張英杰 張 衛(wèi) 徐鳴曙 張杏林 張 荻 程愛芳

（1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海200030；2.廈門市中醫(yī)院，福建廈門361009；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

卒中后抑郁（PSD）是腦卒中后常見的一種并發(fā)癥，發(fā)病率和漏診率較高，極易導(dǎo)致“因病致郁”“因郁致病”的惡性循環(huán)，增加了腦卒中患者的致殘率和死亡率[1]。PSD發(fā)病原因較為復(fù)雜，目前尚不明確。海馬與情感、認(rèn)知功能密切相關(guān)。PSD患者普遍存在海馬神經(jīng)細(xì)胞受損、凋亡以及神經(jīng)再生障礙[2]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）廣泛存在于海馬、大腦皮層、小腦等部位，能夠營養(yǎng)支持多種神經(jīng)元，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提高神經(jīng)元的生存率，促進神經(jīng)再生。近年來，不斷有研究者發(fā)現(xiàn)PSD患者和模型動物存在BDNF表達減少，而針刺治療能夠逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，促進BDNF表達，從而改善患者的抑郁癥狀[3-4]。本研究通過觀察電針干預(yù)后PSD模型大鼠海馬BDNF、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（p-ERK）、磷酸化核糖體S6蛋白激酶（p-RSK）、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）、磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）表達水平的變化，探討電針通過BDNF/ERK/CREB信號通路調(diào)控PSD大鼠海馬BDNF表達的機制，揭示針刺干預(yù)PSD的作用特點，為臨床有效防治PSD提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 成年健康雄性清潔級SD大鼠80只，體重（250±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，批號：SYXK（滬）2013-0109。飼養(yǎng)條件：溫度（24±2）℃，濕度40%～70%，晝夜交替規(guī)律12 h/12 h，正常飲食。實驗方法通過上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會審查，符合國際獸醫(yī)學(xué)編輯協(xié)會《關(guān)于動物倫理與福利的作者指南共識》要求。

1.2 藥品與試劑 鹽酸氟西汀膠囊（Patheon france）；0.9%氯化鈉注射液（浙江濟民制藥股份有限公司）；p44/42 MAPK（Cell Signaling Technology）；Rabbit mAb（Cell Signaling Technology）；CREB（48H2） Rabbit mAb（Cell Signaling Technology）；Anti-BDNF antibody（3B2，英國Abcam）；RNA酶抑制劑（Invitrogen）；隨機引物（Invitrogen）。

1.3 主要儀器 G6805-2A電針儀（上海華誼醫(yī)用儀器有限公司）；黑色無蓋木制敞箱（香港友誠生物科技有限公司）；POWER PAC 3000伯樂電泳儀（BIO RAD）；GIS-1600凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Veriti DX梯度PCR儀（Life Roche）；480Ⅱ Real Time熒光定量PCR儀（Life Roche）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，進行曠場試驗，將評分相近的大鼠隨機分為正常組、模型組、西藥組和電針組，每組20只。正常組大鼠孤養(yǎng)處理，其余各組大鼠采用本課題組前期報道的線栓法大腦中動脈阻塞（MCAO）術(shù)[5]聯(lián)合慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激[6]進行造模。MCAO術(shù)：大鼠禁食12 h，7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定、備皮，在大鼠頸部做正中切口，鈍性分離出右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎大鼠頸外動脈遠(yuǎn)心端，在頸外動脈距離頸總動脈2～3 mm處用4號縫合線打一虛結(jié)，夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈，在頸外動脈結(jié)扎處和虛結(jié)之間剪一小口，插入栓線，系緊虛結(jié)，松開動脈夾，無出血后剪斷頸外動脈，將栓線推入頸內(nèi)動脈約18 mm，縫合、消毒，90 min后進行再灌注。慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激：術(shù)后第2日開始相繼給予大鼠24 h禁水、24 h禁食、1 min夾尾、5 min 45 ℃烘箱熱刺激、5 min 4 ℃冰水游泳、5 min束縛、24 h晝夜顛倒應(yīng)激，每日隨機采用1種方法應(yīng)激大鼠，同一種方法在同一個周期（7 d）內(nèi)不重復(fù)出現(xiàn)，連續(xù)應(yīng)激21 d。

