青海藏羊超數(shù)排卵FSH劑量篩選

朱芳賢，張晉青，莫延新，隋鶴鳴，謝秀梅,孟 飛，補(bǔ)海平，王廷艷，趙俊金*

(1.全國畜牧總站，北京 100193；2.青海省家畜改良中心，西寧 810016)

超數(shù)排卵是制作胚胎的一個重要環(huán)節(jié)，對于供體來說是一個復(fù)雜的生理過程，因不同品種、不同個體、不同藥物和不同生態(tài)環(huán)境，超數(shù)排卵效果也各異。桑潤滋和陳靜波[1]總結(jié)了我國2010年以前綿羊超數(shù)排卵結(jié)果發(fā)現(xiàn)，美利奴超細(xì)毛羊超數(shù)排卵獲得可移植胚胎數(shù)量平均為5.83～6.56枚/次，肉用綿羊?yàn)?.98～9.77枚/次；郭延華等[2]、張帆等[3]近幾年的報道肉用綿羊可移植胚胎數(shù)量也在這個范圍。張靜芳等[4]、朱芳賢等[5]報道地方品種綿羊獲得可移植胚胎數(shù)量平均為4.0～5.0枚/次，如何提高地方品種的超數(shù)排卵效果有待研究。本文分析了青海藏羊超數(shù)排卵效果，篩選出適合生產(chǎn)應(yīng)用的超排技術(shù)，為提高青海藏羊品種資源保護(hù)及實(shí)施良種羊高效擴(kuò)繁技術(shù)提供參考，對提高青藏高原羊品質(zhì)及養(yǎng)殖效益具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供體羊

從青海省青海藏羊主產(chǎn)區(qū)挑選純種優(yōu)秀高原型、山谷型、歐拉型青海藏羊在青海省家畜改良中心西寧示范基地開展保種胚胎制作。高原型公羊15只、母羊60只，山谷型公羊15只、母羊50只，歐拉型公羊15只、母羊50只。公羊年齡2～5歲，母羊的年齡1.5～3.5歲、2～4胎。

1.2 主要藥品與器械

加拿大(CAN)產(chǎn)Follitropin 促卵泡素(FSH)，400 mg/支；日本(JP)產(chǎn)FSH，10 AU×5支；促黃體素釋放激素A3(促排3號)由寧波三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，20 μg×10支；氯前列烯醇(PG)，上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所生產(chǎn)，0.2 mg/2 mL/支；黃體酮陰道緩釋劑(CIDR)，新西蘭DEC國際有限公司生產(chǎn)，1.9 g/支。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

高原型藏羊給予200 mg(A組)、240 mg(B組)、280 mg(C組)3個不同CAN FSH劑量，分別處理13只、12只、12只羊；對高原型藏羊經(jīng)過3個月恢復(fù)期后再給予16.0 AU(D組)、20.0 AU(E組)、24.0 AU(F組)3個不同JP FSH劑量，分別處理6只、18只、10只羊；對歐拉型藏羊給予216 mg(G組)、256 mg(H組)、276 mg(I組)3個不同CAN FSH劑量，分別處理16只、15只、14只羊；對山谷型藏羊給予216 mg(J組)、240 mg(K組)、256 mg(L組)3個不同CAN FSH劑量，分別處理19只、15只、15只羊。

各試驗(yàn)組采用的超數(shù)排卵處理方法是第0天放CIDR栓，第9天開始注射FSH，間隔12小時注射FSH一次，F(xiàn)SH注射量遞減，第5次注射FSH時注射PG 0.2 mg，第7次注射FSH時撤掉CIDR栓；同時在放CIDR和配種時各注射維生素ADE注射液3mL，撤栓時用0.9%生理鹽水沖洗陰道，配種時注射促排3號15 μg。超數(shù)排卵處理方案見表1。

1.4 供體羊配種

撤栓后12 h開始試情，第1次站立發(fā)情12 h后配種，之后間隔10～12 h再配一次，連續(xù)配種2～3次。

表1 超數(shù)排卵處理方案Table 1 Superovulation treatment scheme

1.5 胚胎的采集與質(zhì)量鑒定

以發(fā)情之日為0 d，第7 d采用手術(shù)法回收胚胎。用含1%血清的杜氏磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗兩側(cè)子宮角,每側(cè)用液20～30 mL。子宮回流液靜置3～5 min后在實(shí)體顯微鏡下?lián)斐雎炎?并保存在保存液中。根據(jù)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胚胎分級，通常說的有用胚胎或可移胚胎包括A、B、C級胚胎,由于保種需要，本文中有效胚胎為A、B級胚胎。分級標(biāo)準(zhǔn)詳見《NY/T 1674 牛羊胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程》。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。超數(shù)排卵有效但沖卵失敗的個體不計(jì)入個體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青海藏羊超數(shù)排卵效果

超數(shù)排卵處理220只次高原型青海藏羊，結(jié)果為只均黃體數(shù)6.89個，只均獲卵數(shù)4.93 枚，只均獲有效胚3.34 枚。

2.2 高原型不同CAN FSH劑量超排效果的比較

由表2可見，A組卵子回收率、有效胚率、受精率高于B組(P>0.05)，黃體數(shù)、回收卵數(shù)、有效胚數(shù)低于B組(P>0.05)。C組黃體數(shù)高于B組(P>0.05)，回收卵數(shù)、卵子回收率、有效胚數(shù)、有效胚率低于B組(P>0.05)，受精率顯著低于B組(P<0.05)。

