乳酸菌復(fù)配對(duì)紅腸發(fā)酵中N-亞硝胺 生成的抑制作用

李秀明，楊 華，王 洋，仇泓博，吳晨燕，熊鳳嬌，劉靜靜，馬儷珍,

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；3.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384）

紅腸是我國(guó)的傳統(tǒng)肉制品，味道鮮嫩脆彈，色澤紅艷，受人喜愛，在東北地區(qū)具有廣闊的消費(fèi)市場(chǎng)。在紅腸加工過程中常添加亞硝酸鹽，可起到發(fā)色、抑菌、抗氧化、提高風(fēng)味的作用，但成品中殘留的亞硝酸鹽有時(shí)會(huì)超標(biāo)（30 mg/kg），對(duì)人體造成危害[1]。亞硝酸根在酸性條件（如呈微酸性的食品或人體胃酸環(huán)境）會(huì)生成一些不穩(wěn)定的氮氧化物[2]，和二級(jí)胺類物質(zhì)結(jié)合生成具有致癌、致畸和致突變性的N-亞硝胺[3]。此外，制作紅腸的原料肉中富含蛋白質(zhì)、各種氨基酸，經(jīng)蛋白酶和氨基酸脫羧酶作用會(huì)生成某些胺類物質(zhì)[4]，亦為N-亞硝胺的形成提供了充足的前體物。因此在紅腸制作過程中如何控制產(chǎn)品中N-亞硝胺生成量，對(duì)于食品安全和品質(zhì)控制具有十分重要的意義。

目前對(duì)于如何阻斷腌肉制品中N-亞硝胺的形成，主要從原料選擇[5]、加工方式[6]、外源添加物（抗壞血酸鈉、VE、茶多酚等）等方面進(jìn)行控制[7-8]。近年來，對(duì)益生菌的研究相繼成為關(guān)注焦點(diǎn)。有研究表明，微生物發(fā)酵如植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、戊糖片球菌等[9-10]具有降低N-亞硝胺前體物亞硝酸鹽的能力，部分乳酸菌如彎曲乳桿菌、戊糖乳桿菌等[11-13]可直接降解N-亞硝胺。因此利用微生物發(fā)酵技術(shù)（特別是益生菌發(fā)酵）降低肉制品中N-亞硝胺的形成是值得深入探究的課題。然而，目前發(fā)酵劑種類和不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)肉制品中N-亞硝胺的抑制效果方面的研究報(bào)道還較少。

本實(shí)驗(yàn)將發(fā)酵技術(shù)引入傳統(tǒng)紅腸的加工工藝中，在肉餡中分別接種4 種常應(yīng)用于發(fā)酵肉制品的商業(yè)復(fù)合乳酸菌發(fā)酵劑和經(jīng)篩選得到的3 株可降低發(fā)酵風(fēng)干腸中N-亞硝胺的乳酸菌單菌，發(fā)酵不同的時(shí)間，經(jīng)過熟制得到發(fā)酵紅腸新產(chǎn)品。通過對(duì)產(chǎn)品的感官評(píng)定、pH值、乳酸菌數(shù)、亞硝酸鹽、生物胺和N-亞硝胺等相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，同時(shí)與空白對(duì)照組對(duì)比，分析乳酸菌發(fā)酵劑及發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵紅腸安全品質(zhì)的影響，也為乳酸菌發(fā)酵劑在食品中的應(yīng)用提供了理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬后腿肉、豬肥膘 天津市康寧肉制品有限公司； 淀粉、大蒜、雞蛋 天津市紅旗農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；SHI-59（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳桿菌）、WBX-43（肉葡萄球菌+木糖葡萄球菌）、PRO-MIX5（木糖葡萄球菌+清酒乳桿菌+類植物乳桿菌）、VBM-60（木糖葡萄球菌+肉葡萄球菌+戊糖片球菌+乳酸片球菌） 意大利薩科公司；彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus，Lc）、戊糖乳桿菌（L. pentosus，Lp）和清酒乳桿菌 （L. sake，Ls）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部乳品科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

