陳傳波，李 雙，朱振東，王學(xué)貴，殷麗琴，付紹紅，李 云，王繼勝，楊 進*，鄒 瓊，陶蘭蓉，康澤明，唐 蓉

(1.成都大學(xué)，四川 成都 610000；2.成都市農(nóng)林科學(xué)院, 成都 溫江 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都 溫江 611130)

在我國油菜作為生產(chǎn)上重要的油料作物之一，除了供給60%左右的國產(chǎn)植物食用油外，還在化學(xué)工業(yè)等方面起著重要作用[1]。雖然目前我國油菜種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一，但面對日益增長的消費需求，提高油菜生產(chǎn)的產(chǎn)量和品質(zhì)是當前急需得到重視的問題[2-4]。大巢菜、婆婆納、豬殃殃、棒頭草、稻槎菜、羊蹄與牛繁縷等我國冬油菜主產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢雜草是影響油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一[5]，特別是羊蹄(RumexjaponicusHoutt.)作為一種蓼科酸模屬多年生草本植物[6]，其生長常常伴隨油菜整個生長期，對油菜的危害很大，不僅與油菜爭水、肥、光和生存空間，而且易作為病蟲害越冬越夏的場所，嚴重影響油菜產(chǎn)量和品質(zhì)[7]。當前利用化學(xué)除草劑是控制田間雜草的主要手段之一，但同時存在諸多不可避免的問題(如：長期使用單一化學(xué)除草劑會使得雜草對化學(xué)除草劑敏感性下降、對闊葉雜草的除草劑缺乏及由于農(nóng)戶用藥不當引起的藥害、農(nóng)藥殘留等[8])，此外，除草劑的類型、施用量、劑型、可防控的雜草種類、氣候及土壤條件都嚴重影響除草劑的有效性[9]。自2003年，德國拜耳公司[10]在合理混用不同類型的除草劑來擴大殺草譜、提高藥效、減少用藥量、低殘留、提高安全性等方面取得一些進展后，除草劑混劑的開發(fā)與應(yīng)用越發(fā)受到人們的重視[11]。2種或2種以上除草劑混用，對雜草的作用可能增加或降低藥效，混用結(jié)果出現(xiàn)3種效應(yīng)。即加成作用(混用后的藥效，表現(xiàn)該混劑的各藥劑單用之和)。一般講化學(xué)結(jié)構(gòu)相似、作用機制相同的除草劑混用時，多表現(xiàn)為加成作用、增效作用(混用后對同一種植物的毒力之和增大時，其聯(lián)合作用應(yīng)屬于增效作用)和拮抗作用(混劑對同一種植物的毒力較各藥劑單用的毒力之和顯著降低時，其聯(lián)合作用應(yīng)屬于拮抗作用)。

丙酯草醚是一種新型田除草劑，它是一種2-嘧啶氧基芐基取代苯基胺類衍生物，主要被植物的根、芽、莖、葉吸收可雙向傳導(dǎo)，藥效發(fā)揮較快，持效期長，能對禾本科雜草看麥娘、日本看麥娘等和闊葉雜草牛繁縷、繁縷等表現(xiàn)出較好的防治效果，且對目標作物安全無藥害，是一種高效安全的油菜田除草劑[12]。前人研究表明，丙酯草醚屬于以ALS(乙酰乳酸合成酶)為作用點阻止Val、Ile、Leu的生物合成，進而抑制細胞有絲分裂的抑制劑[13]。另外，吡唑草胺是一種內(nèi)吸輸導(dǎo)性除草劑，具有廣泛的生物活性，它是通過阻礙蛋白質(zhì)合成而抑制細胞生長的乙酰苯胺類除草劑，對作物田的播后苗前和苗后初期的一年生禾本科雜草如野燕麥、馬唐、狗尾草等一年生闊葉雜草羊蹄、莧、婆婆納等效果顯著[14]。前人對吡唑草胺原藥誘發(fā)V79和CHL細胞基因突變和染色體畸變的研究表明，吡唑草胺原藥無致基因突變作用，當其濃度超出一定范圍時，才有致染色體結(jié)構(gòu)畸變作用，因此，吡唑類化合物以高效、低毒等特點而在農(nóng)藥中扮演著十分重要的角色[15]。

