃、5% CO2。當(dāng)細(xì)胞達到對數(shù)生長期時，可進行下一步試驗。

1.2 儀器和試劑

主要儀器包括：電子天平(BSA-223S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、體式顯微鏡(SMZ445，尼康儀器有限公司)、離心機(Centrifuge 5424R，Eppendorf)、磁力攪拌器(90-18，上海梅穎儀器儀表制造有限公司)、超純水凈化系統(tǒng)(P2PA7491，Millipore)、恒溫混勻儀(Eppendorf)、恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9082，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、電泳凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech)、PCR儀(S1000，BIO-RAD)。

主要試劑包括：miR-204 antagomir、NC(上海吉瑪基因)；T4連接酶、PVDF膜、顯影液(Thermo Fisher)；GFP、Actin(GenTex)；PMD18-T載體(Takara)；內(nèi)切酶(NEB)；感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司)；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(Omega)；胎牛血清(Gibico)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone)；轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)；蛋白胨、酵母粉、甲醇、氯化鈉、甘氨酸、Tris、脫脂奶粉、氨芐抗生素、卡那抗生素、20XPBS、蛋白marker、SDS、質(zhì)粒小提試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1目的序列設(shè)計 通過比對斑馬魚、羅非魚、人、小鼠的基因組發(fā)現(xiàn)，miR-204的種子序列高度保守(表1)。運用TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRBase(http://www.mirdb.org/)、starBase(http://www.starbasemn.org/)網(wǎng)站預(yù)測miR-204潛在靶基因，挑選與血管發(fā)生相關(guān)的5個候選基因，分別為sprouty-related EVH1 domain containing1 (spred1)、transforming growth factor beta1a (tgfβ1a)、vascular cell adhesion molecule 1b (vcam1b)、NADPH oxidase 4(nox4)、tribbles pseudokinase 3 (trib3) 。從NCBI數(shù)據(jù)庫分別獲得上述5個候選基因的3′UTR序列，根據(jù)所獲得的3′UTR 序列與miR204的結(jié)合位點, 由 Primer 5.0 軟件設(shè)計得到特異性引物序列，同時選取適合的酶切位點(表2)。分別構(gòu)建5個候選基因的pmir-GLO-3′UTR質(zhì)粒，運用雙熒光素報告酶基因檢測后選定trib3(CU571319.15)作為最終研究基因。

表1 miR-204在物種間的保守性Table 1 Conservation of miR-204 among species

表2 引物序列與限制性內(nèi)切酶Table 2 Primer sequence and restriction enzyme

1.3.2質(zhì)粒構(gòu)建 引物合成后，進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后進行割膠回收。取4 μL膠回收產(chǎn)物，加入5 μL Solution以及1 μL T載體16 ℃連接4 h，隨后進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆，37 ℃搖床進行培養(yǎng)，用通用引物進行PCR后進行測序。結(jié)果用 Vector NTI 7.0 軟件進行序列比對，測序正確的單克隆用 50 mL 離心管進行擴大培養(yǎng)，隨后進行質(zhì)粒抽提。提取后的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacⅠ、SalⅠ(pmirGLO-TRIB3-3′UTR質(zhì)粒)以及NotⅠ、MfeⅠ(Tol2-TRIB3-3′UTR質(zhì)粒)進行酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物 進行1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，分別與已進行酶切后的pmirGLO和Tol2質(zhì)粒在 16 ℃過夜連接。轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆，37 ℃搖床培養(yǎng)，用表2所述引物進行PCR擴增后進行測序。用 Vector NTI 軟件對測序序列進行比對。測序正確的單克隆用 50 mL 離心管進行擴大培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒進行質(zhì)粒中提，得到最終質(zhì)粒。