MRS固體培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司；乙腈、二氯甲烷（色譜純）、氯化鈉、無水硫酸鈉、硼酸 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；高氯酸、丙酮、丹磺酰氯、硝酸鈉和亞硝酸鈉標(biāo)品 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；8 種生物胺（色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺及亞精胺）標(biāo)品、9 種N-亞硝胺標(biāo)品： N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-甲基乙基亞硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-二丁基亞硝胺（N-nitrosodibutylamide，NDBA）、N-二丙基亞硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-亞硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDPheA） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀（配備氮磷檢測(cè)器）、1200高效液相色譜儀（配備紫外吸收檢測(cè)器） 美國(guó)安捷倫公司；P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀（配備紫外檢測(cè)器） 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾勒公司；PB-10酸度計(jì) 德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；BPX-82恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海博訊儀器設(shè)備有限公司；BJRJ-82絞肉機(jī)、BVBJ-30F真空攪拌機(jī)、BYXX-50煙熏爐 浙江嘉興艾博實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵紅腸的加工方法

各實(shí)驗(yàn)組紅腸的工藝流程：原料選擇→腌制→拌餡（接種）→灌腸→發(fā)酵→干燥→煙熏→蒸煮→烘烤→冷卻→成品。

腌制：稱取用絞肉機(jī)絞碎的豬后腿肉1 600 g，添加料酒40 g、食鹽56 g、葡萄糖8 g、白糖8 g、復(fù)合磷酸鹽8 g、抗壞血酸鈉1.1 g、亞硝酸鈉0.3 g、水80 mL，于4 ℃冰箱中腌制20 h。

拌餡灌腸：向腌好的肉中加入肥膘丁400 g、淀粉160 g、蒜泥40 g、白胡椒粉4.8 g、雞蛋160 g、冰水320 g，在此步驟接種不同種類的乳酸菌發(fā)酵劑，再用真空攪拌機(jī)充分拌勻后灌腸。

發(fā)酵：于35 ℃，80%相對(duì)濕度條件下發(fā)酵。

熟制：將灌好的腸經(jīng)溫水漂洗、排氣后于煙熏爐中熟制，熟制參數(shù)為：干燥70 ℃ 60 min、煙熏85 ℃ 60 min、蒸煮85 ℃ 60 min、烘烤75 ℃ 60 min。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共分為8 組：空白對(duì)照（control check，CK）組，不接種發(fā)酵劑。其余7 組分別接種4 種商業(yè)復(fù)合發(fā)酵劑（SHI-59組、WBX-43組、PRO-MIX5組和VBM-60組）和3 株單菌（Lc組、Lp組和Ls組）。

將以上不同菌株在拌餡時(shí)以107CFU/g添加量加入，分別發(fā)酵12、16、20、24 h，在不同的發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定樣品的乳酸菌數(shù)變化，并將發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行熟制，冷卻后得到成品，取樣進(jìn)行感官評(píng)定、pH值、亞硝酸鹽、硝酸鹽、生物胺、N-亞硝胺的測(cè)定。CK組不接菌不發(fā)酵，僅測(cè)定熟制后成品的各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.3.1 感官評(píng)定方法

表 1 發(fā)酵紅腸成品的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented sausage products

選擇10 位經(jīng)培訓(xùn)合格的感官評(píng)定人員先對(duì)4 個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的各組紅腸進(jìn)行初步篩選，排除口感上無法接受的組別，再對(duì)剩余各組發(fā)酵紅腸成品按照表1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)定。

1.3.3.2 乳酸菌數(shù)的測(cè)定

參照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》方法。

1.3.3.3 pH值的測(cè)定

參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》方法。

1.3.3.4 亞硝酸鈉和硝酸鈉的測(cè)定

使用毛細(xì)管電泳法[14]同時(shí)測(cè)定樣品中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量。

1.3.3.5 生物胺的測(cè)定

參照杜智慧[15]的方法測(cè)定樣品中的8 種生物胺：色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺及亞精胺。

1.3.3.6 N-亞硝胺的測(cè)定

參照GB 5009.26—2016《食品中N-亞硝胺類化合物的測(cè)定》測(cè)定樣品中的9 種N-亞硝胺（NDMA、NDEA、NMEA、NDBA、NDPA、NPIP、NPYR、NMOR、NDPheA），同時(shí)用外標(biāo)法分析定量。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵12 h的7 組紅腸成品與CK組感官評(píng)價(jià)結(jié)果

