高產(chǎn)γ-氨基丁酸的雙歧桿菌的篩選及對抑郁細胞模型的改善作用

,3,4,*

(1.深圳市華大生命科學(xué)研究院,廣東深圳 518083;2.深圳華大農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究院,廣東深圳 518120;3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)基因組學(xué)重點實驗室,廣東深圳 518083 4.深圳市環(huán)境微生物基因組學(xué)與應(yīng)用重點實驗室,廣東深圳 518083)

抑郁癥是一種表現(xiàn)為自卑、快感缺乏,且伴隨著較高致殘率和致死率的疾病[1-3]。由于其發(fā)病機制復(fù)雜,較難治愈,因此引起了人們的廣泛關(guān)注。目前,該疾病主要采用三環(huán)類抗抑郁劑(TCAs)、單胺氧化酶抑制劑(MAOI)等藥物治療。但藥物通常有一定的副作用,如:抑制腸道微生物的生長[4],口干、便秘、視物模糊等。因此,新型、高效且無毒的治療方式是目前研究的重點。

最新研究發(fā)現(xiàn),部分益生菌具有改善抑郁癥的作用。如Desbonnet等[5]發(fā)現(xiàn)抑郁癥模型大鼠喂飼嬰兒雙歧桿菌后,大鼠表現(xiàn)出抗抑郁能力。抑郁患者服用瑞士乳桿菌R0052和長雙歧桿菌R0175混合益生菌制劑后,其抑郁癥狀得到顯著改善[6]。γ-氨基丁酸是由谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化L-谷氨酸的α-羧基脫羧反應(yīng)生成的一種非蛋白質(zhì)氨基酸,其作為一種重要的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)抑制劑,不僅能抑制神經(jīng)傳遞、降血壓、降血糖,而且有鎮(zhèn)定劑效果[7-11]。近年來,高產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選和研究頗多[11-14]。梁金鐘等[15]體外篩選出一株產(chǎn)GABA的植物乳桿菌Lp-Lw-131,其GABA的產(chǎn)量為0.917 g/L;同樣,產(chǎn)GABA的布氏乳桿菌MS可以保護由化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞死亡[16]。本文主要以膽鹽水解酶活性、耐酸耐膽鹽能力、抗生素耐受性、粘附能力以及GABA的產(chǎn)力及干預(yù)抑郁細胞模型作用對雙歧桿菌的功能特性進行研究,以期篩選出具有潛在抗抑郁作用的菌株。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

94株雙歧桿菌 均由深圳華大基因益生菌與發(fā)酵實驗室提供,試驗中重點研究的13株雙歧桿菌詳細信息見表1;BS培養(yǎng)基 海博生物;細胞培養(yǎng)板 AXYGEN;細胞培養(yǎng)皿 FALCON;PRMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、CCK 8、PBS Gibco;皮質(zhì)酮(Corticosterone,CORT) GmbH;HT-29(人結(jié)腸癌細胞)、SH-SY5Y(人類神經(jīng)母細胞瘤株) 北納生物;慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、新霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氯霉素、甲氧芐啶、環(huán)丙沙星、利福平、萬古霉素 美國BBI;甘氨酸 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

表1 13株雙歧桿菌菌株信息Table 1 Information of 13 Bifidobacteriums strains in experiment

立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司;生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;FP-1100-C型全自動生長曲線儀 Bioscreen;5424R型臺式冷凍離心機 Eppendorf;UV-6100型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司;CO2培養(yǎng)箱Galaxy170R Eppendorf;酶標儀Synergy 2 BioTek;LC-2030型液相色譜儀 日本島津儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)BSH雙歧桿菌的篩選

1.2.1.1 標準曲線繪制 采用茚三酮比色法[17]測定氨基酸含量;以在570 nm測定濃度為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L甘氨酸溶液的吸光度,以繪制標準曲線。

