血漿脂蛋白亞組分檢測(cè)方法的研究進(jìn)展與評(píng)價(jià)

朱心雨，明心亮，馮艷林，賀丁冬，涂建成(武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科基因診斷中心，武漢 430071)

血漿脂蛋白是在體內(nèi)輸送或攝取特定脂質(zhì)的異質(zhì)性血液顆粒，因此其在脂質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。這些顆粒由疏水性三酰甘油和膽固醇酯的核心組成，被磷脂、膽固醇和載脂蛋白等組成的親水性外殼所包圍，根據(jù)其密度、大小和蛋白質(zhì)組成不同，脂蛋白可分為5個(gè)主要類別：乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)，即主要是含apoB的脂蛋白;以及高密度脂蛋白(HDL)，即主要是含apoA1的脂蛋白(見表1)。血漿脂蛋白因其大小、組成和代謝特性方面有所不同又可以進(jìn)一步分為幾個(gè)亞組分，在心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)尤其是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中發(fā)揮重要作用。目前血漿脂蛋白常根據(jù)超速離心法(ultracentrifugation,UC)對(duì)其進(jìn)行分離；此外，脂蛋白也可以根據(jù)其電泳遷移率或其載脂蛋白的含量進(jìn)行分離，以進(jìn)一步分離脂蛋白并建立相應(yīng)的脂蛋白譜。盡管目前對(duì)于脂蛋白顆?；騺喗M分在CVD風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中尚無(wú)共識(shí)，但已有研究表明，LDL和HDL大小或顆粒濃度是未來(lái)預(yù)測(cè)CVD風(fēng)險(xiǎn)的重要檢測(cè)指標(biāo)。以下將對(duì)幾種新型的檢測(cè)方法進(jìn)行介紹。

表1 脂蛋白組分分類

1 電噴霧差分電遷移率分析

電噴霧差分電遷移率分析(electrospray differential mobility analysis, ES-DMA)也被稱為離子遷移率分析法(ion mobility, IM)，Kaufman等[1]于1998年首次報(bào)道該方法用于納米顆粒和大離子尺寸的測(cè)量；Caulfield等[2]在2008年報(bào)道了該方法首次應(yīng)用于脂蛋白分析。ES-DMA是一個(gè)可以選擇和計(jì)算氣溶膠相中完整脂蛋白顆粒的系統(tǒng)，其工作原理為用電噴霧接口將血清中的脂蛋白霧化，隨后電噴霧接口中的中和源向生成的氣溶膠施加已知的電荷分布，在下游使用由漂移管組成的差分電遷移率分析儀來(lái)選擇霧化的脂蛋白，根據(jù)大氣壓下的電遷移率逐漸選擇在大氣壓力下經(jīng)受電場(chǎng)傾斜的脂蛋白，然后在凝結(jié)核粒子計(jì)數(shù)器中通過(guò)激光檢測(cè)并對(duì)選定的脂蛋白進(jìn)行計(jì)數(shù)。ES-DMA已被證明其在脂蛋白檢測(cè)中具有一定價(jià)值，但在臨床實(shí)驗(yàn)室中幾乎沒有開展該項(xiàng)目。對(duì)于ES-DMA來(lái)說(shuō)自動(dòng)化和大樣本檢測(cè)是可以實(shí)現(xiàn)的；此外，ES-DMA對(duì)干擾尤其是血清蛋白產(chǎn)生的干擾相對(duì)較敏感，因此通常需要特定的樣品制備步驟來(lái)獲得精確的脂蛋白譜。盡管如此，ES-DMA的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出樣品的完整脂蛋白譜，與報(bào)道的大多數(shù)脂蛋白譜分析和定量方法不同，ES-DMA是唯一一種被測(cè)物是完整脂蛋白的方法[3]。

2 垂直自動(dòng)分離法

垂直自動(dòng)分離法(vertical auto profile,VAP)由Chung等[4]在80年代首次報(bào)道。該方法是一種半自動(dòng)化的系統(tǒng)，其原理主要是通過(guò)順序超速離心進(jìn)行脂蛋白分離。