表 2 7 組發(fā)酵紅腸和CK組的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of control and experimental fermented sausages

發(fā)酵紅腸加工中，經(jīng)接種7 種發(fā)酵劑，并發(fā)酵不同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)（12 h→24 h），發(fā)酵紅腸的氣味及滋味明顯變差，發(fā)酵16 h及以上產(chǎn)生明顯的酸味且不被感官評(píng)價(jià)者所接受，因此本研究?jī)H對(duì)發(fā)酵至第12小時(shí)的不同發(fā)酵紅腸產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)定。如表2所示， 8 組紅腸產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)由好到差依次為：SHI-59＞CK＞ Lc＞Ls＞Lp＞W(wǎng)BX-43＞PRO-MIX5＞VBM-60。其中SHI-59組發(fā)酵紅腸感官更容易被人接受，該組發(fā)酵紅腸口感微酸、有發(fā)酵香味、無異味、切片性良好、發(fā)色正常、滋味較好，接受度較高。VBM-60組則口感偏酸，發(fā)酵異味感較重，接受度較低。造成不同組口感區(qū)別的原因可能是由于不同乳酸菌發(fā)酵劑活力存在差異，雖在同一發(fā)酵時(shí)間，但不同組發(fā)酵程度不同；且發(fā)酵劑菌種組成不同，可能是由于發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如香味、滋味等成分[16]存在較大差異。

2.2 不同乳酸菌復(fù)配組在發(fā)酵的不同時(shí)間點(diǎn)乳酸菌數(shù)動(dòng)態(tài)變化

表 3 各組樣品在不同發(fā)酵時(shí)間的乳酸菌數(shù)變化Table 3 Changes in lactic acid bacterial number with fermentation time

如表3所示，在發(fā)酵至第12小時(shí)，PRO-MIX5和VBM-60兩組的乳酸菌總數(shù)分別達(dá)到8.64（lg（CFU/g）） 和8.40（lg（CFU/g）），菌活性較強(qiáng)，而其他各組乳酸菌數(shù)均在5.16～6.79（lg（CFU/g））范圍。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，各組乳酸菌數(shù)整體呈上升趨勢(shì)，但SHI-59組、VBM-60組、Ls組在發(fā)酵20 h后乳酸菌數(shù)有所下降，可能是由于在發(fā)酵后期，乳酸菌進(jìn)入衰亡期。Lc和Lp組在發(fā)酵12～24 h期間乳酸菌數(shù)呈緩慢上升趨勢(shì)，且均顯著低于其他組（P＜0.05），說明這兩組發(fā)酵劑活力低或不適宜在這一體系中生長(zhǎng)。不同乳酸菌發(fā)酵劑活力不同，進(jìn)入衰亡期的時(shí)間以及最大菌活力也有所差異[17]，如WBX-43組在發(fā)酵至第20小時(shí)乳酸菌數(shù)已達(dá)到9.04（lg（CFU/g））， 顯著高于其他各組（P＜0.05）。由此可見，不同的乳酸菌發(fā)酵劑具有不同的活力，其在不同發(fā)酵時(shí)間菌數(shù)的增長(zhǎng)速度以及生長(zhǎng)特性亦有較大差異，因此篩選在紅腸肉餡體系中適宜生長(zhǎng)的發(fā)酵劑顯得尤為重要。

2.3 不同乳酸菌復(fù)配組紅腸成品的pH值隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化

如圖1所示，各組pH值均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，其中PRO-MIX5和VBM-60組的pH值顯著低于其他5 組（P＜0.05），在發(fā)酵至第12小時(shí)，pH值分別為5.24和5.34，與表3中乳酸菌數(shù)變化趨勢(shì)一致，這是由于這兩組乳酸菌數(shù)增長(zhǎng)較快，生成的乳酸量大。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得CK組pH值為6.4，WBX-43、SHI-59、Lc、Lp、Ls在發(fā)酵至第12小時(shí)pH值差異不顯著，且均略低于CK組，當(dāng)發(fā)酵至第16小時(shí)，5 組之間的pH值顯示出顯著差異 （P＜0.05），這種趨勢(shì)一直保持到發(fā)酵24 h，此時(shí)5 組pH值下降程度由大到小順序依次為：WBX-43＞Ls＞SHI-59＞Lc＞Lp，這與乳酸菌發(fā)酵劑的產(chǎn)酸能力和活力有關(guān)[18]。