目前，關(guān)于丙酯草醚對田間主要雜草的防除效果雖有報道，但關(guān)于吡唑草胺對田間主要雜草的防除效果報道較少，特別是兩種除草劑混劑組合對油菜田間雜草的的防除效果更是鮮有報道。本研究采用盆栽法評價了不同復(fù)配比例的吡唑草胺與丙酯草醚對油菜田間闊葉雜草羊蹄的防治效果，并進一步測定了兩種藥劑的理想復(fù)配比例對羊蹄和油菜常規(guī)的生理生化(鮮重、葉綠素含量及ALS活性)的影響，以期能為進一步開發(fā)該出兩種除草劑的復(fù)配制劑來控制油菜田一年或多年生雜草提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試雜草 一年生闊葉雜草羊蹄(RumexjaponicusHoutt)雜草種子，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)無公害農(nóng)藥研究實驗室收集、保存并提供。

1.1.2 供試油菜 蓉油10(甘藍型油菜)，由成都市農(nóng)林科學(xué)院作物所油菜育種課題組提供。

1.1.3 供試藥劑 95%丙酯草醚原藥(山東僑昌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司)；95%吡唑草胺原藥(江蘇藍豐生物化工股份有限公司)。

1.1.4 試驗試劑 丙酮、MgC12、95%乙醇、丙酮酸鈉、CaCO3、石英砂、NaOH、硫胺焦磷酸、TPP、黃素腺嘌呤二核苷酸FAD、肌酸、K2HPO4、甲萘酚、KH2PO4、H2SO4等(皆為AR試劑)。

酶促反應(yīng)緩沖液：內(nèi)含0.1mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.5)、20.0mmol/L丙酮酸鈉、1.0mmol/LMgC12、0.5mmol/LTPP和0.01mmol/LFAD。

提取緩沖液：內(nèi)含0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.5)、1.0mmol/L丙酮酸鈉、5.0mmol/L MgC12、0.5mmol/L TPP和0.01mmol/L FAD。

1.1.5 儀器設(shè)備 UV-2000紫外分光光度計、CP224S電子天平、DT200電子天平、TGL-16B離心機等。

1.2 試驗設(shè)計與方法

1.2.1 藥劑復(fù)配比例組合設(shè)計 根據(jù)除草劑篩選原則(Gowing法)[16]，按照丙酯草醚和吡唑草胺在油菜田的施用劑量，各單劑及復(fù)配比例分別設(shè)置5個梯度，同時設(shè)置空白對照，總計16個處理(表1)。

1.2.2 靶標雜草的準備 將采集和室內(nèi)保存的靶標雜草種子破休眠后浸種催芽，待露白后選擇飽滿的種子，點播于裝有營養(yǎng)土的育苗缽(直徑為0.10m×0.10m)內(nèi)，每盆播30粒，大棚溫室內(nèi)培養(yǎng)至羊蹄1葉1心期間苗，每缽保留4～5株雜草。待雜草5～6葉期時備用。

1.2.3 藥劑復(fù)配比例的篩選 根據(jù)試驗設(shè)計，將5～6葉期的羊蹄進行噴霧處理，每處理設(shè)置3次重復(fù)(每個重復(fù)5盆)，同時設(shè)置空白對照，施藥后保持土壤濕潤。并與藥后10d對各處理靶標雜草鮮重進行稱量。

1.2.4 復(fù)配比例對羊蹄和油菜的生理生化 采用1.2.2方法進行盆栽羊蹄和油菜，待其4～5葉期，采用丙酯草醚和吡唑草胺，以及增效比例對羊蹄和油菜進行處理，測定藥后各處理葉綠素和ALS酶活性的影響。在施藥后1、4、7d，分別收集油菜和羊蹄地上部位葉片5g左右，同時設(shè)置3次樣本重復(fù)，葉綠素和ALS酶活性測定樣本分別采集，并做好標記保存在封口袋中，存于4℃冰箱中備用。

