混合酵母發(fā)酵對刺葡萄酒香氣成分 氣味活性的調(diào)整作用

李愛華，王凌云，粟 俊，王倩倩，張琳尉，陶永勝,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.商洛市蠶果站，陜西 商州 726000；3.湖南刺葡萄研究中心，湖南 洪江 418200；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

我國葡萄酒產(chǎn)業(yè)方興未艾，由于大部分釀酒葡萄品種引自歐洲，產(chǎn)品多樣化受限，質(zhì)量同質(zhì)化問題突出。為實現(xiàn)中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)的本土化和多元化，我國特有的葡萄品種逐漸受到關(guān)注。刺葡萄（Vitis davidiiFo?x）是我國獨有的野生葡萄種，與鮮食葡萄相比，刺葡萄一般果粒小、果皮厚、顏色深、產(chǎn)量高，釀制的葡萄酒具有特殊的氣味特征[1]。關(guān)于刺葡萄酒的釀造研究，多數(shù)集中在刺葡萄及其酒中的營養(yǎng)功能性成分，例如色素和多酚物質(zhì)[2-3]，而對刺葡萄酒香氣淡弱的技術(shù)問題仍然缺少針對性研究，因此研究刺葡萄酒增香釀造的理論并開發(fā)相應(yīng)技術(shù)手段具有產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要意義。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）因其較高的乙醇轉(zhuǎn)化率、乙醇耐受性以及發(fā)酵純凈度，一直是葡萄酒生產(chǎn)中的主流酵母。近10年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)一些非釀酒酵母具有促進葡萄酒風(fēng)味形成的作用。然而，大多數(shù)非釀酒酵母由于乙醇的耐受性差，很難保證葡萄發(fā)酵的順利進行和完成。于是，非釀酒酵母與Sc的混合發(fā)酵成為葡萄酒增香釀造的一種有效方式[4]。截止目前，許多優(yōu)選非釀酒酵母菌株已被用于混合發(fā)酵改善葡萄酒風(fēng)味，但不同種的非釀酒酵母與Sc混合發(fā)酵的葡萄酒在香氣成分與感官質(zhì)量方面也存在較大差異[5]。發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）與Sc的混合發(fā)酵有利于增加酒中高級醇、乙酸酯以及中鏈脂肪酸的含量[6-7]。膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的參與能提高酒中C6化合物、萜烯醇和一些酯類的含量，從而增強葡萄酒的果香和花香，但也有增加動物味的風(fēng)險[8]。戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）參與的混合發(fā)酵能夠增加酒中萜烯醇的含量[9]，同時特異性地增加短鏈脂肪酸乙酯的含量，從而增強葡萄酒的果香及其香氣復(fù)雜性[10]。

漢遜屬酵母（Hanseniaspora）之前一直被認(rèn)為是啟動葡萄汁乙醇發(fā)酵的尖端酵母，其高產(chǎn)乙酸的特性不利于形成高質(zhì)量葡萄酒的風(fēng)味[11]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，一些優(yōu)選的漢遜屬酵母具有高產(chǎn)糖苷酶的能力，且其糖苷酶對葡萄酒的釀造環(huán)境有較強的適應(yīng)性[12]。此外，一些優(yōu)選漢遜屬酵母在發(fā)酵期間還能促進果香酯類物質(zhì)的生成，利于形成葡萄酒的香氣復(fù)雜性[13]。本實驗室前期在我國葡萄酒生境下篩選獲得1 株葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum，Hu），具有較高的適應(yīng)葡萄酒釀造環(huán)境的糖苷酶活性，并且在與Sc混合發(fā)酵過程中，能夠顯著促進一些果香酯類物質(zhì)的生成，明顯增強葡萄酒中的溫帶水果香氣[14-15]。本實驗研究優(yōu)選漢遜酵母菌株混合發(fā)酵對刺葡萄酒香氣質(zhì)量的調(diào)整作用，通過分析優(yōu)選Hu與Sc混合發(fā)酵對刺葡萄酒香氣成分的促進效果，旨在揭示混合發(fā)酵引起刺葡萄酒典型的品種香氣成分和發(fā)酵香氣成分的變化，確定理想的酵母接種策略，為刺葡萄酒增香釀造提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

