濃香型白酒發(fā)酵新老窖泥理化因子和 原核微生物群落結(jié)構(gòu)差異分析

張會(huì)敏，王艷麗，孟雅靜，王銀輝，李安軍，王志強(qiáng)，張治洲，邢新會(huì)

（1.安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，安徽 亳州 236820；2.清華大學(xué)化工學(xué)院，北京 100084；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海 264209）

中國濃香型白酒發(fā)酵是一個(gè)重要的微生物發(fā)酵研究領(lǐng)域，其在窖池中進(jìn)行。窖池窖泥中豐富的菌群發(fā)酵形成豐富的代謝產(chǎn)物，對(duì)白酒中呈香味風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要作用[1]。釀酒界有句話“千年老窖，萬年糟，好酒全憑窖池老”，經(jīng)驗(yàn)性地說明了窖泥的窖齡與白酒發(fā)酵質(zhì)量的相互關(guān)系。Wang Xueshan等[2]通過主坐標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，酒醅原核菌群在發(fā)酵中期與大曲原核菌群的差異有增大趨勢，而在整個(gè)發(fā)酵過程中則與窖泥原核菌群維持恒定關(guān)系，說明窖泥與酒醅之間存在穩(wěn)定的相互關(guān)系。Deng Bo等[3]通過變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析發(fā)現(xiàn)不同窖齡的窖泥菌群同時(shí)存在合作和抑制關(guān)系，這種共存的復(fù)雜關(guān)系導(dǎo)致窖泥菌群結(jié)構(gòu)的進(jìn)化演變。Tao Yong等[4]通過焦磷酸高通量測序研究了四川某濃香型白酒公司1、10、25 a和50 a窖齡窖泥中的原核微生物群落變化，發(fā)現(xiàn)隨著窖泥窖齡從1 a增加到25 a，窖泥菌群豐度逐漸增加，而25 a和50 a窖齡的窖泥菌群結(jié)構(gòu)無顯著差異。Liu Maoke等[5]通過Illumina高通量測序進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)40 a窖齡與400 a窖齡的窖泥菌群結(jié)構(gòu)差異不明顯。由此可知，在周期性的發(fā)酵模式影響下，窖泥菌群各種菌屬之間至少需要25 a復(fù)雜的合作與競爭作用時(shí)間，窖泥菌群結(jié)構(gòu)才基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，也就是業(yè)內(nèi)所說的老熟狀態(tài)。

在窖泥菌群老熟過程中，窖泥菌群與其所在的理化環(huán)境相互適應(yīng)，相互影響，共同轉(zhuǎn)變。窖泥老熟需要一個(gè)穩(wěn)定的過程，如果維護(hù)不當(dāng)也會(huì)造成窖泥退化。在實(shí)際生產(chǎn)中，根據(jù)窖泥狀態(tài)可以將其分為不同等級(jí)，Hu Xiaolong等[6]將窖泥分為退化、正常和優(yōu)質(zhì)3 個(gè)等級(jí)。比較分析不同等級(jí)窖泥[6]與不同窖齡窖泥[4]的理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)：退化窖泥[6]與新窖泥（10 a以下）[4]的pH值、乳酸含量等理化指標(biāo)更相近；優(yōu)質(zhì)窖泥[6]與老窖泥[4]的理化指標(biāo)更接近。因此，弄清楚窖泥的正常老熟過程對(duì)避免窖泥退化具有重要意義。Liang Huipeng等[7]對(duì)分別來自四川省和安徽省的窖泥菌群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩者退化等級(jí)窖泥的菌群組成差異不大，而兩個(gè)地區(qū)的優(yōu)質(zhì)窖泥的菌群結(jié)構(gòu)差異明顯。說明窖泥老熟過程受當(dāng)?shù)丨h(huán)境的影響，這可能也是目前來自不同產(chǎn)地的眾多濃香型白酒風(fēng)味差異的原因。

本研究選取安徽省某著名濃香型白酒公司的新窖池（4 a窖齡）和老窖池（50 a以上窖齡）的窖泥作為研究對(duì)象，分析新老窖泥的理化性質(zhì)差異、細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異、內(nèi)部菌屬之間的關(guān)系差異，并建立窖泥理化性質(zhì)與細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)之間的典型相關(guān)分析（canonical correlation analysis，CCA），以期深入解讀新老窖泥菌群差異的原因，建立窖泥老熟理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥樣本 安徽某知名濃香型白酒企業(yè)；Omega土壤DNA提取試劑盒（D5625） 美國Omega BioTek公司； AP-GX-50凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；6890氣相色譜儀（配CP-WAX 57 CB色譜柱（50 m×0.25 mm，0.2 μm）） 美國Agilent公司；Acquity超高效液相色譜（配二極管陣列檢測器和HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）） 美國Waters 公司；ICS5000+離子色譜儀（配ICS-5000+-DC電導(dǎo)檢測器） 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥樣本采集