2.3 高原型不同JP FSH劑量超排效果比較

由表3知，E組黃體數(shù)、回收胚數(shù)、胚胎回收率、有效胚數(shù)高于D組(P>0.05)，有效胚率、受精率低于D組(P>0.05)。F組黃體數(shù)、回收卵數(shù)、卵子回收率高于E組(P>0.05)，只均有效胚數(shù)、有效胚率顯著低于E組(P<0.05)，受精率也低于E組(P>0.05)。

表2 高原型不同CAN FSH劑量超數(shù)排卵效果的比較Table 2 Comparison of ovulation effect of FSH in high altitude type %

表3 高原型不同日本產(chǎn)FSH劑量超數(shù)排卵效果的比較Table 3 Comparison of ovulation effect in different Japanese FSH in high altitude type %

2.4 歐拉型不同CAN FSH劑量超排效果比較

由表4可知，G組受精率高于H組(P>0.05)，黃體數(shù)、回收卵數(shù)、卵子回收率低于H組(P>0.05)，有效胚數(shù)、有效胚率顯著低于H組(P<0.05)。I組黃體數(shù)高于H組(P>0.05)，回收卵數(shù)、卵子回收率、有效胚數(shù)、有效胚率、受精率低于H組(P>0.05)。

2.5 山谷型不同CAN FSH劑量超排效果比較

由表5可見，J組黃體數(shù)、回收卵數(shù)、有效胚數(shù)、有效胚率、受精率都低于K組(P>0.05)，卵子回收率高于K組(P>0.05)。L組黃體數(shù)、回收卵數(shù)、卵子回收率高于K組(P>0.05)，均有效胚數(shù)、有效胚率、受精率低于K組(P>0.05)。

表5 山谷型不同CAN FSH劑量超數(shù)排卵效果的比較Table 5 Comparison of ovulation effect of FSH in different CAN FSH in valley type %

3 討 論

3.1 青海藏羊超數(shù)排卵效果分析

此次試驗(yàn)青海藏羊只均獲有效胚數(shù)明顯低于進(jìn)口品種，也低于張靜芳等[4]、朱芳賢等[5]報道的地方品種，可能造成青海藏羊只均獲有效胚低的原因，一是高寒、高海拔地區(qū)羊?qū)に氐姆磻?yīng)不好。二是藏羊繁殖率低，母羊一般年產(chǎn)一胎，一胎一羔，產(chǎn)雙羔者很少。三是這些供體羊之前都是放牧，和人接觸少，超數(shù)排卵處理過程中應(yīng)激大，可能造成卵泡閉鎖排卵少，以及胚胎退化，同時配種效果不好也降低了卵子受精率，最明顯的影響是試情時躲閃，無法判斷準(zhǔn)確發(fā)情時間；以及配種時母羊不穩(wěn)，造成公羊射精不充分，或是公羊精液沒有射到母羊生殖道深部，流失過多。四是供體羊有的剽悍有的弱，群體中肥瘦分化大，剽悍者采食過多而過肥，弱者采食少而過瘦，肥瘦效果都不好。建議開展青海藏羊繁殖技術(shù)應(yīng)用前訓(xùn)養(yǎng)一個月以上，注意羊和人的親和訓(xùn)練，同時根據(jù)個體大小，采食能力分群飼養(yǎng)。同時加強(qiáng)營養(yǎng)，每天每只羊喂富含硒、鋅、維生素A等礦物質(zhì)、微量元素和維生素的精料200 g。

3.2 不同F(xiàn)SH劑量超數(shù)排卵效果的比較

此次試驗(yàn)表明，高原型適宜FSH劑量為JP 20.0 AU和CAN 240 mg；歐拉型適宜FSH劑量為CAN 256 mg；山谷型適宜FSH劑量為CAN 240 mg。適宜FSH劑量是取得好的超數(shù)排卵效果的關(guān)鍵因素之一。較大的劑量會造成較強(qiáng)的激素應(yīng)答反應(yīng)，劉廣振[8]認(rèn)為較強(qiáng)的激素應(yīng)答反應(yīng)使得部分個體優(yōu)勢卵泡排卵過早，黃體功能不全，分泌孕酮水平較低，從而造成胚胎退化，有效胚率低。譚景和等[6]、桑潤滋等[7]、潘紅梅等[81]、孫鳳俊等[9]、朱芳賢等[11]認(rèn)為較大的劑量會造成卵巢過度增大，卵泡過度增多，從而可能使卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，最終未受精卵多，受精率低。本研究中，較強(qiáng)的激素應(yīng)答還造成卵巢過度增大及大量的黃體反應(yīng)，卵巢與黃體表面積超過輸卵管傘表面積，即傘包裹不住超排后的卵巢，排卵后卵子未進(jìn)入輸卵管中而直接掉入腹腔，最終卵子回收率低。試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了以上觀點(diǎn)，試驗(yàn)中高原型、歐拉型、山谷型超數(shù)排卵中的280 mg、276 mg、256 mg等大劑量CAN FSH組，及高原型的24.0 AU大劑量JP FSH組都是卵泡發(fā)育多，但回收到的卵子少，回收率低，有效胚胎少，未受精卵多，受精率顯著低。當(dāng)然，超數(shù)排卵劑量也不能太偏低，偏低容易造成卵巢不啟動，無法獲得更多胚胎，試驗(yàn)中小劑量組有效胚胎少就說明這個問題。

4 小 結(jié)

本試驗(yàn)超數(shù)排卵處理220只青海藏羊，只均黃體數(shù)6.89個，獲卵數(shù)4.93枚，有效胚3.34枚；高原型適宜FSH劑量為JP 20.0AU和CAN 240 mg；歐拉型適宜FSH劑量為CAN 256 mg；山谷型適宜FSH劑量為CAN 240 mg。