普 聿 蘇 丹# 王 鑫 王天杰 鞏春娟 劉 偉

(1.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.沈陽大學(xué)區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110044)

土壤中的多環(huán)芳烴(PAHs)由于難降解和不易揮發(fā)，長(zhǎng)時(shí)間積累在土壤中，對(duì)土壤造成嚴(yán)重的污染。固定化微生物修復(fù)技術(shù)是國內(nèi)外土壤PAHs修復(fù)的主流技術(shù)，具有反應(yīng)溫和、修復(fù)率高且無二次污染等優(yōu)點(diǎn)[1]。固定化微生物修復(fù)技術(shù)通過屏蔽環(huán)境及土著菌競(jìng)爭(zhēng)等的干擾，提高了微生物在土壤中的存活率和富集濃度[2]。目前關(guān)于固定化微生物技術(shù)修復(fù)PAHs的污染多為常溫環(huán)境下的研究，且在降解機(jī)理及降解菌的分離篩選等方面，技術(shù)已趨于成熟。在冬季，由于溫度過低導(dǎo)致大部分微生物處于低代謝甚至不代謝狀態(tài)，PAHs污染土壤修復(fù)較為困難。如何克服低溫環(huán)境對(duì)微生物造成的沖擊是冬季PAHs污染土壤修復(fù)的關(guān)鍵。低溫微生物的研究大多為耐低溫降解菌株的篩選，有研究指出假單胞菌(Pseudomonassp.)和高山被孢霉(Mortierellaalpina)均是高效的耐低溫降解菌[3]，耐低溫菌對(duì)原位污染土壤的修復(fù)研究甚少。土壤中高環(huán)的PAHs結(jié)構(gòu)復(fù)雜，大部分細(xì)菌無法將其降解，部分研究對(duì)苯并[a]芘(BaP)的降解研究發(fā)現(xiàn)，混合菌的生物量和降解效果遠(yuǎn)優(yōu)于單菌，混合菌將大大提高PAHs污染土壤的修復(fù)效果，尤其是對(duì)高環(huán)PAHs的礦化作用[4-7]。

本研究構(gòu)建了玉米芯-真菌-細(xì)菌耐低溫混合菌共生體系，研究該體系在低溫環(huán)境下對(duì)PAHs污染土壤的原位修復(fù)效果，通過高效液相色譜(HPLC)法分析土壤PAHs的降解動(dòng)態(tài)，通過高通量測(cè)序分析降解過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，闡明降解過程與微生物群落變化的相關(guān)性，用掃描電鏡(SEM)對(duì)固定化混合菌的微環(huán)境進(jìn)行表征，揭示固定化微環(huán)境強(qiáng)化污染土壤修復(fù)的作用機(jī)理，為寒冷地區(qū)PAHs污染修復(fù)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

于2017年12月28日采集某焦化廠的表層土(0～20 cm)，收集的土壤風(fēng)干后過2 mm篩，理化性質(zhì)：pH 8.36，有機(jī)質(zhì)5.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，總氮0.2%，總碳1.6%，砂土65.6%，黏土15.5%，壤土11.9%。土壤理化性質(zhì)分析方法見文獻(xiàn)[8]、[9]。

1.2 菌 株

從焦化廠和沈撫灌區(qū)PAHs污染凍融土壤中分離篩選出高效PAHs降解真菌-細(xì)菌最優(yōu)組配，經(jīng)鑒定混合菌中的細(xì)菌為假單胞菌SDR4(以下簡(jiǎn)稱SDR4)，真菌為高山被孢霉JDR7(以下簡(jiǎn)稱JDR7)。實(shí)驗(yàn)菌SDR4初始濃度為6×108cfu/mL，實(shí)驗(yàn)菌JDR7為孢子懸濁液，其孢子濃度為6×108cfu/mL。