采用九點(diǎn)取樣法[8]取窖泥樣本12 個(gè)。6 個(gè)新窖泥樣本（窖齡4 a），標(biāo)記為PM_N1～PM_N6；6 個(gè)老窖泥樣本（窖齡≥50 a），標(biāo)記為PM_O1～PM_O6。置于無菌袋中，于-80 ℃貯存，待用。

1.3.2 理化性質(zhì)分析

采用烘干法[5]檢測窖泥水分；使用pH計(jì)（FE20）檢測窖泥pH值（將新鮮窖泥與去離子水按照1∶3質(zhì)量體積比混勻靜置后檢測[6]）；采用紫外分光光度計(jì)檢測銨態(tài)氮含量[9]；采用油浴法檢測腐殖質(zhì)含量[9]；采用滴定法檢測總酯含量[10]。

將新鮮窖泥與15%甲醇溶液按照1∶9（g/mL）混勻，30 ℃超聲處理40 min后，0.22 μm濾膜過濾得到浸提液，用于檢測其中有機(jī)酸醇酯含量。使用氣相色譜檢測揮發(fā)性有機(jī)酸酯和乙醇含量：進(jìn)樣量1 μL；柱流速 1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流進(jìn)樣，分流比30∶1；柱溫箱程序升溫條件為：初始溫度35 ℃，以2 ℃/min升溫速率升溫至60 ℃，保持4 min，再以6 ℃/min速率升溫至195 ℃，保持20 min；氫火焰離子檢測器溫度250 ℃。采用液相色譜方法檢測非揮發(fā)性乳酸含量：進(jìn)樣量1 μL；流動(dòng)相為0.02 mol/L的KH2PO4溶液；柱流速 0.1 mL/min；檢測波長208 nm；柱溫30 ℃。

將新鮮窖泥與去離子水按照1∶1 0（g/m L）混勻，8 000 r/min離心5 min，取上清液過濾，用離子色譜儀檢測其可溶性K+與Ca2+濃度。離子色譜柱為IonPacTMCS12A RFICTM（4 mm×250 mm）；進(jìn)樣量25 μL；柱流速1 mL/min；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為20 mmol/L 甲基磺酸溶液，等濃度洗脫；檢測器為ICS-5000+-DC電導(dǎo)檢測器。

1.3.3 DNA提取與Illumina高通量測序

使用Omega土壤DNA提取試劑盒（D5625）提取窖泥DNA。然后，通過上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序。引物為：520F（5’-7 bp barcode+GCA CCT AAY TGG GYD TAA AGNG-3’）和802R（5’-TAC NVG GGT ATC TAA TCC-3’），擴(kuò)增16S V4區(qū)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）25 μL擴(kuò)增體系：0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶，5 μL 5×PCR Buffer，5 μL 5×High GC Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，1 μL上下游引物（10 μmol/L），8.75 μL雙蒸水。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃完全變性2 min；25 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增：98 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s；72 ℃完全延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化（AP-GX-50凝膠回收試劑盒）后，熒光定量（QuantiT PicoGreen dsDNA Assay Kit），構(gòu)建克隆文庫（TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，Illumina）。經(jīng)過Agilent 2100 Bioanlyzer確定DNA文庫合格后，進(jìn)行Illumina MiSeq雙向測序（MiSeq Reagent Kit V3）。

1.3.4 測序數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

去掉長度小于150 bp或者大于300 bp、模糊堿基數(shù)大于1、同聚堿基數(shù)目大于8、引物錯(cuò)配大于1 bp的序列（QIIME，v1.8.0）；雙向拼接（FLASH軟件[11]v1.2.7）序列、剔除嵌合體（USEARCH，v5.2.236）得到優(yōu)質(zhì)序列。UCLUST聚類（97%相似度）優(yōu)質(zhì)序列得到各可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），認(rèn)定各OTU中豐度最高的序列為其代表序列。在80%可信度水平，使用Greengene數(shù)據(jù)庫（Release 13.8）注釋各代表序列的結(jié)果即為OTU的注釋結(jié)果。通過Mothur軟件（1.36.1）得到Shannon、Chao 1等指數(shù)?；贠TU列表的主成分分析、主要OTU之間的Pearson相關(guān)性分析和CCA均通過R語言（R3.3.2）實(shí)現(xiàn)。窖泥菌群組成的差異顯著性分析通過Metastats檢測實(shí)現(xiàn)[12]。窖泥樣本理化因子之間的差異顯著性分析通過SPSS（24.0）方差分析（ANOVA）實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥樣本的理化性質(zhì)