圖 1 7 組發(fā)酵紅腸的pH值隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化Fig. 1 Changes in pH during sausage fermentation

2.4 不同乳酸菌復(fù)配組紅腸成品的硝酸鈉和亞硝酸鈉隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化

7 組發(fā)酵紅腸的硝酸鈉和亞硝酸鈉隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化見圖2。CK組亞硝酸鈉含量為41.63 mg/kg， 從圖2A可以看出，PRO-MIX5和VBM-60組在第12小時(shí)亞硝酸鈉含量明顯低于其他5 組，其含量分別為 7.58 mg/kg和11.01 mg/kg，且隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，亞硝酸鈉殘留量變化不顯著（P＞0.05），這是由于這兩組發(fā)酵劑在發(fā)酵初期菌活力已呈較高狀態(tài)，產(chǎn)生了大量乳酸和亞硝酸鹽還原酶降解亞硝酸鈉[19-20]，而在發(fā)酵后期作用不顯著；其他5 組亞硝酸鈉殘留量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)整體呈不同程度的下降趨勢(shì)。張慶芳等[21]研究報(bào)道，當(dāng)pH＞4.5時(shí)，亞硝酸鹽主要以酶降解為主，在整個(gè)發(fā)酵過程中，各組pH值均在4.5以上，說明各組在發(fā)酵過程中對(duì)亞硝酸鹽的降解主要是亞硝酸鹽還原酶的作用[22]，且偏酸性的環(huán)境也為降解率做出了一定的貢獻(xiàn)。

硝酸鹽對(duì)人體無直接毒性，國(guó)標(biāo)中規(guī)定西式火腿中硝酸鹽和亞硝酸鹽的最大使用量分別為0.5 g/kg和 0.15 g/kg，限定亞硝酸鹽殘留量分別為30 mg/kg和70 mg/kg， 但對(duì)硝酸鹽殘留量并未限定[23]。但其會(huì)在口腔或胃液中硝酸鹽還原菌作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，表現(xiàn)為亞硝酸鹽的作用毒性[24]。若產(chǎn)品中硝酸鹽含量較多，在貯存期間一些腐敗菌對(duì)硝酸鹽還原，將會(huì)使肉制品存在潛在的安全隱患。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得CK組中硝酸鈉含量為161.00 mg/kg， 由圖2B可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組發(fā)酵紅腸中硝酸鹽含量呈降低趨勢(shì)，說明接菌發(fā)酵后可降低發(fā)酵紅腸中硝酸鹽含量，但整體測(cè)得的含量相對(duì)較高，均在90 mg/kg以上。其中VBM-60組在發(fā)酵12 h即能夠較好地降低硝酸鹽含量，這可能是由于該組發(fā)酵菌活力相對(duì)較強(qiáng)，產(chǎn)生了一些可降解硝酸鹽的還原酶，被菌體本身生長(zhǎng)所利用，亦有可能被轉(zhuǎn)化為含氮物質(zhì)與胺類結(jié)合形成N-亞硝胺。

圖 2 7 組發(fā)酵紅腸發(fā)酵不同時(shí)間亞硝酸鈉和硝酸鈉含量的變化Fig. 2 Changes in sodium nitrite and sodium nitrate contents during sausage fermentation

2.5 不同乳酸菌復(fù)配組紅腸成品的生物胺含量隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化

生物胺是一類脂肪族、芳香族或雜環(huán)類低分子含氮化合物，在發(fā)酵香腸中生物胺的含量與原料肉的品質(zhì)、發(fā)酵劑種類、發(fā)酵溫度、pH值、含鹽量、生物胺氧化酶、添加劑等因素有關(guān)[25]，它主要是由于微生物作用蛋白質(zhì)使其降解為氨基酸，再由氨基酸脫羧反應(yīng)生成，在調(diào)節(jié)核酸和蛋白質(zhì)的合成、生物膜穩(wěn)定性以及生長(zhǎng)發(fā)育方面均有著重要作用[26]，但過量攝入生物胺則對(duì)身體有極大危害。目前僅有部分國(guó)家對(duì)食品中生物胺制定了限量標(biāo)準(zhǔn)，如歐盟規(guī)定食品中組胺和酪胺含量分別不得超過100 mg/kg和100～800 mg/kg，國(guó)內(nèi)僅在上海地方標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定發(fā)酵肉制品組胺不得超過100 mg/kg[27]。