1.3 試劑和儀器

主要試劑：乙腈為色譜純(Sigma-Aldrich公司)，正己烷和二氯甲烷均為分析純，硅膠粒徑60～100 mm。主要儀器：低溫培養(yǎng)箱(GZH-0328)，高壓蒸汽滅菌器(MLS-3780)，HPLC儀(Agilent-1100)；SEM(JSM-310)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 固定化混合菌的制備

將新鮮的玉米芯120 ℃烘干處理后，碾碎制成玉米芯顆粒(粒徑1.0～1.5 cm)，加入適量1.0 mol/L Ca(OH)2溶液浸泡24 h，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0%的麥麩混勻，并保持一定的含水量，pH調(diào)節(jié)為7.1，在110 r/min下振蕩24 h。3 000 r/min下離心15 min后棄上清液。處理后的玉米芯顆粒在121 ℃高溫下滅菌60 min，用蔗糖4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，酵母膏0.3%，K2HPO40.05%，(NH4)2SO40.2%，MgSO4·7H2O 0.025%配制增殖培養(yǎng)基(液固比1.0 mL/g)，浸潤(rùn)培養(yǎng)12～24 h。按10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的接種量接種游離混合菌(JDR7：6×108cfu/mL，SDR4：6×108cfu/mL)，在低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d(15 ℃)，每天加適量增殖培養(yǎng)基，制得固定化混合菌(MC-S4J7)顆粒。

1.4.2 微生物降解實(shí)驗(yàn)

土壤過篩(2 mm)后，分裝于培養(yǎng)瓶中，每瓶土樣為4 g。為研究玉米芯固定化混合菌對(duì)PAHs的降解效果，實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理，如表1所示。T1：未滅菌土樣，表征土著菌的降解作用及與混合菌的競(jìng)爭(zhēng)；T2：加游離混合菌，表征游離混合菌與固定化混合菌的降解差異；T3：為研究對(duì)象固定化混合菌；T4：加空白載體，表征因載體吸附作用引起的非生物因素?fù)p失；T5、T6：加固定化單菌，表征固定化單菌和混合菌的降解差異。將土樣置低溫培養(yǎng)箱(10 ℃)中避光培養(yǎng)，采用烘干失重法[9]測(cè)定含水率，隨時(shí)補(bǔ)加無菌水保證一定土壤含水量。分別在0、15、30、45、60 d時(shí)測(cè)定土壤中菲(Phe)、苯并[b]熒蒽(BbF)的含量。實(shí)驗(yàn)設(shè)為3個(gè)平行組重復(fù)2次。

表1 固定化菌降解土壤PAHs實(shí)驗(yàn)處理

1.4.3 土壤PAHs的提取

采用超聲提取土壤中PAHs，HPLC法測(cè)定[10]。色譜柱為PAHs分析專用柱ZORBAX EclipsePAH(4.6 m×250 mm×5 μm)，柱溫(25.0±0.1) ℃，流動(dòng)相為乙腈∶水=3∶2(體積比)，流速為1.100 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，各種PAHs以色譜峰保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量，PAHs含量的方法回收率為84.56%～92.42%。

1.4.4 DNA的提取和高通量測(cè)序

根據(jù)MEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit的操作說明對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取，通過瓊脂凝膠電泳檢測(cè)土樣DNA的完整性，Illumina Miseq基因測(cè)序儀分析樣品中真菌和細(xì)菌微生物的群落組成和多樣性。16S序列的引物為341F/805R，引物序列為341F：5’-CCACGGGNGGCWGCAG-3’，805R：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’，測(cè)序區(qū)域?yàn)閂3～V4。ITS序列的引物為ITS1F/ITS2R，引物序列為ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，IFS2R：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC- 3’，測(cè)序區(qū)域?yàn)镮TS1～I(xiàn)TS2。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行去除接頭、序列標(biāo)簽、引物序列等去噪處理，之后進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類分析和Shannon多樣性指數(shù)分析[11-13]。