刺葡萄：品種為“湘珍珠”，2017年10月采自湖南洪江縣“湖南刺葡萄研究中心”葡萄園（N27°14′25.49″，E110°18′10.10″），葡萄汁含糖量152.5 g/L，葡萄汁含酸量4.3 g/L（以酒石酸計），衛(wèi)生狀況良好。

1.1.2 酵母與培養(yǎng)基

Sc：CEREVISIAE釀酒酵母活性干粉（Actiflore?Laffort，F(xiàn)rance）。

Hu：本實驗室優(yōu)選，中國典型培養(yǎng)物保藏中心的菌株，保藏號為M 2013658。

培養(yǎng)基[16]：酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）、發(fā)酵培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基配制后均需121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、亞硫酸（含SO26%）（均為分析純） 天津化學(xué)試劑公司；乙酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、1-丁醇、己酸乙酯、(Z)-3-己烯-1-醇、2-辛醇、辛酸乙酯、里哪醇、2,3-丁二醇、癸酸乙酯、β-大馬酮、己酸、苯乙醇、辛酸等42 種化學(xué)標(biāo)品（均為色譜純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取（solid-phase micro extraction，SPME）裝置（配有57330-U聯(lián)用手柄、DVB/CAR/PDMS萃取纖維（50/30 μm，2 cm）） 美國Supelco公司；QP2020氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 日本島津公司；色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒釀造

刺葡萄原料200 kg，除梗破碎，同時添加60 mg/L的SO2，分裝至20 L玻璃罐中，4 ℃低溫浸漬12 h，隨后升溫至20 ℃接種酵母啟動發(fā)酵。發(fā)酵啟動后添加蔗糖使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到（11±0.5）%，控制發(fā)酵溫度25～28 ℃，每天壓皮渣帽3 次，同時監(jiān)測相對密度和溫度，待相對密度小于1.020時分離皮渣，壓榨酒繼續(xù)發(fā)酵，溫度控制在18～20 ℃之間，當(dāng)相對密度低于0.996，監(jiān)測還原糖質(zhì)量濃度，低于2 g/L時，添加60 mg/L的SO2終止發(fā)酵，將葡萄酒轉(zhuǎn)入干凈衛(wèi)生的細(xì)口玻璃瓶中滿罐密封貯藏，4 ℃貯藏，隨后進行3 次自然澄清和1 次膨 潤土（1 g/L）下膠處理，直至次年4月進行香氣成分分析。發(fā)酵各處理重復(fù)2 次。

發(fā)酵接種策略[16]：Hu與Sc細(xì)胞數(shù)量比1∶1接種，各酵母菌株經(jīng)YEPD培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后接種葡萄醪，接種量按照106CFU/mL計算。接種處理：1）Hu和Sc同時接種（CF）；2）Hu提前Sc 24 h接種（SF1）；3）Hu提前Sc 48 h接種（SF2）；4）Sc純接種（CK）。

1.3.2 香氣成分的儀器分析

SPME條件：取8 mL葡萄酒樣于裝有內(nèi)標(biāo)物質(zhì) （2-辛醇，0.4 mg/L）和磁力攪拌子的15 mL頂空瓶中，加入2.0 g NaCl，啟動攪拌子，在40 ℃水浴中平衡15 min，而后插入DVB/CAR/PDMS萃取纖維頭，40 ℃吸附30 min，立即將萃取頭在GC進樣口解吸5 min后手動進樣，進行GC-MS分析。

