鄭旭陽(yáng),戎夢(mèng)迪,白 珺,何曉青,謝響明,金 一

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

表型可塑性指同一基因型在不同環(huán)境下產(chǎn)生不同表型的能力[1].表型可塑性不僅是物種適應(yīng)性進(jìn)化的一個(gè)重要方面，也是選擇進(jìn)化的產(chǎn)物.表型可塑性在自然界中普遍存在，有關(guān)植物和動(dòng)物的表型可塑性已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)微生物表型可塑性的研究較少[2-3].微生物在自然環(huán)境中分布廣泛，對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定起著重要作用.環(huán)境變化對(duì)微生物造成的影響十分復(fù)雜，表型可塑性在一定程度上抵消了環(huán)境變遷對(duì)微生物生長(zhǎng)所造成的影響[4].對(duì)微生物表型可塑性的研究有助于進(jìn)一步解析微生物群落特征及功能穩(wěn)定性[5].金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為一種常見(jiàn)病原菌能夠引起各種感染，通常使用抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌引起的感染進(jìn)行治療[6]；但由于抗生素的過(guò)度使用，金黃色葡萄球菌耐藥性愈加嚴(yán)重[7].菌株在不同抗生素脅迫下表現(xiàn)出不同程度的可塑性，推動(dòng)其適應(yīng)性進(jìn)化，進(jìn)一步發(fā)展出耐藥菌株.從野生動(dòng)物和動(dòng)物園動(dòng)物分離的金黃色葡萄球菌菌株具有不同的耐藥性，且在基因分型中表現(xiàn)出較強(qiáng)的多樣性[8].研究表明，根據(jù)奶牛中分離的金黃色葡萄球菌的基因型差異可以預(yù)防疾病的發(fā)生[9].但目前有關(guān)金黃色葡萄球菌在抗生素環(huán)境中的表型可塑性尚未見(jiàn)報(bào)道.

針對(duì)表型可塑性的研究主要是將基因型與表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而探究基因在個(gè)體表型中起的作用[10].全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association analysis,GWAS)能夠探測(cè)同一物種中不同個(gè)體全基因組范圍內(nèi)的基因變化，通過(guò)基因型與表型性狀關(guān)聯(lián)篩選相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)[11].GWAS為探索基因或染色體區(qū)域功能提供了新方法，使得大量功能未知的基因及區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，為人類攻克疾病提供了新的方向[12-13].GWAS應(yīng)用在微生物方面不僅能幫助人們了解微生物的結(jié)構(gòu)和功能，還能進(jìn)一步確定其與環(huán)境之間的作用關(guān)系[14]，同時(shí)能夠快速識(shí)別調(diào)節(jié)表型變異的遺傳因素，更容易鑒別出導(dǎo)致某種表型變化的遺傳基礎(chǔ)[15].目前的研究多為單一表型變量與基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，使用多個(gè)相關(guān)變量對(duì)應(yīng)一種基因型的分析較少.雙變量GWAS可將2種表型在同一時(shí)間進(jìn)行分析，與單變量相比，其統(tǒng)計(jì)效力加大，參數(shù)估計(jì)精確性提高[16].前人應(yīng)用GWAS分析了金黃色葡萄球菌在單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況，定位到與金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，表明GWAS 在研究細(xì)菌互作進(jìn)化機(jī)制方面的潛力[17].本研究主要應(yīng)用雙變量GWAS的方法對(duì)金黃色葡萄球菌在2種不同濃度萬(wàn)古霉素中的表型可塑性基因進(jìn)行定位，為研究金黃色葡萄球菌在抗生素壓力下的耐藥性生長(zhǎng)提供依據(jù)，同時(shí)為應(yīng)用雙變量GWAS研究細(xì)菌表型可塑性提供參考.

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源及其培養(yǎng)方法

本研究所用菌株見(jiàn)表1.41株原始金黃色葡萄球菌(編號(hào)為S1-S9、S11-S42)均對(duì)萬(wàn)古霉素敏感，經(jīng)腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar,BHIA)培養(yǎng)基復(fù)蘇，挑取單克隆細(xì)菌，用0.5～4.0 μg·mL-1腦心浸液肉湯(brain heart infusion,BHI)—萬(wàn)古霉素選擇性固體培養(yǎng)基測(cè)定其最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值.將菌液用生理鹽水稀釋至1.5×108個(gè)·mL-1左右，接種于含1/2 MIC萬(wàn)古霉素的BHIA平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h.將生長(zhǎng)的單菌落接種于同濃度BHI-萬(wàn)古霉素平板上，每個(gè)藥物濃度培養(yǎng)4 d，每2 d轉(zhuǎn)接至同濃度的平板，每4 d測(cè)定一次細(xì)菌的萬(wàn)古霉素MIC，根據(jù)MIC決定下次接種的萬(wàn)古霉素平板濃度，連續(xù)培養(yǎng)60 d.采用E-test試紙條法再次驗(yàn)證所得菌株的MIC，并將誘導(dǎo)獲得的菌株編號(hào)為S1′-S9′、S11′-S42′[18].所有菌株保存于-80 ℃.