1.2.1.2 BSH活力測定 雙歧桿菌培養(yǎng)液在4 ℃經(jīng)10000×g離心10 min倒上清后生理鹽水洗脫2次,隨后調(diào)制成1×109CFU/mL的菌液。在15 mL錐形反應(yīng)管中加4 mL 5 mmol/L甘氨去氧膽酸鈉(GDCA)緩沖液、1 mL的菌液混勻后,37 ℃水浴30 min,在570 nm讀取吸光值。BSH酶活(U)定義為1×109CFU/mL菌液經(jīng)過1 min反應(yīng)產(chǎn)生甘氨酸的物質(zhì)量(μmol)[17]。

1.2.2 菌株抗生素敏感性 采用最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)法,測試試驗菌株的耐藥情況,其中以標準菌株干酪乳桿菌(Lactobacilluscaseisubsp ATCC334)作為陽性質(zhì)控。參照WHO提供的NCCLS標準[18],確定雙歧桿菌對各抗生素的敏感性。

將13種抗生素分別作一系列2倍比稀釋,得到濃度分別為0.03125～1024 μg/mL的抗生素溶液。將不同濃度的抗生素溶液加入96孔板中,隨后加入50 μL濃度為109CFU/mL雙歧桿菌菌液,37 ℃培養(yǎng)48 h,觀察實驗結(jié)果。

1.2.3 耐酸、耐膽鹽能力檢測 將初篩得到BSH活性較高的13株雙歧桿菌以3%接種量接種于BS液體培養(yǎng)基中,菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定期后4 ℃下6000 r/min離心10 min收集菌體,PBS(pH7.2)洗滌2次,重懸于pH2和pH3的無菌PBS緩沖液中,并將細菌濃度調(diào)至109CFU/mL。37 ℃培養(yǎng)2 h后,取樣涂板計數(shù),并計算存活率[19]。

13株雙歧桿菌分別以3%接種量接種于BS(含有0.3%膽鹽)液體培養(yǎng)基中,37 ℃條件下連續(xù)培養(yǎng),分別在3 h和6 h取樣涂板計數(shù),并計算存活率。

1.2.4 粘附性試驗 參考Gagnon等的方法[20],將HT-29細胞以每孔1×105的接種量接種于12孔板中,每孔含2 mL PMI 1640完全培養(yǎng)基(10% FBS)。收集培養(yǎng)至穩(wěn)定期的雙歧桿菌菌體(4 ℃,6000 r/min,10 min),并用PBS洗滌3次,然后用細胞培養(yǎng)液將其重懸至5×108CFU/mL。待細胞長至單層,去除細胞培養(yǎng)液,并用無菌PBS沖洗細胞2～3次,然后加入1 mL雙歧桿菌懸浮液(每株菌3個重復(fù))。37 ℃ 5% CO2-95%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后,棄除細菌懸浮液,PBS沖洗3～5次,胰蛋白酶消化3 min,加入適量含有10% FBS的1640培養(yǎng)液終止反應(yīng)。然后,加入1 mL 0.05% TritonX-100,反復(fù)吹打使細胞完全裂解,收集菌體并進行系列稀釋,涂板計數(shù)。另選取長至單層的培養(yǎng)孔,進行細胞計數(shù)并計算其粘附能力。

1.2.5 HPLC法篩選GABA高產(chǎn)菌株 參照Wu等[21]的方法,雙歧桿菌發(fā)酵液12000 r/min離心10 min后,取上清液100 μL,加入20 μL衍生試劑、100 μL硼酸緩沖液混合均勻,室溫反應(yīng)5 min后高效液相色譜檢測GABA。流動相A為20 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH7.3),流動相B為乙腈,其比例為4∶1。衍生試劑:OPA 20 mg、β-巰基乙醇20 μL及5 mL乙腈,混勻。硼酸緩沖液:硼酸24.7 g,加超純水定容至1 L,pH為10.4。進樣量:20 μL,流速:0.8 mL/min,柱溫:30 ℃,360 nm處檢測吸收峰,外標法定量。