表1 除草劑復(fù)配比例與濃度

1.2.5 葉綠素含量的測定 采用張蜀秋的方法[17]，略有改動。用4mL95%的無水乙醇提取各個處理的葉片0.5g，放置離心機中于10000rpm下離心10min，取出其中的上清液部分；同樣加入相同體積的提取液與沉淀中再次離心，將2次所得上清液定容至25mL后用分光光度計測定其在663與646nm處的光吸收值，最終計算出葉綠素含量(mg/g)。

1.2.6 ALS活性的測定 提取ALS：對盆栽試驗中的5～6葉期羊蹄與油菜幼苗地上綠葉部分，進行稱量并剪碎后用液氮研磨成粉末狀。再用適量石英砂加入其中，提取緩沖液按1∶1(g/mL)的比例加入，進行充分的研磨后倒入離心管放置在離心機里進行離心，濾液離心(20000g 20min)，取出上清液作為粗酶液放置4℃以下保存待用。提取過程應(yīng)在0～4℃的低溫冰浴條件下進行[18]。

ALS活性的測定：將1mL酶促反應(yīng)液和0.5mL粗酶液加入于試管中，先于對照組中加入3moL/L H2SO40.2mL來終止反應(yīng)而測定組不加，然后在37℃水浴箱中水浴1h后加入3moL/L H2SO4，0.2mL對測定組的反應(yīng)進行終止。然后將反應(yīng)產(chǎn)物在60℃脫羧15min，再順次加入0.5%肌酸(溶于去離子水)0.5mL和5%甲萘酚(溶于2.5moL/L NaOH)0.5mL，放置在60℃反應(yīng)15min。然后取出進行反復(fù)搖勻使其顯色，讓顯色反應(yīng)液置于室溫下降至室溫后，將其置于分光光度計在530nm處比色[19]。蛋白含量根據(jù)Bradford(1976)采用考馬斯亮藍法測定[20]。酶活力用單位時間內(nèi)每毫克蛋白催化反應(yīng)的吸光值表示(0D530/mg protein/h)。

1.3 試驗結(jié)果處理

1.3.1 藥劑復(fù)配配比篩選結(jié)果處理 除草劑混用藥效測定及評價方法，采用Gowing法。

其中：X為A單劑防效(%)；Y為B單劑防效(%)；E0為A、B兩單劑相混的理論防效(%)；E為A、B兩單劑相混的實際防效(%)；E-E0>10%為增效作用；E-E0<-10%為拮抗作用；E-E0值介于理論值±10%為加成作用。

1.3.2 復(fù)配配比生理生化的結(jié)果處理 參照張敏等的方法[21]，計算出單劑各濃度處理組對雜草各指標的抑制率及混劑各濃度處理組實際抑制率與理論抑制率的百分比M。

計算公式為：M=混劑處理組實際抑制率/(單劑1抑制率×在混劑中所占比例+單劑2抑制率×在混劑中所占比例)。

其中：M在100左右(一般小于120)為相加作用；明顯高于100(大于120)為增效作用；明顯小于100(一般為80以下)為拮抗作用。

通過計算得出各處理的葉綠素含量、ALS活性，并運用SPSS Statistics17.0進行Duncan(0.05)方差分析并比較與通過用Sigmaplot 10.0作圖來進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)復(fù)配比例的篩選

2.1.1 各處理對羊蹄鮮重影響 結(jié)果表明(表2)，丙酯草醚與吡唑草胺五個不同復(fù)配比例的混劑對羊蹄的E-E0值分別為-8.61%，-8.98%，-9.91%，-4.63%，-0.49%，這5個復(fù)配比例均處于±10%之間，表現(xiàn)出加成作用。綜合考慮生產(chǎn)成本和兩種藥劑聯(lián)合作用除草效果等情況，選用60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺的配方來測取藥劑對羊蹄和油菜的生理生化影響。