2.2 干預(yù)方法 造模結(jié)束第2日給予各組大鼠相應(yīng)處理。模型組予2 mL生理鹽水灌胃；西藥組予2 mL鹽酸氟西汀溶液0.2 mg/kg灌胃[7]；電針組予30 min電針治療，取穴：百會、豐隆、太沖、三陰交，百會斜刺進針，余穴直刺[8]，豐隆、太沖接電針儀，頻率2 Hz，電流強度以大鼠耐受為宜。以上干預(yù)方法均1次/d，連續(xù)治療21 d。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 神經(jīng)功能缺損評分 采用MENZIES等[9]的改進評分法在MCAO術(shù)前1 h、術(shù)后24 h、應(yīng)激21 d和治療21 d時對大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分。大鼠右前肢出現(xiàn)肩或（和）肘內(nèi)收屈曲，或（和）肩關(guān)節(jié)內(nèi)旋，記為1分，無此現(xiàn)象則記為0分；大鼠右前肢阻力減小或（和）行走偏右側(cè)，或（和）向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，記為1分，無此現(xiàn)象則記為0分；大鼠右前肢肌張力下降記為1分，無此現(xiàn)象則記為0分；大鼠不停地向右側(cè)旋轉(zhuǎn)記為1分，無此現(xiàn)象則記為0分。滿分為4分，MACO術(shù)后24 h和應(yīng)激21 d時大鼠神經(jīng)缺損評分≥1分視為造模成功。

2.3.2 體重 于MCAO術(shù)前1 h、應(yīng)激21 d、治療21 d時記錄各組大鼠體重。

2.3.3 行為學(xué)指標(biāo) 曠場試驗：于MCAO術(shù)前1 h、應(yīng)激21 d、治療21 d時進行曠場試驗。將長寬高分別為100 cm、100 cm、50 cm的黑色無蓋木質(zhì)敞箱底面劃分為16 個面積為25 cm×25 cm的小方格，大鼠禁水24 h后放在敞箱底面中心位置，觀察3 min內(nèi)大鼠的活動情況，以大鼠穿越方格數(shù)作為水平運動得分，大鼠后肢直立次數(shù)作為垂直運動得分，兩者相加計算大鼠運動總得分[10]。糖水試驗[11]：于MCAO術(shù)前1 h、應(yīng)激21 d、治療21 d時進行糖水試驗。大鼠禁食禁水8 h后，給予已稱重的2%蔗糖水和蒸餾水各1瓶，24 h后調(diào)換蔗糖水瓶和蒸餾水瓶的位置，48 h后再次對2 瓶稱重。大鼠糖水消耗率（%）=蔗糖水飲用量/（蔗糖水飲用量+蒸餾水飲用量）×100%。

2.3.4 海馬BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB表達 治療結(jié)束當(dāng)天，每組隨機選取10只大鼠，麻醉后取腦，冰盤上迅速分離出海馬，置于凍存管中，-86℃保存。左側(cè)海馬用于BDNF、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB蛋白水平檢測，采用Western-blot法，每20 mg海馬組織加入100 μL裂解液，勻漿機中充分裂解后，離心半徑24 cm，12 000 r/min離心5 min，取上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。灌膠，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，配膠，轉(zhuǎn)膜（200 mA，70 min），加入二抗（weiao，1∶2 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜，膜于化學(xué)發(fā)光檢測試劑反應(yīng)2 min，暗室中用X膠片感光、顯影、定影、成像。以β-actin為內(nèi)參照，使用Image J軟件對不同蛋白條帶進行定量分析。