1.2.6 雙歧桿菌對抑郁癥細胞模型干預(yù)實驗 以每孔5×104的接種量,將狀態(tài)良好的SH-SY5Y細胞接種于每孔含200 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)基(10% FBS)的96孔板中,培養(yǎng)至細胞鋪滿底部60%～80%。分別設(shè)置空白對照組(CON)、模型組(Model)及4個雙歧桿菌組,每組3個重復(fù)。除空白對照組外,其余各組參考Li等[22]的方法均采用300 μmol/L的CORT刺激SH-SY5Y細胞,37 ℃作用24 h。抑郁細胞模型誘導(dǎo)成功后,分別用107、106、105CFU三個劑量的雙歧桿菌干預(yù)抑郁模型細胞,37 ℃干預(yù)4 h。最后,采用CCK 8法檢測細胞活性,A450 nm波長處測定其光吸收值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復(fù)3次,選用SPSS(Version 22.0)軟件對試驗結(jié)果進行單因素Duncan法差異統(tǒng)計分析,P<0.05為顯著差異。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,使用GraphPad prism 7軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)BSH菌株的能力

BSH活性定量結(jié)果顯示,13株雙歧桿菌表現(xiàn)出較高的BSH活性,BSH活性范圍為:0.027～4.99 U/mL(圖1)。其中,雙歧桿菌98的BSH活性最高,為4.99 U/mL,顯著高于其他菌株(P<0.05)。而雙歧桿菌ZT3活性最低,為0.027 U/mL。隨后選取此13株雙歧桿菌進行下一步研究。

圖1 雙歧桿菌BSH活性Fig.1 Bile salt hydrolase activity of Bifidobacterium strains注:不同字母代表差異顯著,P<0.05,圖3同。

2.2 菌株的抗生素耐性

由表1可知,13株雙歧桿菌對氨基糖苷類抗生素均具有耐受性。除此之外,雙歧桿菌95、115和126對其他抗生素均敏感,雙歧桿菌ZT3、84和105耐1種抗生素,雙歧桿菌98、106、108和154分別耐2種抗生素,而雙歧桿菌90、91和92可耐3種抗生素。邱宏瑞[23]等研究也發(fā)現(xiàn):雙歧桿菌對紅霉素、四環(huán)素較為敏感,而對氨基糖苷類(慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素)不敏感,這與本研究結(jié)果一致。

2.3 菌株的耐酸、耐膽鹽能力

通過計算酸化2 h前后的活菌數(shù)得知,13株雙歧桿菌均能在pH3的環(huán)境中存活,其中,雙歧桿菌ZT3、95、105、126、154和84的存活率相對較高,分別是86.3%、85.2%、71.4%、68.9%、67.1%和65.5%。但當pH降至2.0時,其生長受到明顯抑制,僅有ZT3(2.2%)、84(8.8%)和105(3.5%)三株菌有較低的存活率(圖2),三組之間差異顯著(P<0.05)。推測雙歧桿菌對pH2的酸性環(huán)境所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)不足以消除酸脅迫帶來的不利作用。

高濃度的膽鹽對外源益生菌具有一定的殺滅能力,從圖2可以看出,在含0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后,95、84和ZT3三株雙歧桿菌的存活率相對較高,分別為86.6%、72.7%和63.5%,三組之間差異顯著(P<0.05)。但培養(yǎng)時間延長至6 h時,大部分雙歧桿菌的生長受到明顯抑制,僅有雙歧桿菌84和ZT3具有較高的存活率,分別為65.8%和52.0%。這可能是因為隨著膽鹽處理時間的延長,其他雙歧桿菌細胞質(zhì)溶解、膜內(nèi)蛋白流出,進而導(dǎo)致菌體細胞的死亡[24],而動物雙歧桿菌的環(huán)境脅迫耐受能力高于其他雙歧桿菌。

表1 各株雙歧桿菌的藥敏試驗結(jié)果Table 1 Antibiotic resistance results of Bifidobacterium strains

圖2 雙歧桿菌對pH2.0和pH3.0的酸耐受性Fig.2 Effect of pH2.0 and pH3.0 on viability of different probiotics