1.2 試劑

BHI培養(yǎng)基、BHIA培養(yǎng)基均為英國(guó)Oxiod公司產(chǎn)品.細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司.萬(wàn)古霉素、溶葡萄球菌素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司.

1.3 生長(zhǎng)曲線及最大生長(zhǎng)速率的測(cè)定

將41株金黃色葡萄球菌平板劃線，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h進(jìn)行菌株復(fù)蘇.挑取單菌落在37 ℃、130 r· min-1過(guò)夜培養(yǎng)，測(cè)定菌液的D600 nm值.將菌液接種于20 mL不含抗生素或含4 μg·mL-1萬(wàn)古霉素的BHI培養(yǎng)基中，初始菌液濃度為5×103個(gè)·mL-1，培養(yǎng)48 h.每株菌設(shè)置3個(gè)重復(fù).共設(shè)置14個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為1、2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、42、48 h，使用酶標(biāo)儀(Infinite M200 PRO,TECAN，瑞士)檢測(cè)其D600 nm值，應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件繪制生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算其最大生長(zhǎng)速率.

1.4 全基因組測(cè)序

取2 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，使用溶葡萄球菌素和細(xì)菌基因組提取試劑盒提取其基因組，檢測(cè)合格后用Illumina HiSeq 4000進(jìn)行全基因組重測(cè)序(北京奧維森基因科技有限公司).基因組檢測(cè)、建庫(kù)、測(cè)序等環(huán)節(jié)都可能對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量和數(shù)量產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響后續(xù)分析結(jié)果.因此對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，包括去除低質(zhì)量讀數(shù)和接頭，計(jì)算測(cè)序錯(cuò)誤率，統(tǒng)計(jì)Q20、Q30、GC含量等，得到有效數(shù)據(jù).選擇金黃色葡萄球菌亞種NCTC 8325為標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行比對(duì)，得到BAM格式的比對(duì)結(jié)果.運(yùn)用SAMtools對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序，標(biāo)記重復(fù)序列，對(duì)得到的SNPs進(jìn)行過(guò)濾.

1.5 GWAS

以41株金黃色葡萄球菌在無(wú)抗生素培養(yǎng)基和含4 μg·mL-1萬(wàn)古霉素培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)為表型，結(jié)合全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析.為檢驗(yàn)SNP與2個(gè)表型的相關(guān)性，在GWAS中群體分層被視為隨機(jī)效應(yīng).本研究將基于單變量GWAS線性混合模型開發(fā)的多變量線性混合模型用于雙變量GWAS，借助GEMMA軟件的多變量線性混合模型計(jì)算P值，將多個(gè)表型同時(shí)與遺傳標(biāo)記相關(guān)聯(lián)[10].分析結(jié)果經(jīng)1 000次重組排列，在任意一次排列中，基因型和多變量表型之間的關(guān)系被隨機(jī)重組，將這1 000個(gè)P值由小到大排列，以0.05作為顯著性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，將第50個(gè)值作為GWAS的閾值，確定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著的SNPs.顯著的SNPs顯示在由軟件R3.3.0繪制的曼哈頓圖中.

表1 細(xì)菌來(lái)源1)Table 1 Sources of bacteria

1)S1-S9、S11-S42為原始菌株；S1′-S9′、S11′-S42′為本研究中的菌株；CGMCC為中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，CFCC為中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CICC為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，CMCC為中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，ACCC為中國(guó)農(nóng)業(yè)菌種保藏中心，CCTCC為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，CPCC為中國(guó)藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心，CAU為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；MIC為菌株經(jīng)60 d誘導(dǎo)后在萬(wàn)古霉素壓力下的最低抑菌濃度；序列號(hào)來(lái)自http://bigd.big.ac.cn.