2.2 丙酯草醚與吡唑草胺復(fù)配比例對羊蹄和油菜的生理生化

2.2.1 復(fù)配比例對羊蹄與油菜葉綠素含量的影響 60μg/mL丙酯草醚、200μg/mL吡唑草胺與60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺復(fù)配比例處理羊蹄結(jié)果表明(圖1A)：在三類藥劑處理后1d、4d、7d，羊蹄葉綠素含量均顯著低于空白對照處理(P<0.05)，且三類藥劑對羊蹄的葉綠素含量在藥后1d到4d差異不顯著，但在7d時該復(fù)配藥劑對羊蹄葉綠素含量的抑制明顯高于兩單劑處理。隨著時間的增加，三類藥劑處理對羊蹄葉綠素的抑制率逐漸增加(14.0～27.1、15.4～31.7和21.4～40.0)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL復(fù)配藥劑對羊蹄葉綠素的增效率M在藥后1d、4d、7d則分別達到142.4、147.5和152.8，表現(xiàn)出增效作用(圖1B)。

表2 藥后10d丙酯草醚與吡唑草胺對羊蹄鮮重影響

油菜葉綠素含量結(jié)果表明(圖1C)：三類藥劑處理后1d與空白對照差異均不顯著(P>0.05)，而在藥后4d和7d，油菜葉綠素含量均顯著低于空白對照(P<0.05)，但三類藥劑處理之間差異不顯著；隨著時間的延長，三類藥劑處理對油菜葉綠素的抑制率緩慢上升(6.0～19.1、6.8～21.0和9.6～23.6)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL復(fù)配藥劑對油菜葉綠素的增效率M在藥后1d、4d、7d呈下降趨勢，分別達到154.5、122.8和120.8，表現(xiàn)出增效作用(圖1D)。

2.2.2 復(fù)配比例對羊蹄與油菜ALS活性的影響 60μg/mL丙酯草醚、200μg/mL吡唑草胺與60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺復(fù)配藥劑對羊蹄ALS活性的結(jié)果表明(圖2A)：在三類藥劑處理1d后，ALS的活性均顯著低于空白對照(P<0.05)，且三類藥劑對羊蹄ALS活性差異不顯著；三類藥劑處理4d和7d時，60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺復(fù)配比例對羊蹄ALS活性明顯低于兩單劑處理。隨著時間的延長，三類藥劑處理對羊蹄ALS活性的抑制率逐漸增加(17.2～31.4、20.0～32.6和26.2～44.3)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺復(fù)配比例的增效率M在藥后1d、4d和7d分別達到146.8、138.9和139.9，表現(xiàn)出增效作用(圖2B)。

增效比例對油菜ALS活性的結(jié)果(圖2C)顯示，藥后1d，三類藥劑處理與空白對照差異均不顯著(P>0.05)；藥后4d和7d，三類藥劑處理油菜ALS活性顯著低于空白對照(P<0.05)；在藥后1d與7d，丙酯草醚60μg/mL和吡唑草胺200μg/mL與復(fù)配藥劑對油菜ALS活性差異不顯著，但在4d時復(fù)配藥劑對油菜ALS活性明顯低于兩單劑；且三類藥劑處理對油菜ALS活性的抑制率隨實驗時間的延長逐漸加強(5.8～14.6、7.1～14.6和11.5～17.7)；60μg/mL丙酯草醚+200μg/mL吡唑草胺復(fù)配藥劑對油菜葉綠素的增效率M在藥后1d、4d和7d呈下降趨勢，分別為189.7、137.8和120.9，表現(xiàn)出增效作用(圖2D)。

