李育敏，闞麗娟，張水蘭，湯花梅，許曉清，熊丹，張秀明(深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，廣東深圳 518001)

按照ISO 15189: 2012要求和CNAS-CL02-A009《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》[1]，定量檢測方法和程序的分析性能驗證應包括抗干擾能力?！兑倚透窝撞《久撗鹾颂呛怂岫繖z測試劑注冊技術審查指導原則》要求必須驗證的干擾物質(zhì)有三酰甘油、膽紅素、血紅蛋白和IgG。本研究參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)EP7-A2方案[2]，進行系列干擾評價試驗，驗證血紅蛋白、三酰甘油、總膽紅素和總IgG對HBV DNA檢測的干擾，對存在干擾的物質(zhì)評價其濃度和干擾程度之間的關系，確定和量化干擾效應，為臨床實驗室進行分子診斷定量檢測方法和程序的分析干擾性能驗證提供參考。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 HBV DNA熒光定量PCR試劑盒(批號:2017012，湖南圣湘公司)；cobas?z480全自動熒光定量PCR分析儀(Roche公司)。

1.2配對差異試驗 參照EP7-A2方案，驗證干擾物是否對熒光定量PCR法測定HBV DNA存在干擾。

1.2.1樣本 廠家聲明三酰甘油≤3 000 mg/dL(34.0 mmol/L)、總膽紅素≤476.0 μmol/L、血紅蛋白≤2 g/dL和總IgG≤40 g/L對檢測結果無影響。收集三酰甘油、總膽紅素和總IgG濃度與廠家聲明接近以及溶血(檢測血紅蛋白濃度)且HBV DNA陰性的血清樣本作為干擾物，制備HBV DNA分析濃度在高、低2個水平(103和106IU/mL)的血清樣本作為測試樣本。配制方法：以三酰甘油為例，取HBV DNA濃度為105IU/mL、三酰甘油<1 mmol/L的血清樣本和三酰甘油濃度為34.0 mmol/L、HBV DNA陰性的血清樣本，按1∶100比例配制成三酰甘油濃度為34.0 mmol/L、HBV DNA分析濃度為103IU/mL的測試樣本(由于稀釋比例為1∶100，前者對后者血清樣本中三酰甘油濃度的影響可以忽略不計)；HBV DNA分析濃度為106IU/mL水平的測試樣本則選取108IU/mL的血清樣本以相同方法配制。其余干擾物配制同三酰甘油。對照樣本按同樣方法配制為HBV DNA分析濃度相同的血清樣本，不含血紅蛋白，僅含少量三酰甘油(<1 mmol/L)、總膽紅素(<6 μmol/L)，與測試樣本相比，所含干擾物濃度可忽略不計。但由于總IgG干擾樣本濃度較低(40 g/L)，而正常血清中IgG平均濃度約10 g/L，故對照樣本選取12 g/L的總IgG正常標本，即約40 g/L的干擾樣本與12 g/L的對照樣本進行比較。作為干擾物(三酰甘油、總膽紅素、血紅蛋白和總IgG)的血清均各選擇3個與廠家聲明的干擾濃度接近的臨床樣本，3個樣本均存在干擾作用再進行劑量效應試驗。所有實驗樣本均排除丙肝DNA陽性。

1.2.2測定流程 取HBV DNA分析濃度分別為103IU/mL和106IU/mL的2個血清樣本，每個樣本重復測定20次，得到均值和批內(nèi)標準差(s)。確定最大允許干擾值(dmax)為國家衛(wèi)生和健康委員會臨檢中心室間質(zhì)評評價界限0.4(LOG值)，分別計算2個濃度水平的dmax/s，查附表得出2個濃度水平的重復次數(shù)(n)。測試樣本和對照樣本同批檢測，按重復次數(shù)測定。樣本檢測前校準儀器，每天進行室內(nèi)質(zhì)量控制，質(zhì)控在控時數(shù)據(jù)可接受。

1.2.3數(shù)據(jù)分析 計算測試樣本和對照樣本的測量均值間的差值，差值≤±0.4(LOG值)，符合廠家聲明。

1.3劑量效應試驗 參照EP7-A2方案，對存在干擾的物質(zhì)確定干擾物濃度與干擾程度之間的關系(干擾效應)。

1.3.1樣本 高濃度干擾物樣本(H)選取高于廠商聲明濃度的病理血清樣本，低濃度干擾物樣本(L)選取正常平均濃度的血清樣本。高、低濃度干擾物樣本均檢測HBV DNA為陰性后制備成5個系列濃度(4L，3L+1H，2L+2H，1L+3H，4H)的干擾樣本。取HBV DNA濃度為105IU/mL和108IU/mL的血清和各濃度梯度的干擾樣本，配制HBV DNA分析濃度在103IU/mL和106IU/mL 2個水平的測試樣本，配制方法同配對差異試驗。

1.3.2測定流程 每個樣本重復測量3次，在1個分析批次內(nèi)完成檢測。

1.3.3數(shù)據(jù)分析 計算低濃度水平(4L)標本的測量均值，各濃度水平的測定結果減去低濃度標本的均值為干擾效應。以干擾物濃度為x軸，以干擾效應為y軸，繪制劑量-效應回歸分析圖，如呈線性效應，采用線性回歸分析；如呈非線性效應，則采用非線性回歸分析，選擇合適的模型擬合回歸方程計算給定干擾物濃度的干擾程度。