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線

如圖1所示，41株菌在無(wú)抗生素壓力下生長(zhǎng)時(shí)，除S6′和S8′，其他菌株均呈現(xiàn)明顯的S型曲線.26株菌培養(yǎng)6 h左右(時(shí)間點(diǎn)4)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其余15株菌在培養(yǎng)10 h左右(時(shí)間點(diǎn)6)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，前者對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期比后者略陡.在含4 μg·mL-1萬(wàn)古霉素的條件下生長(zhǎng)時(shí)，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間分散.10株菌(S7′、S8′、S9′、S15′、S16′、S28′、S32′、S35′、S39′、S41′)在2種培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線基本重合，說(shuō)明菌株生長(zhǎng)未受到萬(wàn)古霉素的影響；10株菌(S3′、S11′、S13′、S20′、S23′、S33′、S34′、S37′、S38′、S40′)在萬(wàn)古霉素影響下對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)略緩慢，但遲滯期持續(xù)時(shí)間未變；8株菌(S5′、S18′、S19′、S21′、S26′、S27′、S29′、S31′)在萬(wàn)古霉素影響下進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期耗時(shí)較長(zhǎng)且生長(zhǎng)十分緩慢，說(shuō)明萬(wàn)古霉素影響了菌株的生長(zhǎng)；其余13株菌在含4 μg·mL-1萬(wàn)古霉素的培養(yǎng)基中沒(méi)有生長(zhǎng).

2.2 最大生長(zhǎng)速率

將無(wú)抗生素壓力下菌株的最大生長(zhǎng)速率按照由大到小排列，如圖2所示.7株菌(S7′、S8′、S15′、S26′、S27′、S28′、S32′)在2種培養(yǎng)條件下的最大生長(zhǎng)速率基本一致；9株菌(S16′、S19′、S23′、S33′、S34′、S35′、S37′、S40′、S41′)在含萬(wàn)古霉素培養(yǎng)基中的最大生長(zhǎng)速率略低于無(wú)抗生素培養(yǎng)基；23株菌(S1′、S2′、S3′、S4′、S5′、S6′、S11′、S12′、S13′、S14′、S17′、S18′、S20′、S21′、S22′、S24′、S25′、S29′、S30′、S31′、S36′、S38′、S42′)的最大生長(zhǎng)速率明顯降低；而S9′和S39′在含萬(wàn)古霉素培養(yǎng)基中的最大生長(zhǎng)速率略高于無(wú)抗生素培養(yǎng)基.由此可知，S7′、S8′、S15′、S26′、S27′、S28′、S32′、S9′和S39′這9株菌較其他32株菌更具表型可塑性.

圖1 41株金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves for 41 strains of S.aureus

續(xù)圖1Continued Fig.1

圖2 41株金黃色葡萄球菌最大生長(zhǎng)速率Fig.2 Maximum growth rates for 41 strains of S.aureus

2.3 全基因組測(cè)序結(jié)果

金黃色葡萄球菌重測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2.每株菌的有效數(shù)據(jù)量在941～2 581 Mb之間.本研究所用數(shù)據(jù)保存在生命與健康大數(shù)據(jù)中心的組學(xué)原始數(shù)據(jù)歸檔庫(kù)中，序列號(hào)為CRA001125.41株金黃色葡萄球菌共得到61 869個(gè)SNPs.

2.4 GWAS結(jié)果

對(duì)41株金黃色葡萄球菌在2種培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過(guò)GWAS確定表型與基因型的關(guān)聯(lián).金黃色葡萄球菌的61 869個(gè)位點(diǎn)中，387個(gè)位點(diǎn)位于閾值之上.時(shí)間點(diǎn)7得到的顯著位點(diǎn)最多，-logP值最大的位點(diǎn)位于時(shí)間點(diǎn)4.將14個(gè)時(shí)間點(diǎn)的顯著SNPs按照-logP值由大到小排列，篩選出現(xiàn)頻率高且-logP值大的SNP，最終在時(shí)間點(diǎn)3、4、13分別得到3個(gè)顯著SNPs(表3、圖3).其中，-logP值最大的位點(diǎn)382 501位于SAOUHSC_00375上，在所有時(shí)間點(diǎn)中共出現(xiàn)5次，SAOUHSC_00375編碼一磷酸鳥苷合酶；位點(diǎn)2 535 773共出現(xiàn)3次并在時(shí)間點(diǎn)4出現(xiàn)最大值，其所在基因編碼谷氨酸合酶α亞基，參與谷氨酸合成過(guò)程；位點(diǎn)264 897所在基因與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)；位點(diǎn)615 798和1 842 166分別位于編碼H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞基A和Ⅰ型限制修飾系統(tǒng)亞基的基因上；位點(diǎn)965 494所在基因與雙功能自溶素有關(guān).

表2 金黃色葡萄球菌重測(cè)序數(shù)據(jù)1)Table 2 Resequencing data for S.aureus

1)插入片段300 bp指建庫(kù)時(shí)構(gòu)建的文庫(kù)片段大小;讀長(zhǎng)150∶150指采用雙端測(cè)序,兩端各測(cè)150 bp;原始數(shù)據(jù)產(chǎn)量為所測(cè)序列的個(gè)數(shù)乘以所測(cè)序列的長(zhǎng)度；有效數(shù)據(jù)量為原始數(shù)據(jù)產(chǎn)量過(guò)濾后序列的個(gè)數(shù)乘以序列的長(zhǎng)度；Q20含量為堿基正確識(shí)別率在99%以上的堿基數(shù)目百分比(測(cè)序儀在堿基識(shí)別時(shí)，會(huì)給出每個(gè)堿基正確識(shí)別的概率)；Q30含量為堿基正確識(shí)別率在99.9%以上的堿基數(shù)目百分比.