VAP-Ⅱ?檢測(cè)脂蛋白譜有兩個(gè)過(guò)程。首先，通過(guò)單垂直旋轉(zhuǎn)密度梯度UC分離脂蛋白，不連續(xù)的梯度可確保根據(jù)脂蛋白各自的浮懸率充分分離脂蛋白，使密度最高的最終位于管的底部；自動(dòng)連續(xù)酶促測(cè)定法通過(guò)膽固醇含量對(duì)這些分離的脂蛋白進(jìn)行定量；然后在505 nm處測(cè)量吸光度以確定每個(gè)脂蛋白類別和亞類相關(guān)的膽固醇濃度，從而提供脂蛋白譜。此外，可通過(guò)軟件中包含的算法將膽固醇濃度進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為apoB的等效濃度。梁純子等[5]研究得出VAP血脂分型檢測(cè)在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室血脂項(xiàng)目的基礎(chǔ)上增加了特殊內(nèi)容，使患者脂質(zhì)數(shù)據(jù)更有臨床操作性、耗時(shí)更少、信息更豐富，避免了多重檢測(cè)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和時(shí)間壓力。該系統(tǒng)經(jīng)歷了各種優(yōu)化，并由Atherotech在2016年對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化[3]，VAP-Ⅱ-fingerstick?(VAP-Ⅱ-fs)可通過(guò)少量的血漿(18 μL)檢測(cè)出患者的脂蛋白譜，而VAP-Ⅱ是具有更好分辨率和性能的系統(tǒng)，但用該方法檢測(cè)需要更多的患者血漿。VAP在我國(guó)的臨床應(yīng)用需要多地區(qū)、多中心的研究數(shù)據(jù)支撐。

3 核磁共振波譜法

核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance, NMR)是一種能夠分析脂蛋白顆粒的新型檢測(cè)技術(shù)，其原理主要取決于不同脂蛋白顆粒中脂質(zhì)的甲基部分以不同的頻率共振，因此脂蛋白可以通過(guò)將核心脂質(zhì)的甲基信號(hào)分解為單個(gè)信號(hào)，或在整個(gè)甲基包膜上使用統(tǒng)計(jì)方法估算脂質(zhì)濃度來(lái)定量。當(dāng)前已有3種方法使用NMR對(duì)脂蛋白顆粒進(jìn)行檢測(cè)。Otvos[6-7]所描述的方法提供了主要脂蛋白類型(VLDL、LDL和HDL)的大小和顆粒數(shù)以及9種脂蛋白亞類的顆粒數(shù)，此方法基于某種算法將其NMR甲基信號(hào)與血清或血漿樣品中脂蛋白的NMR信號(hào)進(jìn)行擬合，通過(guò)透射電子顯微鏡和梯度凝膠電泳確定分離的脂蛋白部分的粒度。 Kaess等[8]描述的第2種方法通過(guò)磁場(chǎng)梯度強(qiáng)度和溫度來(lái)測(cè)量樣品的12種脂蛋白亞類。Ala-Korpela等[9-11]描述的第3種方法估計(jì)主要脂蛋白類別的脂質(zhì)含量、大小和顆粒數(shù)量，以及14種脂蛋白亞類的顆粒數(shù)量并且通過(guò)高效液相色譜獲得的顆粒粒徑。目前對(duì)將基于NMR的高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法引入臨床實(shí)踐仍存在一些爭(zhēng)議，作為NMR方法的替代方法，研究人員開發(fā)出了一種基于二維擴(kuò)散有序1H NMR光譜(2D diffusion-ordered 1H NMR spectroscopy, DOSY)用來(lái)檢測(cè)脂蛋白顆粒的新方法，也被稱作Liposcale測(cè)試[12-13]。NMR需要訓(xùn)練有素的技術(shù)人員和精密的儀器，脂蛋白的定量準(zhǔn)確性很大程度上取決于用于信號(hào)解卷積的處理軟件，該軟件使用實(shí)驗(yàn)庫(kù)來(lái)處理高度復(fù)雜的光譜，目前沒有找到有關(guān)建立處理算法的方式或系統(tǒng)校準(zhǔn)的數(shù)據(jù)，結(jié)果的溯源性仍然不清楚；但脂蛋白譜檢測(cè)自動(dòng)化、更少的分離步驟、檢測(cè)時(shí)間縮短和患者負(fù)擔(dān)得起的測(cè)定方法使其逐漸在臨床試驗(yàn)中廣泛得到使用。