1.4 斑馬魚血管觀察

將性成熟的斑馬魚于前一夜進行交配，取其產(chǎn)的受精卵，使用顯微注射技術(shù)將1 nL 的miR-204 antagomir(50 μmol·L-1)和NC(50 μmol·L-1)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，注射到轉(zhuǎn)基因斑馬魚(kdrl：EGFP)一細(xì)胞期的受精卵內(nèi)，每組分別各注射100枚受精卵。以未注射的斑馬魚受精卵(CK)為對照，置于28 ℃環(huán)境下培養(yǎng)5 d后進行拍照觀察斑馬魚胚胎血管發(fā)育情況。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及酶活檢測

接種293T細(xì)胞于24孔板中，每孔加入配制好的完全培養(yǎng)基500 μL 以及50 μL 處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。待293T細(xì)胞密度約為80%時，取400 ng pmirGLO-TRIB3-3′UTR質(zhì)粒+ miR-204mimics (處理組，T)、400 ng pmirGLO-TRIB3質(zhì)粒+ NC(陰性對照組，NC)、400 ng pmirGLO-TRIB3-3′UTR質(zhì)粒 (空白對照組，CK)加入無血清的基本培養(yǎng)基中進行共轉(zhuǎn)染，短暫旋渦混勻，立即加入 1.5 μL 轉(zhuǎn)染試劑。室溫放置 15 min 后逐滴加至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6 h后吸出無血清的基本培養(yǎng)基，每孔加入500 μL 新鮮完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)26 h后收集細(xì)胞。

雙熒光素酶報告系統(tǒng)一般用來做miRNA靶標(biāo)鑒定。采用 Dual-Luciferase?報告基因檢測試劑盒(Promega, USA)檢測熒光素酶活性，并計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值(Firefly Luc/Renilla Luc)。

1.6 TRIB3蛋白的熒光表達及蛋白免疫印跡

將性成熟的斑馬魚于前一夜進行交配，取其產(chǎn)的受精卵，使用顯微注射技術(shù)將1 nL 的miR-204(50 μmol·L-1) 和NC(50 μmol·L-1)分別與100 ng 的Tol2-TRIB3-3′UTR共注射到一細(xì)胞期的斑馬魚受精卵內(nèi)，空質(zhì)粒(CK)單獨注射至受精卵中，每組分別各注射50顆受精卵。24 h后在熒光顯微鏡進行拍照觀察GFP熒光強度變化。并收集受精卵，用于熒光蛋白表達的檢測。

將收集的斑馬魚受精卵，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌3次，然后用RIPA緩沖液(Beyotime，中國)和蛋白酶抑制劑PMSF(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)在冰上裂解30 min，提取GFP蛋白質(zhì)。使用8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠從每個樣品中分離相同量(100 μg)的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Millipore，Billerica，NY，USA)上。用含5%脫脂牛奶的1%PBST溶液封閉后，將膜在室溫下與抗-GFP(1∶2 000，GT859; GeneTex)一抗孵育1 h，用1×PBST洗滌3次，每次5 min，并在室溫下與二抗(1∶2 000)一起溫育1 h。使用BioRad Western印跡系統(tǒng)(Hercules，CA，USA)使蛋白質(zhì)條帶可視化。

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2010進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 7.0進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 注射miR-204對斑馬魚血管的影響

在轉(zhuǎn)基因斑馬魚(kdrl：EGFP)中注射miR-204 antagomir(T)及陰性對照(NC)后，用熒光顯微鏡觀察斑馬魚胚胎血管發(fā)育情況，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，與NC、CK的受精卵相比，注射miR-204的斑馬魚軀干部毛細(xì)血管增多，節(jié)間血管增多。結(jié)果表明，抑制miR-204使斑馬魚胚胎毛細(xì)血管增加，miR-204可能參與斑馬魚胚胎血管發(fā)育的調(diào)控。

注：白色箭頭指毛細(xì)血管增生。Note: The white arrows indicate capillary proliferation.圖1 不同處理的斑馬魚胚胎血管發(fā)育情況Fig.1 Vascular development of zebrafish embryos in different treatments