2.3.5 海 馬BDNF mRNA、CREB mRNA表 達 右側(cè)海馬用于BDNF mRNA、CREB mRNA表達的檢測。采用RT-PCR法，提取海馬總RNA，根據(jù)試劑盒操作說明，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，熒光定量PCR擴增。引物 序 列：5’-GCGGCAGATAAAAAGACTGC-3’，5’-G C A G C C T T C C T T C G T G T A A C-3’，5’-A C C A G C A G A G T G G A G A T G C T-3’，5’-GGGCTAATGTGGCAATCTGT-3’；反 應(yīng) 條 件：95℃預(yù)變性2 min，然后進行45個循環(huán)擴增（95℃變性5 s，60℃退火延伸10 s）。以GAPDH為內(nèi)參照，采用相對含量2-△△Ct分析法計算BDNF mRNA、CREB mRNA相對表達量。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料用（-x±s）表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量資料方差分析，組間比較采用隨機方差分析，不滿足正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠各時期神經(jīng)功能缺損評分比較 MCAO術(shù)后24 h和應(yīng)激21 d時，模型組、西藥組和電針組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。應(yīng)激21 d時，與正常組和本組MCAO術(shù)前1 h相比，其余3組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均明顯升高（P＜0.05），提示腦卒中模型制備成功。治療21 d時，西藥組、電針組大鼠神經(jīng)功能缺損評分組間比較，與同時期正常組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較評分明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

3.2 各組大鼠各時期體重比較 MCAO術(shù)前1 h，各組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。應(yīng)激21 d，模型組、西藥組和電針組大鼠體重均明顯低于正常組（P＜0.05），提示抑郁模型制備成功。治療21 d，西藥組和電針組大鼠體重組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但均明顯高于模型組（P＜0.05）。詳見表2。

3.3 各組大鼠各時期曠場試驗得分比較 MCAO術(shù)前1 h，各組大鼠曠場試驗得分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。應(yīng)激21 d，模型組、西藥組和電針組大鼠曠場試驗得分均明顯低于正常組（P＜0.05），提示抑郁模型制備成功。治療21 d，模型組大鼠礦場試驗得分持續(xù)降低（P＜0.05），西藥組和電針組大鼠曠場試驗得分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且均明顯高于模型組和 本 組 應(yīng) 激21 d時（P＜0.05）。詳見表3。

3.4 各組大鼠各時期糖水消耗量比較 MCAO術(shù)前1 h，各組大鼠糖水消耗量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。應(yīng)激21 d，模型組、西藥組和電針組大鼠糖水消耗量均明顯低于正常組（P＜0.05），提示抑郁模型制作成功。治療21 d，西藥組和電針組大鼠糖水消耗量比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），且均明顯高于模型組和本組應(yīng)激21 d時（P＜0.05）。詳見表4。

3.5 各組大鼠干預(yù)后海馬ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB和BDNF mRNA、CREB mRNA表達比較 與正常組比較，模型組大鼠海馬BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB和BDNF mRNA、CREB mRNA表達均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和電針組大鼠上述指標(biāo)均明顯升高（P＜0.05），且西藥組和電針組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表5。

表1 各組大鼠各時期神經(jīng)功能缺損評分比較（±s） 單位：分

表1 各組大鼠各時期神經(jīng)功能缺損評分比較（±s） 單位：分

注： 與同時期正常組比較，*P＜0.05；與同時期模型組比較，#P＜0.05；與本組MCAO術(shù)前1 h比較，△P＜0.05；與本組術(shù)后24 h比較，▲P＜0.05；與本組應(yīng)激21 d比較，☆P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 MCAO術(shù)前1 h 術(shù)后24 h 應(yīng)激21 d 治療21 d正常組 20 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 20 0.00±0.00 1.90±0.74*△ 1.60±0.84*△ 1.30±0.68*△▲西藥組 20 0.00±0.00 2.10±0.61*△ 1.90±0.62*△ 0.60±0.48#▲☆電針組 20 0.00±0.00 1.98±0.91*△ 1.75±0.87*△ 0.25±0.35#▲☆