4 凝膠滲透高效液相色譜法

凝膠滲透高效液相色譜法(gel permeation-high-performance liquid chromatography,GP-HPLC)由Hara等[14]于1980年首次報(bào)道，近來(lái)，該方法被用于常規(guī)和高通量脂蛋白譜測(cè)量，涉及自動(dòng)數(shù)據(jù)處理的GP-HPLC系統(tǒng)被稱為L(zhǎng)ipoSEARCH?，該系統(tǒng)已被全球許多研究人員所使用，發(fā)表文章近300多篇[15-16]。GP-HPLC根據(jù)尺寸排阻色譜(size exclusion chromatography, SEC)的原理按照其水合粒徑的不同而分離脂蛋白。Oda等[17]和Yanai等[18]建立了一種新方法，即陰離子交換高效液相色譜法(anion-exchange high-performance liquid chromatography,AEX-HPLC)，并評(píng)估了AEX-HPLC在冠心病、糖尿病和腎病患者以及健康志愿者中的臨床有效性，結(jié)果表明通過(guò)AEX-HPLC測(cè)定的IDL和VLDL中的膽固醇水平可能是冠心病或糖尿病的危險(xiǎn)生物標(biāo)志物。AEX-HPLC可以代替超速離心法分離人血清中HDL、LDL、IDL、VLDL等5種脂蛋白餾分。該方法還于2014年在日本的公共醫(yī)療保險(xiǎn)中被批準(zhǔn)用于臨床。HPLC作為脂蛋白分析的工具，其優(yōu)點(diǎn)如下：(1)可以從色譜柱中回收樣品中的相應(yīng)成分，并對(duì)其進(jìn)行重復(fù)分析；(2)分離過(guò)程中樣品的降解或變性比超速離心等其他分離技術(shù)更低；(3)色譜圖的分析簡(jiǎn)單、容易，因?yàn)槠浞蛛x的基礎(chǔ)僅基于粒徑。

5 同位素稀釋質(zhì)譜法

同位素稀釋質(zhì)譜法(isotope-dilution mass spectrometry, ID/MS)是臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中許多生物標(biāo)志物尤其是TG和TC測(cè)量的高級(jí)參考方法。通過(guò)液相色譜ID/MS(liquid chromatography ID/MS, LC-ID/MS)對(duì)載脂蛋白進(jìn)行定量分析由Barr等[19]在1990年代末首次報(bào)道，并在接下來(lái)的幾年中進(jìn)一步應(yīng)用于檢測(cè)其他載脂蛋白(apoA-Ⅰ、apoB、apoC和apoE)。通過(guò)LC-ID/MS對(duì)載脂蛋白進(jìn)行絕對(duì)定量分析時(shí)，需要依靠胰蛋白酶消化血清載脂蛋白,消化后針對(duì)每種主要的載脂蛋白鑒定載脂蛋白特異的胰蛋白酶肽，并選擇其中一些肽進(jìn)行ID/MS定量，ID/MS定量使用帶有13C、15N或2H作為內(nèi)標(biāo)(internal standards, IS)的合成標(biāo)記實(shí)體來(lái)加標(biāo)樣品。鑒于該種方法的高精度、良好可比性、可溯源性以及高通量等特點(diǎn)，LC-ID/MS已成為用于血清中apoB和apoA等脂蛋白定量候選參考方法之一。 但是由于這種方法需要使用昂貴的試劑以及專業(yè)的的技術(shù)人員和精密儀器，因此目前主要用于科研中，尚未應(yīng)用到臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)檢查[20]。