GC-MS條件：不分流進樣；柱升溫程序：以3 ℃/min從40 ℃升至130 ℃，再以4 ℃/min從130 ℃升至250 ℃，保持8 min；離子源、連接桿及進樣口的溫度均為250 ℃；電子源電壓70 eV；質(zhì)譜掃描范圍25～350 u，掃描頻率0.2 次/s。

定性定量方法：采用與標(biāo)準(zhǔn)品特征離子比對、NIST 2017譜庫檢索的方法定性。采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，無標(biāo)準(zhǔn)品的化合物以化學(xué)結(jié)構(gòu)相似和分子質(zhì)量相近為原則選擇標(biāo)準(zhǔn)品曲線進行定量。

1.3.3 葡萄酒中氣味成分的活性比較

通過各類揮發(fā)性成分的累積氣味活性值（即香氣成分含量與嗅覺閾值的比值，odor active value，OAV）比較不同處理酒樣的香氣質(zhì)量。首先，計算各處理酒樣中 同化學(xué)類別香氣成分的累積OAV（即Σ OAV），得到香 氣活性累積值矩陣為[Xij]，其中i代表不同化學(xué)類別，j代表不同處理樣品，然后通過歸一化處理（即除以不同處理中對應(yīng)類別的最大值Ximax）映射到[0,1]區(qū)間，得到矩陣[Yij]。對Yij作雷達(dá)圖直觀展示不同處理酒樣中不同化學(xué)類別香氣成分的氣味活性變化，進行香氣質(zhì)量比較。

1.4 數(shù)據(jù)分析

不同發(fā)酵處理間的數(shù)據(jù)差異采用單因素方差分析（ANOVA），并進行Duncan檢驗的多重比較，不同發(fā)酵處理間的香氣成分分布規(guī)律采用主成分分析（principal component analysis，PCA），數(shù)據(jù)處理運用SPSS 19.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）軟件實現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣成分的SPME-GC-MS分析

表 1 不同發(fā)酵處理酒樣中香氣成分的SPME-GC-MS分析Table 1 SPME-GC-MS analysis of aroma compounds of wine samples from different fermentation treatments

續(xù)表1

不同發(fā)酵處理酒樣中共定量分析出47 種香氣成分（表1），其中品種香氣成分13 種，包括C6化合物、萜烯類、C13-去甲類異戊二烯、硫醇、揮發(fā)性酚類、醛酮類6 類；發(fā)酵香氣成分34 種，包括高級醇、脂肪酸、酯類、苯乙基類化合物4 類。

對不同處理樣品中10 類香氣物質(zhì)進行PCA，前2 個主成分分別占總體方差的57.0%和30.5%，前2 個主成分上香氣類別的載荷及酒樣的分布見圖1。C6化合物、硫醇、揮發(fā)性酚類、醛酮類、高級醇、短鏈脂肪酸乙酯、其他酯以及苯乙基類化合物主要分布在酒樣SF2周圍，處于PC1正向端。CK酒樣在PC1負(fù)向端，周圍分布有萜烯類和C13-去甲類異戊二烯。脂肪酸和中鏈脂肪酸乙酯處于PC2正向端，CF和CK在其左右，而SF1在PC2負(fù)向端。綜合分析可得，SF2促進了大多數(shù)發(fā)酵香氣成分的生成，除硫醇外，不利于品種香氣成分的積累。

圖 1 前2 個主成分上香氣化合物類別的載荷及供試酒樣的分布Fig. 1 Loadings of various classes of aroma compounds and distribution of wine samples on the first two PCs