2.2 共轉(zhuǎn)染miR-204和trib3后酶活變化

共轉(zhuǎn)染miR-204和trib3至293T細(xì)胞后，檢測熒光蟲熒光素酶活性以及海腎熒光酶活性，隨后計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，處理T與NC和CK相比，其相對酶活均極顯著下降，表明注射miR-204后斑馬魚的TRIB3活性降低，即miR-204對trib3有抑制作用。

注： **表示處理間在P<0.01水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Note: **indicate extremely significant difference between treatments at P<0.01 level.圖2 不同處理方式的雙熒光素酶活比值Fig.2 Activity ratio of double luciferase under different treatments

2.3 共注射miR-204與trib3后GFP蛋白強度變化

為進一步探究miR-204對trib3的抑制作用，構(gòu)建了tol2-EGFP-TRIB3質(zhì)粒，并與50 μmol·L-1miR-204(T)、50 μmol·L-1NC(NC)共同注射至野生型斑馬魚一細(xì)胞期受精卵中，空質(zhì)粒(CK)單獨注射至受精卵中。24 h后的GFP熒光強度結(jié)果(圖3A)顯示，miR-204與tol2-EGFP-trib3質(zhì)粒共同注射的GFP熒光強度顯著低于陰性對照和空白對照組。GFP蛋白的Western blot分析(圖3B)表明，miR-204與tol2-EGFP-trib3質(zhì)粒共同注射后的GFP蛋白表達量顯著低于空白對照和陰性對照組，進一步表明miR-204能夠下調(diào)TRIB3的表達。而trib3參與小鼠大動脈斑塊數(shù)量和面積調(diào)節(jié)[12]，以及與大鼠血管纖維化有關(guān)聯(lián)[13]。由此推測miR-204可能通過調(diào)控trib3進而調(diào)控斑馬魚胚胎血管的發(fā)育。

3 討論

斑馬魚作為模式生物，因其飼養(yǎng)容易、性成熟期短、卵易于觀察等原因，在眾多研究領(lǐng)域中得以普遍應(yīng)用；將斑馬魚作為研究模型尤其廣泛應(yīng)用于魚類的遺傳發(fā)育研究中[8]。本研究將miR-204 antagomir注射至斑馬魚胚胎一細(xì)胞期，觀察斑馬魚胚胎血管變化，發(fā)現(xiàn)注射miR-204后斑馬魚胚胎軀干部毛細(xì)血管增生。針對miR-204進行了潛在靶基因預(yù)測后，選定trib3為miR-204潛在靶基因。

A：GFP蛋白熒光強度；B：GFP重組蛋白表達印跡。A: Fluorescence intensity of GFP protein; B: Western blot of GFP recombinant protein.圖3 不同處理的斑馬魚胚胎GFP熒光蛋白表達檢測Fig.3 GFP fluorescence protein expression in zebrafish embryos under different treatments

TRIB3最初被認(rèn)為是抑制果蠅胚胎和生殖細(xì)胞有絲分裂的假激酶[9]。根據(jù)報道，細(xì)胞在缺氧的脅迫條件下，會誘導(dǎo)TRIB3的表達[10]。在小鼠中，敲降TRIB3會使血糖和肝糖明顯降低[11]。在小鼠中，沉默表達TRIB3會使大動脈斑塊數(shù)量和面積減少[12]。在糖尿病大鼠模型中，其中有血管纖維化的大鼠TRIB3表達量增高，被認(rèn)為TRIB3與糖尿病血管纖維化有關(guān)聯(lián)[13]。TRIB3基因還被證明與胰島素抗性[14]和頸動脈粥樣硬化[15]有關(guān)。本研究將miR-204與pmir-trib3-3′UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，并將miR-204與trib3的質(zhì)粒共注射至斑馬魚一細(xì)胞期中，結(jié)果都顯示miR-204對trib3有顯著抑制作用。因此推測，miR-204通過抑制trib3的表達從而調(diào)控斑馬魚胚胎血管發(fā)育。本研究篩選出miR-204的靶基因為trib3，并進行了驗證，為闡明miR-204在斑馬魚胚胎血管發(fā)育中的調(diào)控機制提供參考依據(jù)。