6 高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法可比性

對(duì)于高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法可比性的討論，主要集中于方法之間缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，以及每種方法所涉及的測(cè)量原理不同。一些方法根據(jù)其密度分離脂蛋白，一些根據(jù)其大小分離脂蛋白，有些根據(jù)其脂質(zhì)或蛋白質(zhì)含量分離脂蛋白；類似地，一些方法通過(guò)其載脂蛋白成分檢測(cè)脂蛋白，而另一些方法檢測(cè)完整的脂蛋白；盡管高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法都旨在測(cè)量脂蛋白及其亞類的構(gòu)成情況，但分離技術(shù)和操作條件不同，用這些方法獲得結(jié)果的可比性和等效性不足；迄今為止，尚無(wú)直接比較所有高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的報(bào)道，大多數(shù)僅通過(guò)一對(duì)一比較，少有研究直接比較幾種高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法。2006年Ensign等[21]使用VAP、NMR、梯度凝膠電泳(gradient gel electrophoresis, GGE)和管式凝膠電泳(tube gel electrophoresis , TGE)基于LDL大小測(cè)量結(jié)果對(duì)不同的患者表型分類，結(jié)果表明，在39個(gè)患者樣本中，只有3個(gè)被歸類為具有相同的LDL表型，即幾種方法一致性不到8%。2011年Grundy等[22]在SAFARI(辛伐他汀聯(lián)合非諾貝特治療高脂血癥)隊(duì)列研究中通過(guò)VAP、NMR和免疫比濁法測(cè)量apoB濃度與非HDL-C并進(jìn)行比較，最終結(jié)果顯示每種方法得出的apoB濃度一致性較差。

在過(guò)去的幾十年中，研究工作集中在確定新的生物標(biāo)志物以更好地預(yù)測(cè)患者發(fā)生CVD的風(fēng)險(xiǎn)上[23]。據(jù)報(bào)道，大量臨床和前瞻性研究旨在證明這些疾病與某一種特定生物標(biāo)志物的相關(guān)性，但是這些研究結(jié)果往往受到質(zhì)疑，特別是關(guān)于apoB和LDL顆粒濃度測(cè)量之間的相關(guān)性[24]。許多專業(yè)組織發(fā)布了有關(guān)CVD風(fēng)險(xiǎn)管理的指南[25-26]，其中關(guān)于高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法尤其是apoB濃度測(cè)量的爭(zhēng)論仍然存在。實(shí)際上，最新指南并不一定建議對(duì)患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)管理時(shí)應(yīng)使用高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法，并且大多數(shù)與高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法相關(guān)的綜述都表示沒有足夠的證據(jù)來(lái)促進(jìn)高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法在常規(guī)中的使用。因此，除非當(dāng)出現(xiàn)特殊的血脂異常時(shí)，大多數(shù)監(jiān)管機(jī)構(gòu)都不建議使用高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法。

7 總結(jié)

臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)疾病診斷的作用正在不斷發(fā)展，以向臨床醫(yī)生提供更多信息，評(píng)估CVD風(fēng)險(xiǎn)并更有效地進(jìn)行靶向治療。在常規(guī)檢測(cè)中，廣泛采用DGUC、免疫比濁法(immunonephelometry, IN)或ELISA等進(jìn)行脂蛋白定量。全自動(dòng)性、較低的成本、可接受的精度以及高通量分析等優(yōu)點(diǎn)使它們成為常規(guī)脂蛋白檢測(cè)的方法；然而，對(duì)脂蛋白譜的高度關(guān)注導(dǎo)致了許多其他高級(jí)脂蛋白檢測(cè)方法的發(fā)展，這些新方法依賴于各種分離原理，這些原理利用脂蛋白的不同特征來(lái)建立脂蛋白譜，例如它們的脂質(zhì)含量、載脂蛋白含量或大小。盡管目前已有許多方法都用于檢測(cè)脂蛋白譜(見表2)，但由于各種方法在檢測(cè)脂蛋白亞組分中缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)相關(guān)性和結(jié)果可比性，在一定程度上可能會(huì)導(dǎo)致不同的臨床診斷和醫(yī)療決策，對(duì)研究脂蛋白亞組分與CVD等相關(guān)疾病之間的關(guān)系產(chǎn)生影響。為了解決這一問(wèn)題，我們應(yīng)在脂蛋白分離檢測(cè)方法以及檢測(cè)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化等方面做出更多努力，為評(píng)估脂蛋白亞組分在CVD等疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后中提供幫助。

表2 高級(jí)脂蛋白檢測(cè)檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較