2.2 品種香氣分析

混合發(fā)酵酒樣中萜烯類、C13-去甲類異戊二烯化合物的含量明顯比CK酒樣中的低（表1），對于C6化合物，混合發(fā)酵卻增加了酒樣中的該類物質(zhì)含量，并且隨著Sc接種時間的延遲增加幅度越大，相比CK酒樣，SF2酒樣中的1-己醇含量顯著升高。值得注意的是，在刺葡萄干紅葡萄酒中檢測到了2 種硫醇類物質(zhì)，3-甲硫基丙酸乙酯和3-甲硫基-1-丙醇，并且與CK酒樣相比混合發(fā)酵顯著提高硫醇類化合物含量，增加量在50%左右。另一類在混合發(fā)酵樣品中含量顯著增加的是揮發(fā)性酚，丁子香酚是供試酒樣中檢測到的唯一的揮發(fā)性酚，在混合發(fā)酵酒樣中的含量顯著高于CK酒樣，且含量接近于嗅覺閾值。醛酮類物質(zhì)在不同酒樣之間差異不大。對OAV大于0.1的品種香氣成分進行PCA，結(jié)果如圖2所示。PC1和PC2分別占總體方差的52.0%和35.4%。不同發(fā)酵處理之間差異明顯，與CK相比，混合發(fā)酵增加了β-大馬酮、3-甲硫基-1-丙醇、1-己醇、丁子香酚的質(zhì)量濃度，其中含量較大的里哪醇與β-紫羅蘭酮的含量遠(yuǎn)不及CK酒樣中的多，這也是混合發(fā)酵引起萜烯類和C13-去甲類異戊二烯化合物含量下降的主要原因。

圖 2 前2 個主成分上品種香氣成分的載荷及供試酒樣的分布Fig. 2 Loadings of varietal aroma compounds and distribution profiles of wine samples on the first two PCs

2.3 發(fā)酵香氣分析

對于發(fā)酵香氣成分，混合發(fā)酵顯著增加了刺葡萄酒中高級醇的含量，但其總質(zhì)量濃度低于250 mg/L（表1）。 混合發(fā)酵酒樣中，異丁醇、1-丁醇、異戊醇、1-辛醇、 3-甲基-1-戊醇、3-乙氧基-1-丙醇和2,3-丁二醇的含量顯著高于CK酒樣，其中異戊醇的OAV大于1，1-丁醇和2,3-丁二醇的OAV小于0.1，其余OAV在0.1～1之間。供試酒樣中一共檢測到15 種酯類物質(zhì)，概括為乙酸酯、短鏈脂肪酸乙酯、中鏈脂肪酸乙酯和其他酯類。由表1可見，順序接種處理顯著提高了刺葡萄酒中乙酸酯的含量，其中乙酸乙酯的質(zhì)量濃度是CK酒樣中的2～4 倍，這是因為SF2處理中Hu存活時間較長，產(chǎn)生的乙酸及其酯類也更多。乙酸酯中乙酸異戊酯含量顯著增加，且其OAV大于1，賦予刺葡萄酒香蕉香氣特征。供試酒樣中檢測出3 種短鏈脂肪酸乙酯，分別為2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯和丁酸乙酯，它們的OAV均大于1，CF和SF2處理顯著提高了它們的質(zhì)量濃度，可增強葡萄酒的果香。而混合發(fā)酵顯著降低了刺葡萄酒中中鏈脂肪酸乙酯的質(zhì)量濃度，尤其是順序接種處理。此外，混合發(fā)酵顯著提高了刺葡萄酒中其他酯的質(zhì)量濃度，尤其是乳酸乙酯，含量比CK酒樣中增加了約50%。相比CK酒樣中的脂肪酸含量，順序接種處理酒樣中的含量顯著降低，而CF酒樣中的含量卻明顯升高，這與中鏈脂肪酸乙酯的含量變化一致。對于苯乙基類化合物，混合發(fā)酵顯著提高了苯乙基類化合物的含量，其中SF2處理中的含量是CK酒樣中的1.8 倍（表1）。

圖 3 前2 個主成分上發(fā)酵香氣成分的載荷及供試酒樣的分布Fig. 3 Loadings of fermentative aroma volatiles and distribution profiles of wine samples on the first two PCs