1.4.5 SEM表征

將空白玉米芯與固定化混合菌顆粒進(jìn)行增殖處理，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定3 h，磷酸緩沖液清洗3 min(3次)，依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇脫水15 min(3次)，臨界點(diǎn)干燥后噴金(15 min)，采用SEM觀察空白玉米芯和固定化混合菌的微觀結(jié)構(gòu)[14]533。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS Version 19.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化混合菌SEM分析

圖1(a)為空白玉米芯的SEM圖，可見玉米芯載體具有一定的孔隙結(jié)構(gòu)；圖1(b)為接種2周后固定化混合菌的微觀結(jié)構(gòu)，可見JDR7的菌絲在玉米芯的表面與孔徑中大量生長(zhǎng)，SDR4依附在JDR7的菌絲上，形成了延伸狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使混合菌更均勻地分散在土壤中，解決了菌體在非流體介質(zhì)(土壤)與污染物有效接觸面積小且不均勻的難題[14]536。玉米芯的孔狀結(jié)構(gòu)為菌株提供了較大的生長(zhǎng)空間，通過包埋菌株提高微生物的生物密度，同時(shí)構(gòu)成緩沖體系，屏蔽了土著菌和高濃度污染物與菌株的直接接觸與干擾，提高了污染物的去除效果[15-17]。

圖1 SEM圖Fig.1 SEM images

2.2 低溫下土壤PAHs的降解

2.2.1 土壤PAHs含量

焦化廠土壤中初始PAHs質(zhì)量濃度見圖2。土壤中PAHs總質(zhì)量濃度為247.10 mg/kg，土壤中PAHs以3環(huán)和4環(huán)為主，其中Phe(3環(huán))為105.40 mg/kg，占總質(zhì)量濃度的42.65%。高環(huán)PAHs中含量最高的為BbF(5環(huán))，為6.12 mg/kg。根據(jù)MALISZEWSKA KORDYBACH對(duì)16種優(yōu)先控制PAHs的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[18]，土壤已經(jīng)達(dá)到嚴(yán)重污染。本實(shí)驗(yàn)著重以兩種含量較高的Phe(低環(huán))和BbF(高環(huán))為研究目標(biāo)。Phe和BbF在土壤中不易揮發(fā)和分解，滅菌土壤在60 d后，仍分別有89.81%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)、94.23%殘存在土壤中。

2.2.2 Phe和BbF的生物降解

在低溫條件下(10 ℃)，6種不同處理的土樣Phe和BbF的降解效果見圖3。由圖3可知，60 d后，T3對(duì)Phe和BbF的降解率分別為59.61%、45.24%，降解效果最顯著。60 d后，6種不同處理對(duì)Phe的降解率表現(xiàn)為：T3>T5>T6>T2>T4>T1，對(duì)BbF的降解率表現(xiàn)為：T3>T6>T2>T5>T1>T4。T1和T4對(duì)Phe和BbF的降解差異不大，表明土著菌和空白載體對(duì)土壤中的PAHs有一定的降解效果，但降解效果并不顯著，可能因?yàn)橥林袥]有或含PAHs高效降解菌過少，同時(shí)低溫環(huán)境抑制了土著菌的代謝，導(dǎo)致土著菌的PAHs降解能力和玉米芯的吸附作用相差不大。有研究指出，大部分真菌和細(xì)菌降解PAHs的最適溫度為27 ℃左右，低溫會(huì)抑制或破壞細(xì)胞的酶促反應(yīng)和細(xì)胞壁的流動(dòng)性，從而使微生物對(duì)PAHs的降解能力降低甚至完全喪失降解能力[19]。

圖2 焦化廠土壤PAHs質(zhì)量濃度
Fig.2 Concentrations of PAHs in coking plant soil

圖3 不同處理方式下Phe和BbF的降解率Fig.3 Degradation rate of Phe and BbF under different treatments