3 討論

由41株金黃色葡萄球菌的MIC結(jié)合生長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)分析可得，在含萬(wàn)古霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，大部分菌株隨抗生素濃度的增大，遲滯期時(shí)間延長(zhǎng)，指數(shù)期坡度變緩，最大生長(zhǎng)速率降低，且達(dá)到穩(wěn)定期的最大D600 nm值略低于無(wú)抗生素培養(yǎng)基.部分菌株(S1′、S17′、S25′、S42′)的MIC均在4 μg·mL-1以上，但在4 μg·mL-1萬(wàn)古霉素培養(yǎng)基中未生長(zhǎng)；部分菌株(S18′、S23′、S29′、S33′)的MIC值均為3 μg·mL-1，但在4 μg·mL-1萬(wàn)古霉素培養(yǎng)基中均有生長(zhǎng)，可知這些菌株在萬(wàn)古霉素環(huán)境中適應(yīng)性更好.另外，同一MIC值的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)情況也有差異，可知MIC的大小與金黃色葡萄球菌的表型可塑性無(wú)直接關(guān)聯(lián).

表3 9個(gè)候選基因和蛋白Table 3 Nine candidate genes and proteins

A、B、C分別代表時(shí)間點(diǎn)4、3、13.每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)SNP.圖3 9個(gè)顯著SNPs曼哈頓圖Fig.3 Manhattan maps for 9 significant SNPs

本研究應(yīng)用雙變量GWAS研究金黃色葡萄球菌在萬(wàn)古霉素中的表型可塑性，最終得到9個(gè)可能與其表型可塑性有關(guān)的SNPs，通過(guò)基因注釋發(fā)現(xiàn)這些SNPs主要與氨基酸形成及離子轉(zhuǎn)運(yùn)等有關(guān).在培養(yǎng)6 h出現(xiàn)-logP值最大的SNP位點(diǎn)382 501，該位點(diǎn)位于基因SAOUHSC_00375上，此基因編碼一磷酸鳥苷合酶；在使用抗生素治療奶牛乳腺炎時(shí)，檢測(cè)到SAOUHSC_00375的表達(dá)對(duì)細(xì)菌存活具有重要作用，并在感染期間可能幫助識(shí)別藥物靶標(biāo)[19].SNP 2 535 773所在基因SAOUHSC_02760編碼谷氨酸合成酶亞基，參與銨離子與有機(jī)化合物的結(jié)合——生產(chǎn)氨基酸的重要步驟[20].SNP 738 836位于非編碼區(qū)，在所有位于非編碼區(qū)的SNP中-logP值最大，出現(xiàn)在培養(yǎng)后4 h，非編碼區(qū)不編碼蛋白質(zhì)，但可以調(diào)節(jié)生物合成過(guò)程中基因的表達(dá).SNP 264 897所在基因編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，離子轉(zhuǎn)運(yùn)能夠維持金黃色葡萄球菌菌體中的抗生素濃度，以促進(jìn)其在抗生素中的生長(zhǎng)，可能與金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)制有關(guān)[21].SNP 1 394 043在培養(yǎng)4 h出現(xiàn)，-logP值為30.10，此位點(diǎn)所在基因功能仍有待發(fā)掘.SNP 615 798所在基因SAOUHSC_00625編碼H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)亞基，在金黃色葡萄球菌面對(duì)環(huán)境壓力時(shí)，能夠通過(guò)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)菌體內(nèi)的滲透壓和pH值等[22].SNP 1 842 166編碼Ⅰ型限制修飾系統(tǒng)M亞基，限制性系統(tǒng)修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶能夠維持序列的甲基化方式并切割不同的外源DNA以保持較低水平基因的轉(zhuǎn)移效率[23].SNP 965 494所在基因SAOUHSC_00994(atl)編碼雙功能自溶素，金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶和內(nèi)切-Δ-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶2種不同的肽聚糖水解酶，從而參與金黃色葡萄球菌的自溶、細(xì)胞壁更新、細(xì)胞分離等過(guò)程[24].SNP 1 871 317所在基因?yàn)镾AOUHSC_01966，編碼假定蛋白.

綜上可知，氨基酸合成、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因很可能參與菌株的可塑性調(diào)控.另外，MIC與金黃色葡萄球菌在萬(wàn)古霉素中的表型可塑性沒(méi)有直接關(guān)聯(lián).