由表4可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組發(fā)酵紅腸中8 種生物胺含量在逐漸增多，這是由于隨著乳酸菌數(shù)增加，脫羧酶活性增強(qiáng)，使得蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生了生物胺；且生物胺作為細(xì)胞生長(zhǎng)過程中重要的物質(zhì)，總生物胺也會(huì)隨乳酸菌數(shù)增長(zhǎng)而增多。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各組發(fā)酵紅腸在不同發(fā)酵時(shí)間均檢測(cè)出腐胺和精胺，發(fā)酵12～20 h，各組紅腸中所產(chǎn)生的腐胺和精胺含量呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，而在20～24 h之間變化不顯著（P＞0.05）。在發(fā)酵至第12小時(shí)，Lc和Ls組兩組除腐胺和精胺外，還檢測(cè)出尸胺和酪胺，腐胺和尸胺作為一種二胺，能夠和亞硝酸鹽反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物N-亞硝胺，常見的生物胺中以組胺毒性最大，其次是酪胺[28]，因此相比之下用Lc和Ls發(fā)酵的紅腸產(chǎn)品安全品質(zhì)相對(duì)較低。

表 4 7 組發(fā)酵紅腸的生物胺含量隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化Table 4 Changes in biogenic amines contents during sausage fermentation

隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，脫羧酶活性不斷增強(qiáng)，發(fā)酵紅腸中生物胺種類逐漸增多，且含量明顯增加，如苯乙胺、尸胺、酪胺。Lc組尸胺含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯上升趨勢(shì)，且由于各組乳酸菌發(fā)酵劑的特性不同，其他各組也在不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)生了一定量的酪胺。值得注意的是在發(fā)酵至第24小時(shí)，VBM-60、Lc和Lp組中產(chǎn)生了組胺。雖然其含量并未超過一些標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，但是此時(shí)各組發(fā)酵紅腸生物胺含量均較高。因此相比之下發(fā)酵時(shí)間以12 h為好，此時(shí)Lp組腐胺（144.50 mg/kg）和精胺含量（57.32 mg/kg）、Ls組精胺含量（59.14 mg/kg）顯著低于CK組（腐胺：181.25 mg/kg；精胺：129.09 mg/kg） （P＜0.05），其中Lp組總生物胺含量（201.81 mg/kg）顯著低于其他各組（P＜0.05），結(jié)合乳酸菌數(shù)變化，這可能是由于Lp和Ls菌活力弱，所產(chǎn)生的蛋白酶以及氨基酸脫羧酶活力低的緣故。相較于CK組，SHI-59、 PRO-MIX5、VBM-60、Ls組與CK組8 種生物胺的總含量之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.6 不同乳酸菌復(fù)配組紅腸成品的N-亞硝胺含量隨不同發(fā)酵時(shí)間的變化

表 5 CK組紅腸9 種N-亞硝胺含量Table 5 Contents of 9 N-nitrosamines in control group μg/kg

對(duì)照CK組紅腸中9 種N-亞硝胺含量如表5所示，7 組發(fā)酵紅腸中9 種N-亞硝胺總量隨發(fā)酵時(shí)間的變化如表6所示。

表 6 7 組發(fā)酵紅腸發(fā)酵不同時(shí)間9 種N-亞硝胺總量的變化Table 6 Changes in total amount of N-nitrosamines during sausage fermentation μg/kg