對OAV大于0.1的發(fā)酵香氣成分進行PCA，PC1、PC2分別占數(shù)據(jù)總體方差的45.7%和43.8%，前2 個主成分上發(fā)酵香氣成分的載荷及供試酒樣分布見圖3。分析可見，不同接種處理對發(fā)酵香氣成分含量的影響大不一樣，混合發(fā)酵明顯增加了刺葡萄酒中的發(fā)酵香氣成分含量，其中順序接種處理明顯有利于乙酸酯類、短鏈脂肪酸乙酯類和苯乙基類成分的增加，CF處理在乙醇酯和脂肪酸含量上有優(yōu)勢，而CK酒樣僅在中鏈脂肪酸乙酯含量上較高。

2.4 累積氣味活性分析

圖 4 不同發(fā)酵處理的刺葡萄酒樣中各類揮發(fā)性成分的累積氣味活性比較Fig. 4 Comparison of cumulative odor activity values of all volatile chemicals in wine samples from different fermentation treatments

將供試葡萄酒中不同化學(xué)類別的揮發(fā)性成分的OAV累積，并作不同發(fā)酵處理之間的數(shù)據(jù)歸一化處理，比較結(jié)果如圖4所示。混合菌種發(fā)酵處理不利于刺葡萄酒中品種香氣成分的氣味表現(xiàn)，盡管C6化合物、揮發(fā)性酚和硫醇的OAV有所提高，但由表1可知，混合發(fā)酵并沒有讓其質(zhì)量濃度超過嗅覺閾值，反而重要的萜烯類和C13-去甲類異戊二烯類化合物的氣味活性明顯下降。混合發(fā)酵提高了刺葡萄酒中發(fā)酵香氣成分的氣味活性，CF在乙醇酯的氣味活性上有明顯優(yōu)勢，而順序接種提高了乙酸酯和苯乙基類化合物的氣味活性，尤其是SF2處理。根據(jù)來源于刺葡萄酒原料和乙醇發(fā)酵中各類氣味成分的香氣特征，CF和SF2處理酒樣相比CK酒樣有較好的果香和花香，其中CF果香更好，SF2花香更濃。

3 討 論

本研究混合發(fā)酵處理顯著影響了刺葡萄酒中香氣成分的化學(xué)輪廓，并且對品種香氣成分和發(fā)酵香氣成分的影響作用有刺葡萄和接種方式的獨特性。品種香氣成分主要來源于葡萄果皮中香氣前體物質(zhì)的水解[27]，主要有萜烯類、C13-去甲類異戊二烯化合物、C6化合物等，其含量決定了葡萄酒香氣的品種典型性。萜烯類化合物是由葡萄萜烯類香氣糖苷在乙醇發(fā)酵過程中酶解釋放，里哪醇是葡萄酒中含量較高的萜烯醇，對葡萄酒香氣有積極作用[28]。C13-去甲類異戊二烯化合物源于葡萄中類胡蘿卜素的分解，其中β-大馬酮、β-紫羅蘭酮是非芳香型葡萄品種酒中較為重要的揮發(fā)性香氣物質(zhì)[29]。本研究中，混合發(fā)酵降低了萜烯類和C13-去甲類異戊二烯化合物的含量，這與先前在歐亞種葡萄中增香釀造的結(jié)果相悖[8-9]。 可能這兩類物質(zhì)的前體在刺葡萄中的含量比歐亞種葡萄少，混合發(fā)酵促進前體水解的游離態(tài)物質(zhì)隨發(fā)酵過程揮發(fā)損失，造成混合發(fā)酵酒樣中這些物質(zhì)的含量較低。混合發(fā)酵增加了刺葡萄酒中C6化合物和揮發(fā)性酚類的含量，并且增加幅度隨Sc接種時間的延遲而加大。高含量的C6化合物常常是葡萄酒生青味的原因，較高含量的揮發(fā)性酚也會帶給葡萄酒香氣的負(fù)面效應(yīng)，但累積OAV分析說明混合發(fā)酵對這兩類物質(zhì)的氣味促進作用有限。刺葡萄酒中硫醇類物質(zhì)含量較高，并且本研究中混合發(fā)酵提高了該類物質(zhì)的含量。Gil等[30]發(fā)現(xiàn)在Hu參與的混合發(fā)酵Monastrell葡萄酒中3-甲硫基-1-丙醇的含量顯著升高，且具有果香貢獻。3-甲硫基丙酸乙酯是一種較罕見的香氣物質(zhì)，目前僅在瓊瑤漿、玫瑰香葡萄酒中鑒定出少量的該物質(zhì)[31]。由此推斷，增加的硫醇類物質(zhì)可能會給刺葡萄酒的果香帶來積極影響。