注:加粗的數(shù)值表示該菌的MIC超過NCCLS規(guī)定的最低濃度。

2.4 菌株的粘附能力

由圖3可知,雙歧桿菌92的粘附能力最強,平均每個細胞粘附33.77 CFU/cell,顯著高于剩余菌株(P<0.05);其次是雙歧桿菌95,平均每個細胞粘附活菌數(shù)為23.23 CFU/cell;雙歧桿菌98和91的粘附能力也較強,分別為20.46和19.34 CFU/Cell。說明雙歧桿菌92、95、98和91在腸道具有較強的定植能力。不同菌株定植于腸道上皮細胞的能力不同,這可能與菌株表面存在的與粘附相關(guān)的物質(zhì)(粘附素、脂磷壁酸等)有關(guān)。

圖3 不同雙歧桿菌粘附能力結(jié)果Fig.3 Ability of adhering by different probiotics

2.5 菌株產(chǎn)GABA的能力

為探究13株雙歧桿菌產(chǎn)GABA的能力,本試驗選用高效液相色譜法定量分析。由圖4可知,與對照組相比,雙歧桿菌98和95 GABA的產(chǎn)量顯著提高(P<0.05)。其中,雙歧桿菌98產(chǎn)GABA的能力最強,平均產(chǎn)量可達285.0 mg/L,其次是雙歧桿菌95,平均產(chǎn)量為232.8 mg/L。其余菌株的GABA產(chǎn)量相對較低,相比于對照組無顯著差異(P>0.05)。李理等[25]研究發(fā)現(xiàn):植物乳桿菌NDC75017也可產(chǎn)生GABA,這與本研究結(jié)果一致,并推測合成GABA除受GAD及gadB基因影響,其他的合成支路相關(guān)酶以及基因也參與其中。

圖4 不同雙歧桿菌產(chǎn)GABA能力結(jié)果Fig.4 Ability of producing GABA by different probiotics注:***代表與對照組(Control)差異顯著,P<0.05。

2.6 菌株對抑郁癥細胞模型干預(yù)能力

由圖5可知,相比于對照組,模型組的細胞活性顯著降低(P<0.05)。其中,高、中、低3個劑量的雙歧桿菌98均能顯著緩解CORT誘導(dǎo)的細胞損傷(P<0.05);而雙歧桿菌95對緩解細胞損傷具有劑量依賴性,僅在高劑量下才有顯著效果(P<0.05)。上述GABA實驗證實雙歧桿菌95的GABA產(chǎn)量低于98,而中、低劑量的雙歧桿菌95未能緩解CORT誘導(dǎo)的細胞損傷,這可能與菌體濃度太低導(dǎo)致GABA合成量不足有關(guān)。

綜上所述,緩解CORT誘導(dǎo)的抑郁細胞活性存在菌株和劑量特異性,高劑量的雙歧桿菌98、95及中、低劑量的雙歧桿菌98具有緩解CORT誘導(dǎo)的細胞損傷的作用。

圖5 不同雙歧桿菌緩解抑郁的效果Fig.5 Antidepressive-like effect of different Bifidobacterium注:CON表示空白對照組;Model表示CORT誘導(dǎo)的抑郁細胞模型組;M+107表示抑郁細胞模型添加107 CFU益生菌組;M+106表示抑郁模型細胞添加106 CFU益生菌組;M+105表示抑郁模型細胞添加105 CFU益生菌組。*代表與CON組差異顯著,P<0.05;#代表與Model組差異顯著,P<0.05;##代表與Model組差異極顯著,P<0.01。

3 討論

雙歧桿菌作為潛在的功能菌株必須要通過抗生素安全性評價。本實驗結(jié)果顯示,13株雙歧桿菌均對氨基糖苷類抗生素耐藥。邱宏瑞[23]等研究也發(fā)現(xiàn):雙歧桿菌對氨基糖苷類(慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素)不敏感,這與本研究結(jié)果一致。這可能是因為氨基糖苷類抗生素發(fā)揮其作用需要氧氣的參與,而雙歧桿菌是厭氧菌,因此普遍表現(xiàn)出對氨基糖苷類抗生素不敏感。