表2 各組大鼠各時期體重比較（±s） 單位：g

表2 各組大鼠各時期體重比較（±s） 單位：g

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 MCAO 術(shù)前1 h 應(yīng)激21 d 治療21 d正常組 20 265.63±16.26 382.42±15.96 470.42±13.27模型組 20 270.80±6.76 357.60±33.40* 410.95±24.73*西藥組 20 280.20±21.64 357.75±26.43* 442.15±25.33*#電針組 20 276.00±19.30 354.19±12.66* 445.31±11.48*#

表3 各組大鼠各時期曠場試驗得分比較（±s） 單位：分

表3 各組大鼠各時期曠場試驗得分比較（±s） 單位：分

注： 與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與本組MCAO術(shù)前1 h比較，○P＜0.05；與本組應(yīng)激21 d比較，☆P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 MCAO 術(shù)前1 h 應(yīng)激21 d 治療21 d正常組 20 40.17±18.81 33.25±14.42 29.50±14.90○模型組 20 37.90±17.18☆ 20.00±13.22* 12.30±10.98*○☆西藥組 20 39.40±19.06☆ 16.50±6.57* 27.30±14.62#○☆電針組 20 34.75±22.44☆ 17.88±16.40* 27.88±18.69#○☆

表4 各組大鼠各時期糖水消耗量比較（±s） 單位：%

表4 各組大鼠各時期糖水消耗量比較（±s） 單位：%

注： 與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與MCAO術(shù)前1 h比較，○P＜0.05；與本組應(yīng)激21 d比較，☆P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 MCAO術(shù)前1 h 應(yīng)激21 d 治療21 d正常組 20 88.01±10.01 85.30±9.22 86.43±9.62模型組 20 86.96±6.70☆ 68.37±16.75* 68.53±19.35*○西藥組 20 85.41±9.83☆ 66.18±16.81* 80.52±9.56#☆電針組 20 88.58±3.67☆ 69.68±12.50* 85.50±6.08#☆

4 討論

腦卒中后抑郁可歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”與“郁病”合病范疇。中風(fēng)后患者瘀血阻滯、痰熱內(nèi)蘊，或陽化風(fēng)動，血隨氣逆，上犯于腦，導(dǎo)致腦絡(luò)受損，神明失用，元神失主，精神失養(yǎng)，導(dǎo)致腦卒中后抑郁?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對PSD的發(fā)病機制研究較多，認(rèn)為其與神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、基因多態(tài)性、BDNF紊亂、細(xì)胞炎性因子、社會心理學(xué)等密切相關(guān)。

表5 各組大鼠海馬BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB 和BDNF mRNA、CREB mRNA 表達比較（±s）

表5 各組大鼠海馬BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB 和BDNF mRNA、CREB mRNA 表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)/只 BDNF ERK p-ERK p-RSK CREB p-CREB BDNF mRNA CREB mRNA正常組 10 1.24±0.15 0.94±0.07 1.63 ±0.28 1.09±0.32 1.23±0.44 1.14±0.36 2.293±0.586 1.025±0.067模型組 10 0.36±0.22* 0.49±0.25* 0.80±0.38* 0.36±0.09* 0.38±0.18* 0.31±0.18* 1.385±0.862* 0.875±0.227*西藥組 10 1.00±0.31# 0.81±0.14# 1.54±0.55# 0.97±0.28# 1.06±0.48# 1.07±0.35# 2.341±0.577# 1.133±0.083#電針組 10 1.03±0.29# 0.80±0.18# 1.36±0.35# 1.00±0.29# 1.10±0.38# 1.11±0.42# 2.141±0.440# 1.110±0.265#

本研究采用MACO術(shù)聯(lián)合慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激制備PSD模型。MACO術(shù)后24 h，大鼠出現(xiàn)不同程度的肢體運動功能障礙和神經(jīng)損傷，在應(yīng)激21 d時，大鼠肢體運動功能障礙和神經(jīng)損傷仍然持續(xù)存在。此外，造模大鼠還表現(xiàn)出了抑郁癥的核心癥狀：食欲減退，體重較正常組大鼠增長緩慢；快感缺失，對獎賞反應(yīng)不敏感，糖水消耗量減少；興趣減退，對開闊環(huán)境的焦慮，自發(fā)活動減少，曠場試驗得分降低。大鼠運動功能障礙和神經(jīng)損傷的持續(xù)存在、體重增長緩慢和行為學(xué)的改變提示PSD大鼠模型制備成功。