由表6可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，除PRO-MIX5和Lc組外，各組紅腸所含N-亞硝胺總量呈逐漸降低趨勢(shì)，這可能是由于在發(fā)酵過程中乳酸菌大量增長(zhǎng)，產(chǎn)生一些可降解N-亞硝胺的酶系[29]，或菌體本身對(duì)一些 N-亞硝胺具有吸附作用[30]，降解或吸附了發(fā)酵前期產(chǎn)生的部分N-亞硝胺。發(fā)酵至第12小時(shí)，PRO-MIX5和Lc組中 N-亞硝胺總量顯著低于CK組（表5），經(jīng)短時(shí)間發(fā)酵即可起到降低產(chǎn)品中N-亞硝胺的作用。在隨后發(fā)酵16～24 h范圍時(shí)，除發(fā)酵至第16小時(shí)的SHI-59、PRO-MIX5、Lp組和發(fā)酵至第20小時(shí)的PRO-MIX5組外，其余各時(shí)間點(diǎn)的各組發(fā)酵紅腸所含N-亞硝胺總量均顯著低于CK組 （P＜0.05）；特別是當(dāng)發(fā)酵至第24小時(shí)，各組N-亞硝胺總量均顯著下降，抑制效果十分顯著。

目前國(guó)標(biāo)僅限量肉制品中NDMA含量為3 μg/kg[31]，本實(shí)驗(yàn)中CK組中NDMA含量為5.15 μg/kg（表5），超過了國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)接菌發(fā)酵后，部分乳酸菌發(fā)酵劑可抑制NDMA的形成，且發(fā)酵劑的組成不同，活性也有差異，因此在不同發(fā)酵時(shí)間NDMA含量動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)區(qū)別較大。由圖3可以看出，WBX-43、Lp組中NDMA含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著降低趨勢(shì)，Ls組在發(fā)酵12～20 h，NDMA含量呈顯著降低趨勢(shì)，但在發(fā)酵后期至第24小時(shí)，NDMA含量有所升高，可能是由于在發(fā)酵后期NDMA蓄積；VBM-60組在發(fā)酵過程中NDMA含量相較于其他發(fā)酵組整體較低；Lc組則除發(fā)酵至第20小時(shí)有所升高，其他發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)均較低，說明在應(yīng)用該種發(fā)酵劑降解NDMA時(shí)，需控制一定的發(fā)酵時(shí)間才可達(dá)到較好的效果；SHI-59、PRO-MIX5兩組中的NDMA則呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)。因此對(duì)于抑制NDMA效果來看，PROMIX5、VBM-60和Lc組相對(duì)于其他各組可在較短發(fā)酵時(shí)間內(nèi)降低NDMA形成，分別使NDMA含量降低至2.91、0.77 、1.08 μg/kg。

對(duì)于除NDMA以外的其他8 種N-亞硝胺，目前無國(guó)標(biāo)規(guī)定限量。相比CK組，如圖3B、C所示，除發(fā)酵至第12、16小時(shí)的VBM-60組和發(fā)酵至第16小時(shí)的SHI-59組外，各發(fā)酵組在各個(gè)發(fā)酵時(shí)間對(duì)NMEA均有抑制效果；對(duì)于NDEA，除發(fā)酵至第12小時(shí)的SHI-59和Ls組，其余各發(fā)酵時(shí)間的各組均能顯著降低NDEA含量。如圖3E所示，在發(fā)酵至第24小時(shí)，7 種乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵的紅腸中NDBA均顯著低于CK組，這說明長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵可降低NDBA的含量；如圖3F所示，對(duì)于NPIP，SHI-59組對(duì)其抑制呈現(xiàn)較強(qiáng)規(guī)律性，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，在16～24 h，逐漸降低了該組發(fā)酵紅腸中的NPIP含量；而對(duì)于NPYR（圖3G）和NDPheA（圖3I），各個(gè)發(fā)酵組在不同發(fā)酵時(shí)間的含量并未呈現(xiàn)較強(qiáng)規(guī)律性。相反，如圖3D、H所示，接種乳酸菌發(fā)酵后對(duì)NDPA、NMOR的生成并未起到抑制效果，反而具有一定的促進(jìn)作用。

結(jié)合以上分析結(jié)果，雖然整體呈現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，N-亞硝胺含量越低的趨勢(shì)，其中PRO-MIX5和Lc兩種發(fā)酵劑在短時(shí)間內(nèi)即可起到顯著降低9 種N-亞硝胺總量的效果；對(duì)于國(guó)標(biāo)中有限定標(biāo)準(zhǔn)的NDMA，PRO-MIX5、Lc和Lp三種發(fā)酵劑在發(fā)酵至第12小時(shí)已達(dá)到較好的抑制效果，應(yīng)用效果好。