投加游離混合菌60 d后(T2)，可分別降解29.12%的Phe和28.14%的BbF，投加的菌株和土著菌沒有產(chǎn)生抑制的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，游離混合菌的投加提高了低溫下對(duì)Phe和BbF的降解效果，表明游離混合菌在低溫下仍可降解一定的PAHs。

固定化SDR4(T5)對(duì)低環(huán)的Phe有較好的降解效果，60 d后降解率為41.25%，固定化JDR7(T6)對(duì)高環(huán)的BbF有較好的降解效果，60 d后降解率為30.81%。PAHs降解的差異性體現(xiàn)在微生物對(duì)PAHs降解途徑的不同，細(xì)菌多以3環(huán)以下的PAHs為碳源進(jìn)行降解，而高環(huán)PAHs一般以共代謝方式進(jìn)行降解。有研究表明假單胞菌和紅球菌屬(Rhodococcus)是Phe的高效降解菌，又是少數(shù)可直接以高環(huán)PAHs為唯一碳源進(jìn)行降解的細(xì)菌[20-22]。固定化混合菌(T3)的降解率遠(yuǎn)高于固定化單菌(T5、T6)，也高于游離混合菌(T2)。這是因?yàn)檎婢?xì)-菌聯(lián)合作用對(duì)PAHs的降解效果高于單一菌株，大部分細(xì)菌不能代謝降解高環(huán)PAHs，而真菌在降解過程中會(huì)分泌過氧化氫酶和漆酶等酶類，能夠?qū)?fù)雜的PAHs進(jìn)行降解，將其分解為極性大、生物可利用度高的中間物質(zhì)，細(xì)菌可降解這類中間物質(zhì)從而提高降解效果[23]。菌株在土壤的非流體介質(zhì)中傳導(dǎo)時(shí)，菌株的細(xì)胞被阻隔在0.2 μm的土壤微孔外，導(dǎo)致菌株擴(kuò)散速率慢且擴(kuò)散不均勻。通常降解菌對(duì)PAHs的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)速率低于降解速率時(shí)會(huì)處于缺乏營養(yǎng)的狀態(tài)，導(dǎo)致降解效果差[24]。玉米芯為菌株的生長(zhǎng)構(gòu)建了有效的緩沖屏障，削弱了外界溫度、濃度、土著菌等環(huán)境因素的干擾，大大提高了菌株對(duì)PAHs的礦化作用[25]。

2.3 Phe和BbF降解過程中土壤微生物多樣性分析

2.3.1 基因序列的優(yōu)化統(tǒng)計(jì)

分別對(duì)焦化廠未滅菌土樣(記為CK土樣)和投加固定化混合菌土樣(記為MC-S4J7土樣)避光低溫培養(yǎng)2周后，進(jìn)行高通量測(cè)序(細(xì)菌采用16S測(cè)序，真菌采用ITS測(cè)序)，評(píng)估結(jié)果如表2所示。

使用Usearch去除非靶區(qū)域的序列，避免測(cè)序過程中由于延伸不完全造成的非特異性擴(kuò)增。由表2可知，土樣的有效序列優(yōu)化率均在93%以上，測(cè)序的有效序列覆蓋率均在99%以上，表明本次測(cè)序分析可靠性高。

表2 優(yōu)化序列統(tǒng)計(jì)及測(cè)序質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

微生物對(duì)污染物的高度敏感性在一定程度上決定了土壤活性，在修復(fù)降解中起重要的作用[26]。通過高通量測(cè)序分析土壤Phe和BbF降解中真菌與細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化，土樣OTU分布文氏圖見圖4，微生物Shannon多樣性指數(shù)見圖5。

注：圖中數(shù)字為OTU數(shù)。圖4 焦化廠土樣OTU分布文氏圖Fig.4 Venn diagram of soil sample OTU distribution in coking plant