2 結果

2.1樣本的重復次數(shù) HBV DNA在103IU/mL濃度水平，s為0.09 IU/mL，dmax/s為4.62；在106IU/mL濃度水平，s為0.05 IU/mL，dmax/s為7.85，查附表，2個濃度水平的樣本重測次數(shù)(n)均為3。

2.2配對差異試驗 結果見表1。34.0 mmol/L的三酰甘油和2 g/dL的血紅蛋白對HBV DNA檢測無干擾，差值<0.4(LOG值)，符合廠家聲明。476.0 μmol/L的總膽紅素對103IU/mL 濃度水平的HBV DNA檢測無干擾；在106IU/mL水平處測試樣本和對照樣本差值為0.44(LOG值)，按四舍五入原則，符合廠家聲明。40 g/L的總IgG對103IU/mL濃度水平的HBV DNA檢測有負干擾，需進一步利用劑量效應試驗測定干擾效應。

表1 干擾物對HBV DNA檢測的配對差異實驗結果(LOG值)

注：*，表示有干擾。

2.3劑量效應試驗 總IgG干擾效應測試樣本的5個系列濃度分別為12.0 g/L、21.0 g/L、30.0 g/L、39.0 g/L和48.0 g/L?？侷gG≤48.0 g/L時，對HBV DNA檢測為非線性負干擾，劑量-效應曲線見圖1、圖2。非線性方程分別為y=1.693 2-1.509 3In(x) (R2=0.92，P=0.01)，y=0.046 1-0.002 2x-0.000 3x2(R2=0.98，P=0.02)。

圖1 總IgG對103 IU/mL濃度HBV DNA檢測的干擾效應

圖2 總IgG對106 IU/mL濃度HBV DNA檢測的干擾效應

3 討論

EP7-A2文件是目前分析干擾評價試驗的規(guī)范標準[3]，EP7-A2采用配對差異、劑量效應和利用患者標本作偏倚分析，但都存在局限性。前2種添加外源性干擾物，實驗樣本基質(zhì)不代表典型有問題的臨床樣本；第3種方案參照EP9-A2，選擇真實的特定患者標本(如高血脂等)以減少基質(zhì)效應，但只能證明偏倚和估計的干擾物某水平的相關性，不能證明因果關系。本研究參照EP7-A2采用配對差異和劑量效應實驗進行干擾評價，但樣本選擇患者標本，將EP7-A2的3種方案結合應用于干擾評價，既達到統(tǒng)計學要求的檢驗水準，又可減少基質(zhì)效應。

我國2015年《中國慢性乙型肝炎防治指南》[4]推薦接受抗病毒治療的人群為HBeAg陽性患者HBV DNA≥20 000 IU/mL；HBeAg陰性患者HBV DNA≥2 000 IU/mL。本研究選擇103和106IU/mL的2個病理濃度水平作為HBV DNA檢測干擾評價實驗的高、低分析物濃度，結果表明三酰甘油、血紅蛋白和總膽紅素對HBV DNA檢測的干擾評價均符合廠家干擾聲明。方芳等[5]研究表明總膽紅素在274.6 μmol/L時即對HBV DNA檢測存在干擾，崔蕾蕾等[6]表明總膽紅素高于400 μmol/L對結果存在影響，但是2項研究均添加商品化外源性膽紅素作為測試樣本，不能代表真實的患者病理標本，而本研究分析患者的真實標本，能直接評價病理血清標本中存在的干擾物及其干擾效應。

人血清中存在的IgG是PCR抑制劑，但目前國內(nèi)對HBV DNA檢測的IgG干擾驗證報道較少。本研究表明40 g/L的總IgG對HBV DNA檢測存在負干擾，進一步用劑量效應實驗測定其干擾效應為非線性負干擾。擬合非線性回歸模型時既要考慮決定系數(shù)(R2)，又要有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但同時也應注意如果為了單純得到較大R2，模型形式可能會很復雜，使其中參數(shù)無法解釋實際意義，也不可取，應結合實際解釋和應用效果來確定最終曲線。本研究在低濃度水平選擇對數(shù)曲線，高濃度水平選擇拋物線擬合非線性方程，可通過回歸方程估計不同濃度總IgG對HBV DNA檢測的干擾程度，如40 g/L的總IgG對103IU/mL濃度HBV DNA檢測的干擾效應為-0.72 LOG，在106IU/mL濃度處的干擾效應為-0.52 LOG。劑量效應試驗在計算干擾效應時，低濃度水平(12 g/L)處為各測定結果減去低濃度標本的均值，即低濃度干擾效應標示值在0左右。配對差異試驗為40 g/L的干擾樣本直接與12 g/L的對照樣本進行偏倚評估，故差值(-0.62 LOG)與劑量效應試驗的干擾程度(-0.72 LOG)有差異，在評價干擾效應時通常采用劑量-效應回歸分析。通過干擾評價，實驗室可認為HBV DNA呈-0.72 LOG的改變是有意義的干擾，即該變化是由40 g/L的總IgG干擾所致，而不是臨床治療的效果。本研究所采用的干擾評價新方法學和總IgG對HBV DNA測定結果的干擾現(xiàn)象仍需臨床試驗進一步驗證。