圖 3 7 組發(fā)酵紅腸發(fā)酵不同時(shí)間9 種N-亞硝胺含量的變化Fig. 3 Changes in contents of nine N-nitrosamines during sausage fermentation

3 討 論

根據(jù)以上各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組乳酸菌數(shù)以不同速度增長(zhǎng)，8 種生物胺含量逐漸升高，pH值、亞硝酸鹽和硝酸鹽殘留量則呈降低趨勢(shì)，其中硝酸鹽殘留量整體在90～169 mg/kg之間，硝酸鹽主要表現(xiàn)為亞硝酸鹽毒性，但會(huì)受到口腔中的硝酸鹽還原酶和病理狀態(tài)下胃液中的硝酸鹽還原菌作用轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[32]，本研究經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，硝酸鹽殘留量適度下降，一定程度地提高了產(chǎn)品安全性。但有所不同的是，有研究表明，亞硝酸根離子在酸性環(huán)境中更容易產(chǎn)生一些N2O3等氮氧化物和胺類物質(zhì)結(jié)合生成N-亞 硝胺[33-34]，而本研究發(fā)現(xiàn)各發(fā)酵組紅腸中9 種N-亞硝胺含量隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)均呈降低趨勢(shì)，這可能是由于乳酸菌能夠產(chǎn)生一些抑制N-亞硝胺形成的物質(zhì)，如 肖亞慶等[35]發(fā)現(xiàn)戊糖乳桿菌中位于細(xì)胞壁最外層的表層蛋白具有降解NDMA和NDEA的效果，隨著乳酸菌數(shù)增長(zhǎng)，這些可抑制N-亞硝胺的物質(zhì)不斷蓄積，從而使得所得發(fā)酵紅腸產(chǎn)品中N-亞硝胺含量降低。但發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，會(huì)使得一些生物胺含量增加，過量時(shí)會(huì)導(dǎo)致嘔吐、呼吸困難等癥狀[36]；且對(duì)于本無發(fā)酵工藝的紅腸來說，長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵對(duì)風(fēng)味破壞嚴(yán)重，口感偏酸，不能夠被品評(píng)者接受，因此選擇適度發(fā)酵12 h為佳。

本研究所篩選的7 種乳酸菌發(fā)酵劑中，其中 PRO-MIX5和VBM-60兩種乳酸菌活力最強(qiáng)，產(chǎn)酸能力、亞硝酸鹽的降解速度均顯著優(yōu)于其他各組，兩種發(fā)酵劑在適度發(fā)酵至第12小時(shí)即可顯著降低9 種N-亞硝胺含量，且PRO-MIX5組中8 種生物胺總量與CK組差異不顯著。綜合來看，PRO-MIX5提高紅腸產(chǎn)品安全品質(zhì)應(yīng)用效果較好。對(duì)于增加發(fā)酵技術(shù)的紅腸的口感，還需進(jìn)行一定的消費(fèi)引導(dǎo)，或在后期進(jìn)一步深入研究，提取乳酸菌增長(zhǎng)所產(chǎn)生的能夠抑制N-亞硝胺的物質(zhì)，直接添加至肉餡中，以達(dá)到既提高產(chǎn)品品質(zhì)又不影響產(chǎn)品風(fēng)味的效果，甚至可應(yīng)用于其他肉制品中，將會(huì)有更實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，使用PRO-MIX5乳酸菌發(fā)酵劑接種至紅腸肉餡中，經(jīng)發(fā)酵12 h，乳酸菌數(shù)達(dá)到 8.64（lg（CFU/g）），可顯著降低9 種N-亞硝胺總量至8.68 μg/kg，降低NDMA至3.07 μg/kg；紅腸pH值為5.24；顯著降低亞硝酸鹽殘留量至7.58 mg/kg，硝酸鹽含量為141.84 mg/kg；8 種生物胺總量為320.15 mg/kg，且與CK組差異不顯著。該種發(fā)酵劑相比其他6 種能夠顯著提高發(fā)酵紅腸的安全品質(zhì)，也為制作新型發(fā)酵紅腸提供了理論指導(dǎo)。