葡萄酒發(fā)酵香氣成分主要來源于酵母在乙醇發(fā)酵過程中的代謝副產(chǎn)物，高級醇是其中含量最多的一類化合物，有研究表明，葡萄酒中低于300 mg/L的高級醇會帶來令人愉悅的香氣復(fù)雜性[32]。本研究中，混合發(fā)酵雖然顯著增加了刺葡萄酒中高級醇的含量，但總質(zhì)量濃度低于300 mg/L，有6 種高級醇OAV大于0.1，說明Hu和Sc的混合發(fā)酵能夠增強刺葡萄酒的醇香特征。酯類物質(zhì)是葡萄酒中含量僅次于高級醇的發(fā)酵香氣成分，本研究順序接種處理顯著提高了刺葡萄酒中乙酸酯的質(zhì)量濃度，這是Hu菌株具有高產(chǎn)乙酸的特性所致[11]。值得注意的是，混合發(fā)酵增加了刺葡萄酒中果香類短鏈脂肪酸乙酯的含量，卻顯著降低了中鏈脂肪酸乙酯的含量，尤其是順序接種處理，這與Hu和Sc混合發(fā)酵在歐亞種葡萄酒處理中的結(jié)果[15]相悖，這可能是刺葡萄品種本身的差異所引起的，值得深入研究。對于其他酯類，雖然混合發(fā)酵顯著提高了乳酸乙酯和琥珀酸二乙酯的質(zhì)量濃度，但由于其OAV較低，增加的幅度不足以影響香氣質(zhì)量。脂肪酸是乙醇發(fā)酵過程中酵母的正常代謝產(chǎn)物，也是維持酯類水解平衡的重要物質(zhì)，但是較高含量的脂肪酸（～11 mg/L） 會給葡萄酒帶來酸臭味[33]。本研究中，順序接種處理酒樣中的脂肪酸含量顯著降低，而CF酒樣中的含量卻明顯升高，并且所有處理中脂肪酸的質(zhì)量濃度低于 5 mg/L。苯乙基類化合物通常具有玫瑰花的香氣特征，對葡萄酒的香氣質(zhì)量可產(chǎn)生積極的影響。有研究揭示，嗜高壓有孢漢遜酵母（H. osmophila）與Sc混合發(fā)酵可使歐亞種葡萄酒中乙酸苯乙酯的含量提高了2～8 倍[34]。 本研究中，優(yōu)選菌株的混合發(fā)酵顯著提高了苯乙基類化合物的含量，對刺葡萄酒香氣質(zhì)量的改善具有重要的促進作用。綜合考慮刺葡萄酒的品種和發(fā)酵香氣，相比于CK，CF和SF2處理對果香和花香類氣味成分具有良好的促進作用。

總體上，刺葡萄酒中品種香氣成分的總體質(zhì)量濃度較低，而優(yōu)選Hu和Sc混合發(fā)酵通過促進發(fā)酵香氣成分的生成有利于刺葡萄酒香氣質(zhì)量的提升，且CF處理對果香類氣味成分具有較好的促進作用，間隔48 h的順序接種處理對花香類成分的促進效果更好。