人體胃酸pH在2.0～3.0之間,小腸中膽鹽濃度在0.03%～0.3%之間,而食品在小腸停留的時間一般為1～4 h。因此,益生菌能夠耐酸耐膽鹽成為其發(fā)揮有益作用的必要條件之一。有研究發(fā)現(xiàn)9株雙歧桿菌在pH3酸性條件下的存活率皆高于95%[26],這高于本研究菌株的最高耐酸能力(86.6%),除環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)外,菌株耐酸能力還可能與H+-ATP酶活性有關(guān)[27]。本實驗中13株雙歧桿菌都表現(xiàn)出膽鹽耐受性,這與朱宗濤等[19]研究一致。而乳酸菌的耐膽鹽機制與其本身的膽鹽水解酶和表面蛋白有關(guān)[28]。HT-29細胞粘附性試驗顯示,各菌株間的粘附能力有明顯差異,其中雙歧桿菌91、92、95和98表現(xiàn)出較強的粘附能力。本數(shù)據(jù)與李平蘭[29]等的研究結(jié)果類似,其研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌的平均粘附能力為10.5 CFU/Cell。研究發(fā)現(xiàn)菌株S層表面蛋白或者脂磷壁酸在菌株的粘附過程中發(fā)揮重要作用[30-31],因此,本實驗菌株的粘附能力可能其S層表面蛋白、黏附素或者脂磷壁酸有關(guān)。

GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì),其可在人體內(nèi)產(chǎn)生抗應(yīng)激作用,并與抑郁癥的改善有關(guān)。本文將13株雙歧桿菌在mMRS(3%谷氨酸鈉+0.05% L-半胱氨酸鹽酸鹽)培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)36 h后,篩選出2株高產(chǎn)GABA的雙歧桿菌98和95,產(chǎn)量分別為285.0、232.8 mg/L,而劉韓等[32]研究發(fā)現(xiàn):長雙歧桿菌QYW-B-11在MRS(1%谷氨酸)培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)72 h后,GABA產(chǎn)量為60 mg/L,這低于本研究中菌株GABA產(chǎn)量,這可能與其培養(yǎng)基MRS中含1%谷氨酸的有關(guān)。人類神經(jīng)母細胞瘤株是一種分化程度較低的腫瘤細胞,其生理生化功能與正常神經(jīng)細胞相似[33]。而皮質(zhì)酮可以通過損傷人類神經(jīng)母細胞瘤株來模擬抑郁癥神經(jīng)細胞的損傷狀態(tài)。由抑郁細胞模型試驗結(jié)果可知,雙歧桿菌98和95均能顯著提高CORT誘導(dǎo)的抑郁模型細胞的活性,與Li等[22]的結(jié)果類似,其證明了巴戟天中的活性寡糖菊粉對CORT誘導(dǎo)的細胞有明顯的保護作用。Cho等[16]研究發(fā)現(xiàn):產(chǎn)GABA的布氏乳桿菌MS可以保護由化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞死亡。Strandwitz等[34]等試驗表明,高產(chǎn)GABA的Bacteroides與抑郁癥狀呈負相關(guān)。因此,高產(chǎn)GABA的益生菌在抑郁癥的治療中發(fā)揮著不可或缺的作用。

4 結(jié)論

本研究篩選出的青春雙歧桿菌95和98具有高產(chǎn)γ-氨基丁酸的能力,γ-氨基丁酸產(chǎn)量分別為285.0 mg/L和232.8 mg/L。抑郁細胞模型干預(yù)試驗初步證明:雙歧桿菌95和98均具有緩解抑郁模型細胞活性的功效,高、中、低劑量高產(chǎn)GABA的雙歧桿菌98都具有緩解CORT誘導(dǎo)的細胞損傷的能力,而雙歧桿菌95對緩解細胞損傷具有劑量依賴性，且只有在高劑量組下才有顯著效果(P<0.05)。