由圖4可知，CK土樣中獨(dú)有的真菌OTU為462個(gè)，細(xì)菌OTU為3 784個(gè)，MC-S4J7土樣中獨(dú)有的真菌OTU為621，細(xì)菌OTU為3 040個(gè)，原土壤中PAHs主要以土著菌(細(xì)菌)降解為主，固定化混合菌的投加使土壤微生物群落多樣性發(fā)生了改變，固定化混合菌可以促進(jìn)土壤中真菌群落多樣性的恢復(fù)。

由圖5可知，MC-S4J7的真菌Shannon多樣性指數(shù)為1.01，為CK(0.33)的3.06倍，表明固定化混合菌處理2周后，土壤真菌群落多樣性明顯提高。CK的細(xì)菌Shannon多樣性指數(shù)為2.79，為MC-S4J7(1.33)的2.10倍，表明土壤PAHs的降解與土壤細(xì)菌種群多樣性呈負(fù)相關(guān)。GUPTA等[27]研究表明土壤中細(xì)菌對(duì)真菌有一定抑制作用，細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生一種抗生素，從而抑制土壤中真菌的生長(zhǎng)代謝，土壤中細(xì)菌的群落多樣性對(duì)真菌群落多樣性的抑制呈正相關(guān)[28]。投加固定化混合菌后，土壤中細(xì)菌群落多樣性指數(shù)降低，細(xì)菌的多樣性驟降對(duì)真菌的抑制作用大大減弱，從而提高了土壤中真菌的微生物多樣性。

圖5 真菌、細(xì)菌測(cè)序Shannon 多樣性指數(shù)Fig.5 Shannon diversity index of fungi and bacterial sequencing

2.3.3 土壤微生物群落組成分析

通過已知真菌的ITS與細(xì)菌的16S序列，對(duì)比分析了CK與MC-S4J7土樣中的真菌和細(xì)菌的群落組成，結(jié)果見表3、表4。

表3 不同處理土壤真菌群落組成相對(duì)豐度(屬水平)

表4 不同處理土壤細(xì)菌群落組成相對(duì)豐度 (屬水平)

由表3可知，CK土樣中真菌主要由3個(gè)屬組成，其中相對(duì)豐度最大的為黃青霉屬占72.31%，其次是隱球菌屬和赭霉屬，處理后的MC-S4J7土樣中，被孢霉屬占58.63%，成為新優(yōu)勢(shì)菌。由表4可知，CK土樣中細(xì)菌主要來自13個(gè)屬，其中相對(duì)豐度最高的是假單胞菌屬，占29.11%，處理后的MC-S4J7土樣中，細(xì)菌多樣性明顯降低，假單胞菌屬占79.84%，為優(yōu)勢(shì)菌。

固定化混合菌的投加抑制了土壤中細(xì)菌群落的多樣性，使其趨于單一化，從而降低了群落多樣性；固定化混合菌中的SDR4和JDR7在低溫環(huán)境下生長(zhǎng)代謝良好，成為土壤PAHs降解的優(yōu)勢(shì)降解菌。根據(jù)線性回歸原理，微生物多樣性變化是暫時(shí)的，在降解中期混合菌為主要的降解微生物，但到降解末期時(shí)，隨著PAHs含量的降低，這種優(yōu)勢(shì)種群的共代謝作用會(huì)減弱，土壤中的微生物多樣性會(huì)恢復(fù)到土壤的初始平衡狀態(tài)[29-30]。

3 結(jié) 論

(1) 固定化混合菌在低溫環(huán)境下仍有較高的耐性，可降解59.61%的Phe和45.24%的BbF，可大量應(yīng)用于低溫PAHs污染土壤的原位修復(fù)。

(2) 玉米芯為微生物提供了良好的生長(zhǎng)空間，其孔狀結(jié)構(gòu)吸附了土壤中的PAHs，提高了PAHs生物利用的有效濃度，可廣泛應(yīng)用于固定化技術(shù)。

(3) 固定化混合菌的投加降低了細(xì)菌群落多樣性，假單胞菌屬(79.84%)和被孢霉屬(58.63%)成為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬。