黎 燁,雷少楠,程志強,張 婷,金玲月,舒 琳,林春梅,趙 珂,田寶玉

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點實驗室，福建 福州 350108)

土壤微生物在物質(zhì)和能量循環(huán)、維持土壤肥力及促進(jìn)植物生長方面發(fā)揮著不可或缺的作用[1]，緊附于植物根系薄層土壤內(nèi)的微生物是連接土壤和植物間的橋梁[2].土壤的酸堿性、植物營養(yǎng)狀況、溫度、濕度、基因型以及宿主發(fā)育階段均能影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)和組成[3-5].隨著16S rDNA測序技術(shù)在研究擬南芥[6-7]、玉米[8]、水稻[9]、馬鈴薯[10]、番茄[11]、煙草[12]和大豆[13]等經(jīng)濟(jì)作物土壤微生物群落中的廣泛應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)了大量不能通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離的微生物種類，根際細(xì)菌群落組成和多樣性及其與不同植物間的關(guān)系被逐漸揭示[14].與無植被覆蓋的土壤環(huán)境相比，植物根部的滲出物為根際微生物提供營養(yǎng)，增加了根際微生物的生物量和代謝活性[15-16]，影響了根際細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和功能.研究證實，不僅植物種類和栽培品種影響著根際土壤微生物群落[6，8-9，13，17]，植物基因型差異也對根際微生物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成產(chǎn)生影響[18-19]，如突變型與野生型大麥根際土壤的微生物多樣性和部分物種豐度差異明顯[3].先前對植物和土壤微生物互作關(guān)系的研究大多集中在重要農(nóng)業(yè)或經(jīng)濟(jì)作物，對自然發(fā)育植物的土壤微生物關(guān)注很少[19].為了解不同植物對土壤微生物的潛在影響，以及探索新的微生物資源，還需進(jìn)一步對土壤微生物多樣性、差異性進(jìn)行深入研究.

紅壤是我國南方地區(qū)典型的土壤資源，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物產(chǎn)區(qū).紅壤是土壤生態(tài)系統(tǒng)中一種典型的特殊生境，具有與其它類型土壤不同的細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)和多樣性[20].盡管關(guān)于紅壤水土流失治理的研究頗有成效，但待探究的微生物信息還很多.本研究于福建省福州市旗山下自然發(fā)育5種植被的紅壤進(jìn)行采樣，利用Miseq高通量測序技術(shù)對紅壤中細(xì)菌16S rDNA基因V5～V7可變區(qū)進(jìn)行測序，詳細(xì)對比了樣本中和樣本間的細(xì)菌菌群組成和多樣性，為揭示紅壤環(huán)境下的核心微生物組以及不同植被對紅壤微生物群落組成結(jié)構(gòu)的影響提供參考.

1 材料與方法

1.1 樣品收集

于2018年11月25日在福建省福州市旗山附近一片紅壤地點(N26°01′,E119°12′)，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)5點取樣法收集5種植被土壤樣品，取樣草坪均為自然發(fā)育形成.5個取樣點覆蓋植被分別為艾草(Artemisiaargyi)、一年蓬(Erigeronannuus)、馬唐(Digitariasanguinalis)、鬼針草(Bidenspilosa)和飛揚草(Euphorbiahirta)，其中艾草屬多年生草本植物，其它4種均為一年生草本植物.選取處于營養(yǎng)后期(生長時間達(dá)6～7個月)且覆蓋較多的位點.除去腐植和散土，取緊附根際的薄層土，每種植被取5個樣品，混合后樣品分別標(biāo)記為AaS(艾草土樣)、EaS(一年蓬土樣)、DsS(馬唐土樣)、BpS(鬼針草土樣)和EhS(飛揚草土樣).過篩進(jìn)一步除去植物根組織及其它雜質(zhì)，收集10 g土壤于無菌自封袋中，4 ℃冰箱保存.土壤速效磷含量的測定采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法(Oslen法)，速效鉀含量的測定采用乙酸銨提取—火焰光度法，鐵含量的測定采用二乙三胺五乙酸浸提—原子吸收分光光度法.

1.2 土壤總基因組DNA的提取和16S rRNA基因片段的擴(kuò)增

1.2.1 樣品處理與全基因組的提取 分別稱取0.5 g土壤于2 mL EP管中，土樣總DNA的提取參考FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒說明書進(jìn)行.使用超微量分光光度計(Thermo NanoDrop 2000,USA)檢測總DNA濃度和純度(D260nm/D280nm).提取后的DNA儲存于-20 ℃冰箱中備用.

1.2.2 細(xì)菌16S rRNA基因片段的擴(kuò)增 以提取土樣的DNA為模版，通過細(xì)菌16S rDNA特異性引物799F(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′)和1193R(5′-ACGTCATCCCCACCTTCC -3′)來擴(kuò)增各樣本16S rRNA基因的V5～V7可變區(qū).聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系為50 μL:DNA模板2 μL，引物1(1193R)和引物2(799F)各1 μL，DNA Tag聚合酶25 μL，滅菌雙蒸水21 μL.反應(yīng)30個循環(huán)：95 ℃初始變性5 min，然后在94 ℃變性30 s，在60 ℃退火1 min，在72 ℃延伸90 s，在72 ℃下最后延伸7 min.通過1%瓊脂糖凝膠在100 V條件下持續(xù)電泳30 min，通過UV照射凝膠成像系統(tǒng)判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小，并使用QuantiFluor-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega,USA)做定量檢測[21]，DNA檢測合格后等量混合用于高通量測序.

1.3 擴(kuò)增子Miseq高通量測序

擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行高通量測序.測序使用Illumina Miseq平臺，采用PE 2x250 bp測序策略.

1.4 原始序列的處理與統(tǒng)計

高通量測序獲得的原始序列按樣品Barcode標(biāo)簽拆分后，采用FLASH(version 1.2.3)軟件對成對的短讀取序列(reads)進(jìn)行拼接[22].利用Cutadapt(version 1.9.1)軟件去除已拼接序列中的Barcode和引物序列.接著使用USEARCH (version 8.1.1861)軟件對序列進(jìn)行初步質(zhì)控，去除低質(zhì)量序列，包括含有模糊堿基、引物錯誤、平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于25或者長度小于200 nt的序列[23].初步質(zhì)控過濾后的序列利用USEARCH軟件的de novo方法進(jìn)行嵌合體序列檢查和去除，最終得到用于聚類和分類分析.

1.5 土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)和多樣性分析

1.5.1 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析 為了保證結(jié)果的均一性，首先對每個樣品按最小的序列數(shù)進(jìn)行隨機(jī)抽平處理.抽平后的序列利用Usearch平臺進(jìn)行聚類分析，將序列相似度≥97%的序列命名為一個操作分類單元(OTU).選取每一聚類中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列.得到的代表序列使用QIIME程序包RDP Classifier的方法與SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋，得到每個OTU對應(yīng)的物種分類學(xué)信息.統(tǒng)計各個樣品的OTU序列數(shù)目和分類信息，生成OTU表，繪制各個樣品不同分類水平物種結(jié)構(gòu)組成柱狀圖.

1.5.2 細(xì)菌多樣性分析 基于得到的OTU表，利用R語言pheatmap統(tǒng)計豐度排名前60的OTU并繪制熱圖；使用VennDiagram包繪制Venn圖揭示樣品間共有的OTUs.使用QIIME包計算各樣品的α-多樣性并繪制OTU稀釋曲線.α-多樣性用來衡量各樣品內(nèi)的物種多樣性和豐度差異，主要通過Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、覆蓋率等指標(biāo)來表達(dá).采用QIIME進(jìn)行基于unweighted_unifrac距離矩陣的主成分分析(principal component analysis,PCoA)和相似度分析來評估樣本的β-多樣性及不同樣本群落組成相似性和差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土壤微生物群落的α-多樣性

5個樣品經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)控后總共獲得了124 548條有效序列，為了保證每個樣品序列總數(shù)一致，對5個樣品按序列最小值23 012進(jìn)行隨機(jī)均一化處理，最后得到115 060條有效序列以及2 741種OTU(表1).

表1 所有樣品序列數(shù)與α-多樣性指數(shù)Table 1 Total sequences numbers and α- diversity indexes

由圖1可得，隨著測序條數(shù)的增加，樣本物種豐度(Chao1指數(shù))和多樣性(Shannon指數(shù))曲線先急劇上升隨后趨于平緩.測序覆蓋率約98.0%，說明測序深度覆蓋了樣本的絕大多數(shù)物種，測序結(jié)果范圍合理.

圖1 所有樣本Chao1指數(shù)曲線(a)和Shannon指數(shù)曲線(b)Fig.1 OTU rarefaction curves and Shannon index curves of all samples

表2 土樣的部分理化參數(shù)Table 2 Basic parameters of soil samples

多樣性指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果(表1)顯示，EhS的Chao1指數(shù)最高(2 388)，AaS的Chao1指數(shù)最低(2 154)；EhS和EaS的Shannon指數(shù)(9.508和9.552)高于其它樣品，AaS的Shannon指數(shù)最低(8.964).綜合Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，EhS群落α-多樣性最高，說明其物種豐度相對豐富和均勻，而AaS群落α-多樣性最低，表明該群落優(yōu)勢種群相對突出，單個物種的豐度較高.

5種植被下土樣的部分理化性質(zhì)如表2所示，各項指標(biāo)無顯著性差異，表明此片紅壤菌群落組成和多樣性差異主要來源于地上植被的影響.

2.2 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和核心種群

通過將樣品的OTU代表序列與SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，一共注釋到37個門分類與210 個目分類，其中各樣品相對豐度前15的門與目分別占所有門和目分類的98%和60%以上(圖2).結(jié)果顯示，在門水平上紅壤細(xì)菌菌群主要由變形菌門(Proteobacteria，37.8%±2.1%)、酸桿菌門(Acidobacteria，17.7%±3.8%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，16.5%±6.15%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，8.9%±1.1%)、綠彎菌門(Chloroflexi，3.4%±1.5%)、放線菌門(Actinobacteria，3.9%±2.4%)、浮霉菌門(Planctomycetes，4.4%±0.9%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，2.7%±0.9%)和硝化螺旋菌門(1.8%±1.0%)等構(gòu)成.總體上5個樣本在門水平上的群落組成結(jié)構(gòu)沒有顯著性差異，其中變形菌門在5個樣本中都占據(jù)了較高的比例(35.6%～39.9%)，但在個別門的豐度上存在較大差異，如EaS中硝化螺旋菌門(Nitrospiraes，2.8%)比其它樣品(0.8%～1.1%)高出近1.5倍；BpS的擬桿菌門(Bacteroidetes,22.8%)大約是其它樣品(10.5%～14.5%)的2倍；EaS中的放線菌門(Actinobacteria,6.3%)高出其它樣品(1.5%～3.5%)約2倍.

圖2 不同樣品中群落在門水平(a)和目水平(b)上的組成和相對豐度Fig.2 Bacteria composition and relative abundance of different samples at phylum level (a) and order level (b)

但不同土壤樣品在目分類水平上的細(xì)菌菌群豐度差異明顯，如AaS中變形菌門中的假單胞菌目(Pseudomonadales，9.6%)的豐度較高，其它樣品中假單胞菌目的豐度僅0.5%～2.0%，相差最高達(dá)20倍；BpS中噬纖維菌目(Cytophagales，8.7%)相對豐度高于其它樣品(1%～4%).不同樣品間物種豐度差異明顯的原因可能歸結(jié)為根際效應(yīng)，即植物根系分泌的有機(jī)物可以使得微生物形成正(負(fù))趨化性，從而對群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[25].由此可得，紅壤環(huán)境具有較穩(wěn)定的核心微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，但個別物種豐度可能因不同植被而發(fā)生變化.

圖3顯示，5個土樣一共有984個共有OTUs，大部分共有OTUs歸屬于變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、硝化螺旋菌門、疣微菌門、綠彎菌門和放線菌門等優(yōu)勢菌門.共有OTUs數(shù)目在各樣品中占其OTUs總數(shù)的47.9%～53.6%，其中屬于變形菌門的占11.8%，酸桿菌門的占15.9%，擬桿菌門的占11.5%.AaS、EaS、DsS、BpS、EhS所特有的OTUs數(shù)目分別為62、50、82、19、33，主要歸屬于梭桿菌門(Fusobacteria)、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、SHA-109和Aerophobetes等相對豐度較小的細(xì)菌門類，占各樣品OTUs總數(shù)的1.0%～4.0%.由此得出，不同紅壤樣品間細(xì)菌物種組成差異較小，相似性更高，不同植被條件下紅壤的核心微生物群落組成較穩(wěn)定；但不同植被條件會造成土壤環(huán)境中個別種群在種類和豐度上存在差異.

圖3 不同樣品OTU分布的Venn圖Fig.3 Venn profile of OTUs in different samples

2.3 不同土壤樣品菌群結(jié)構(gòu)相似性和β-多樣性

PCoA分析可根據(jù)不同樣品間的相對距離判斷各樣本間的差異.由圖4可得，樣品BpS與EhS在第1主成分(41.12%)、第2主成分(32.06%)以及第3主成分(17.62%)上的相對距離較小，表明二者間差異較?。籇sS與前二者在第1主成分與第2主成分上的相對距離較大，表明DsS與BpS和EhS的差異較大.

基于距離矩陣的相似度分析結(jié)果(圖5)與PCoA分析結(jié)果(圖4)一致：所有樣品最后聚為兩枝，兩枝的差異性相較明顯；其中BpS和EhS樣品的群落結(jié)構(gòu)和多樣性相似度高，相聚1枝；AaS、EaS和DsS間的差異性相對小，聚為1枝.DsS與BpS之間的差異系數(shù)最大(深綠色)，說明DsS與BpS的群落組成結(jié)構(gòu)差異高于其它樣品間的差異.

圖6是基于豐度排名前60的OTU繪制的Heatmap，反映了豐度最高的OTUs在不同樣品間的豐度差異和不同樣品基于豐度差異的聚類關(guān)系.由圖6可得，豐度最高的優(yōu)勢OTUs在不同樣品間豐度差異明顯.AaS中假單胞菌屬(Pseudomonas)的豐度顯著高于組內(nèi)其它細(xì)菌屬以及組間同屬，而芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、馬賽菌屬(Massilia)、金黃桿菌(Chryseobacterium)在DsS中相對富集，顯著較其它樣本高(紅色)，Hirschia和Chthoniobacter豐度分別在BpS和EhS中較其它樣本高.圖6左側(cè)聚類樹枝為細(xì)菌屬間豐度相似度水平，聚類樹枝越長表明細(xì)菌屬之間的豐度差異越大.根據(jù)圖6上側(cè)聚類樹枝得出樣品兩兩之間物種豐度及多樣性的差異大小，樣品聚類結(jié)果與主成分分析以及相似度分析的結(jié)果相一致，表明了5個樣品組內(nèi)、組間的群落組成結(jié)構(gòu)差異信息.

圖4 主成分分析Fig.4 Principal coordinate analysis of all samples

圖5 基于距離矩陣的不同樣品間相似度分析Fig.5 Similarity analysis between different samples based on Bray-Curtis

3 結(jié)論與討論

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是植物、微生物和復(fù)雜土壤理化環(huán)境互作的結(jié)果.本研究通過高通量測序分析了同一土壤條件下不同植被對土壤菌群結(jié)構(gòu)組成和多樣性的影響，其中Chao1指數(shù)與Shannon指數(shù)不具統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異，但樣本間在個別物種豐度上存在明顯的差異.EhS的物種豐富度和多樣性指數(shù)最高，AaS的物種豐度與多樣性最低，并且假單孢菌目相對富集，豐度差異倍數(shù)高達(dá)20倍.擬桿菌門、放線菌門、嗜纖維菌目則在BpS、EaS和BpS中相對富集.基于PCoA組成的β-多樣性顯示部分樣品出現(xiàn)明顯分離，其中DsS與BpS、EhS在坐標(biāo)上明顯分開(圖4)，跨越植物物種的根際土壤微生物群落和組成變化可由不同植物種類來解釋[22].由于樣品源于同一片土壤，土壤理化指標(biāo)并無顯著性差異，因此推測樣品間的差異來源于植物發(fā)育對微生物組成及功能的影響，例如植物分泌大量(摩爾質(zhì)量占達(dá)11%～40%)光合作用衍生碳化物(糖，氨基酸，有機(jī)酸，脂肪酸和次級代謝物)，使得土壤環(huán)境多樣化[25].土壤環(huán)境為主，不同植物為輔共同影響了植物根際土壤的群落結(jié)構(gòu)和物種豐度；并且在不同植被條件下，根際細(xì)菌種類及豐度的差異可能表征了對應(yīng)植被在整個營養(yǎng)周期中的發(fā)育過程.