目前，對PSD的治療主要以抗抑郁藥物為主。鹽酸氟西汀是臨床常用于治療PSD的五羥色胺再攝取抑制劑類（SSRIs）類藥物，療效確切，能夠抑制5-HT的再吸收，調(diào)節(jié)BDNF的表達，提高神經(jīng)元的存活率，改善抑郁癥狀，且經(jīng)常被用于抗抑郁療法的對照研究[12-14]。近年來，針灸治療PSD因其安全、可靠、副作用小的優(yōu)勢成為關(guān)注的熱點[15]。本研究選取百會、豐隆、太沖、三陰交穴進行針刺和電針治療。百會穴具有開竅醒神、祛風(fēng)通絡(luò)之功，豐隆穴善于調(diào)理脾胃、化痰祛濕，太沖穴長于疏肝理氣、調(diào)和氣血，三陰交可活血化瘀、調(diào)肝補腎。四穴共用，以達到行氣解郁、化痰祛濕、祛瘀通絡(luò)、開竅醒神、培補肝腎的功效。豐隆、太沖接電針，可通過低頻電流刺激，提高神經(jīng)肌肉興奮性，改善大鼠肢體運動障礙，加強穴位的治療作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB、BDNF mRNA、CREB mRNA的表達均明顯低于正常組。在BDNF/ERK/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，BDNF與其特異性受體TrkB結(jié)合后可激活ERK，ERK被激活后可通過磷酸化激活一系列細(xì)胞膜表面以及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)的核糖體S6蛋白激酶（RSK）的蛋白激酶底物，使之磷酸化后與其共同入核，促進CREB等重要轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，從而調(diào)節(jié)CREB、BDNF基因的轉(zhuǎn)錄表達[16]。腦缺血再灌注和慢性不可預(yù)知應(yīng)激損傷，抑制了BDNF/ERK/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性，使該通路中的關(guān)鍵因子BDNF、ERK、RSK、CREB表達減少。ERK、RSK、CREB蛋白的生物活性與其磷酸化水平是相關(guān)的，所以模型組大鼠海馬p-ERK、p-RSK、p-CREB的表達減少，不能夠充分發(fā)揮促進CREB、BDNF基因的轉(zhuǎn)錄表達的作用，因而海馬BDNF mRNA、CREB mRNA的表達也減少，并最終導(dǎo)致了BDNF表達的進一步減少，使其不能充分發(fā)揮神經(jīng)保護作用，海馬受損和凋亡的神經(jīng)細(xì)胞得不到修復(fù)和再生，最終導(dǎo)致造模大鼠體重增長緩慢，快感缺失，自發(fā)活動減少以及運動功能障礙。治療21 d時，西藥組與電針組大鼠海馬BDNF、ERK、p-ERK、p-RSK、CREB、p-CREB、BDNF mRNA、CREB mRNA表達顯著高于模型組，與正常組無顯著性差異，推測電針和鹽酸氟西汀干預(yù)可通過上調(diào)BDNF/ERK/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵因子BDNF、ERK、RSK、CREB的表達，并促使其磷酸化，進而促進CREB、BDNF基因的轉(zhuǎn)錄表達，進一步增加BDNF表達。BDNF表達增多，可發(fā)揮神經(jīng)保護作用，改善大鼠肢體運動功能障礙，緩解大鼠的抑郁癥狀。西藥組與電針組大鼠各項指標(biāo)無明顯差異，可能與鹽酸氟西汀和電針的抗抑郁作用均是多層次、多水平、多靶點有關(guān)。今后還需要進一步探討B(tài)DNF及BDNF/ERK/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與PSD行為學(xué)改變及海馬神經(jīng)元損傷的關(guān)系，以深入闡明電針治療PSD的作用機制。