3 討論與結(jié)論

合理使用除草劑可以有效防除農(nóng)田雜草的發(fā)生，但前提是對作物安全。本文研究結(jié)果表明，在單一使用丙酯草醚時，羊蹄鮮重隨藥劑濃度增加而增加；在單一使用吡唑草胺時，羊蹄鮮重隨藥劑濃度減小反而增加；而所有復(fù)配比例對羊蹄鮮重防效均表現(xiàn)出相加作用，且明顯高于單一藥劑對羊蹄鮮重防效?？紤]到成本、防治效果及安全性等因素，本研究選用吡200+丙60的復(fù)配比例配方來測取藥劑對羊蹄與油菜的生理生化影響，結(jié)果表明篩選得到復(fù)配藥劑的對羊蹄的葉綠素含量與ALS活性有著較好的抑制作用，而對油菜幼苗的葉綠素含量與ALS活性抑制效果較小，表現(xiàn)出較好的選擇性。本試驗復(fù)配比例在藥后7d結(jié)果顯示，復(fù)配比例處理對羊蹄葉綠素含量的抑制率達到了40.0%，而對油菜的僅有23.6%，丙酯草醚對油菜幼苗的葉綠素含量也有一定的抑制作用。郭翔等[22]研究發(fā)現(xiàn)，500、1000mg/L濃度丙酯草醚處理下大麥葉片的非光化學(xué)淬滅(NPQ)值表現(xiàn)出先升高后下降的現(xiàn)象，說明了植株能上調(diào)NPQ來保護光合系統(tǒng)，降低外界影響對光合系統(tǒng)的傷害。本研究亦發(fā)現(xiàn)，施藥后1d、4d和7d時，復(fù)配比例對羊蹄的葉綠素含量抑制率的增效率在隨著時間的增加而增加，而對油菜的增效率卻是隨之減少，分析可能為除草劑施用后，油菜在藥劑脅迫壓力下，迅速誘導(dǎo)激發(fā)作物應(yīng)對保護機制，隨著時間的驗證，這種保護作用越發(fā)增強，從而降低藥劑的影響，這與郭翔等研究相符。

此外，除草劑植物體內(nèi)吸收、運轉(zhuǎn)的難易能影響藥效的發(fā)揮，所以除草劑在作物與雜草之間的吸收和傳導(dǎo)的差異是選擇性作用的原因之一[23]。趙丹丹等[24]研究發(fā)現(xiàn)，丙酯草醚對牛繁縷ALS活性有著較大的抑制作用，且會隨著時間而增強，在第5d達到了53.6%，而對油菜卻沒有明顯的抑制作用。陳杰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，丙酯草醚在45g ai/hm2條件下處理反枝莧，處理后測得ALS的活性明顯呈規(guī)律性下降，在第4d已經(jīng)下降了50%左右，有明顯的抑制作用，但除草活性發(fā)揮緩慢。本實驗表明，羊蹄與油菜經(jīng)過丙酯草醚60μg/mL+吡唑草胺200μg/mL處理過后，對羊蹄的ALS活性有著明顯的抑制作用，并隨著時間的推進而加強，在第7d達到了44.32%，而對油菜的ALS活性的影響卻不大，僅有17.71%；對羊蹄ALS的增效率隨時間增加先減后升，可能為丙酯草醚吸收輸導(dǎo)作用的差異導(dǎo)致前期增效較小，到后面吸收累積后作用效果明顯增加。另外，李政等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，水稻對丙酯草醚的吸收量要大于油菜，且隨時間推進有增加的趨勢，丙酯草醚吸收量以及單位質(zhì)量中積累量在水稻與油菜中的差異可能是丙酯草醚對兩者產(chǎn)生選擇性的機理之一。推測在本研究中油菜和雜草羊蹄對丙酯草醚吸收量以及單位質(zhì)量亦存在類似的積累量差異，導(dǎo)致丙酯草醚對羊蹄的抑制明顯高于油菜，但這種機理目前尚不明，有待進一步研究。

總之，除草劑對靶標雜草產(chǎn)生的效果會受到產(chǎn)品質(zhì)量、環(huán)境、抗性、施用方式等諸多因素影響，本實驗僅在盆栽實驗對丙酯草醚與吡唑草胺的增效比例及生理生化進行初步的探究，需進一步的實驗驗證其防治效果和安全性。