圖6 不同樣本屬水平細(xì)菌群聚類熱圖Fig.6 Heatmap of different microbial communities at genus level

本研究界定了該地紅壤環(huán)境下細(xì)菌物種多樣性及核心種群.在5個紅壤樣品中，酸桿菌門、變形桿菌門、擬桿菌門和疣微菌門是4個優(yōu)勢細(xì)菌門(圖2)，其中變形菌門是最主要的優(yōu)勢細(xì)菌種群，酸桿菌門細(xì)菌次之.進(jìn)一步分類顯示了變形菌門各個類群在不同樣品中的豐度變化和差異，比如Alphaproteobacteria(13.5%)和Betaproteobacteria(14.4%)分別富含于EaS和DsS，Gammaproteobacteria(13.4%)富含于AaS，Deltaproteobacteria分布較為均勻，平均占比5.2%±0.6%.酸桿菌門細(xì)菌是紅壤樣品的第二大優(yōu)勢細(xì)菌類群，豐度為13.9%～21.5%.酸性細(xì)菌的豐度與pH值顯著相關(guān)，當(dāng)pH值降低時，酸性細(xì)菌豐度增加[26].本研究中酸桿菌門的豐度為13.9%～21.5%，然而本研究中5個土樣都不呈酸性(pH≈7.06)，由此推測酸性pH并不是酸性細(xì)菌在樣品中富集的直接原因，酸性細(xì)菌的富集可能是受到了相應(yīng)區(qū)域中植物分泌的有機(jī)碳源的影響[27].除了酸性桿菌和變形桿菌等優(yōu)勢門外，紅壤環(huán)境還包含Nitrospira和Actinobacteria等植物益生菌門，前者是參與氮元素循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為植物提供相應(yīng)的營養(yǎng)元素.

與不同類型的土壤生境相比，紅壤顯示出了較獨特的微生物多樣性模式，包括特殊的微生物群落、與氮與硫循環(huán)相關(guān)以及光合自養(yǎng)微生物.例如Desulfobacterales(隸屬于Proteobacteria)，Rhizobiales ，Chloroflexi和Ectothiorhodospiraceae(隸屬于Proteobacteria)在紅壤中豐度相對較高.其次，與植物疾病預(yù)防相關(guān)的細(xì)菌也富含于紅壤，例如Pseudomonas和Streptomycetales(隸屬于Actinobacteria).研究顯示，假單胞菌和鏈霉菌在植物病害時會大量出現(xiàn)，形成根際效應(yīng)，并與植物發(fā)生互作從而激活植物免疫系統(tǒng)[24].此外，該片紅壤γ-變形菌的豐度較高，γ-變形菌可以使用環(huán)境中的硫作為電子供體進(jìn)行CO2固定，固定占比高達(dá)40%～70%[30].表明紅壤中具有較豐富的初級生產(chǎn)者，這將有助于維持紅壤的有機(jī)物水平，保持土壤肥沃程度，進(jìn)而豐富腐生微生物的多樣性，例如擬桿菌，厚壁菌和放線菌在紅壤中的富集，這種特殊的群落結(jié)構(gòu)為從紅壤分離出具有潛在利用價值的微生物提供了線索.

綜上所述，雖然不同植被下紅壤的微生物群落整體未表現(xiàn)出顯著性差異，但不同植被下土壤細(xì)菌顯示出與相對應(yīng)植物相關(guān)的獨特的物種種類和豐度變化.同時還出現(xiàn)由于研究條件限制無法分類且豐度較高的OTUs，為繼續(xù)探索和開發(fā)未知種類的微生物信息提供了方向.