新老窖泥的水分、腐殖質(zhì)、己酸、丁酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯含量不具有顯著性差異；兩者pH值、銨態(tài)氮、乙醇、乙酸、丙酸、乳酸、己酸乙酯、K+、Ca2+和總酯含量具有顯著性差異（表1）。老窖泥的pH值、銨態(tài)氮、乙酸和K+含量顯著高于新窖泥；而新窖泥中乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、可溶性Ca2+和總酯含量則顯著高于老窖泥。新老窖泥之間的理化性質(zhì)存在差異，說明新老窖泥菌群所處的生存環(huán)境存在差異，該差異體現(xiàn)了窖泥菌群通過其代謝作用隨著時(shí)間的推移對(duì)窖泥的作用效應(yīng)。

表 1 新老窖池窖泥樣本的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of young and old PM samples

2.2 窖泥原核微生物群落的α多樣性

表 2 新老窖泥細(xì)菌群落豐度和多樣性參數(shù)Table 2 Bacterial community richness and diversity indices of young and old pit mud samples

通過Illumina MiSeq高通量測序，得到580 157 條平均長度為207 bp的優(yōu)質(zhì)序列，平均38 795～78 904 條/樣本。對(duì)所有樣本二次抽平為38 457 條，進(jìn)行后續(xù)分析。OTU聚類（97%相似度）得到2 559 個(gè)OTU（≥3 條序列/OTU），OTU平均611～1 044 個(gè)/樣本。每個(gè)樣本的測序覆蓋率大于98%，說明測序數(shù)目足夠，測序序列可以代表其菌群組成。得到注釋（門、綱、目、科、屬）的序列大于99%，無法得到注釋的序列低于0.08%，說明對(duì)窖泥中大量的未培養(yǎng)菌也充分實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)分類。老窖泥菌群的Shannon指數(shù)顯著大于新窖泥，說明老窖泥的菌群多樣性和豐度大于新窖泥，與Tao Yong[4]和Liu Maoke[5]等的研究結(jié)論一致。老窖泥菌群的Chao 1指數(shù)略低于新窖泥菌群的Chao 1指數(shù)，說明老窖泥的菌群物種數(shù)目略低于新窖泥，但不顯著（表2）。

2.3 窖泥原核微生物群落的β多樣性

對(duì)OTU注釋，總共得到43 個(gè)門，其中41 個(gè)細(xì)菌門，2 個(gè)古菌門。分析平均相對(duì)豐度，厚壁菌門（Firmicutes）在老窖泥（69.0%）和新窖泥（73.5%）中，均為絕對(duì)優(yōu)勢菌門。與新窖泥相比，老窖泥中，擬桿菌門（Bacteroidetes，10.4% vs 3.7%）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes，7.2% vs 0.27%）和廣古菌門（Euryarchaeota，6.1% vs 1.0%）具有顯著優(yōu)勢；與老窖泥相比，新窖泥中變形菌門（Proteobacteria，15.2% vs 1.58%）和放線菌門（Actinobacteria，4.2% vs 0.59%）具有顯著優(yōu)勢。以上6 個(gè)門在老窖泥或者新窖泥中相對(duì)豐度超過1%，為優(yōu)勢門，其序列數(shù)占總測序數(shù)的96.3%，占每個(gè)樣本序列數(shù)的92.2%～99.1%。排名20 名以后的門，其總序列數(shù)小于總測序數(shù)的0.01%，為稀有菌門，如脫鐵桿菌門（Deferribacteres）。含量最多的前20 個(gè)門相對(duì)豐度如圖1所示。

圖 1 窖泥中豐度最高的20 個(gè)門的相對(duì)豐度Fig. 1 Relative abundances of the top 20 phyla in PM

對(duì)OTU注釋，共得到306 個(gè)屬，注釋度為76.87%，其余序列只能不同程度地注釋到門、綱、目、科等級(jí)別。相對(duì)豐度超過1%的優(yōu)勢菌屬為乳酸菌屬（Lactobacillus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、喜熱菌屬（Caloramator）、梭菌屬（Clostridium）、氨基酸菌（Aminobacterium）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）和沉積菌屬（Sedimentibacter）（圖2）。

對(duì)12 個(gè)窖泥樣本的OTU列表進(jìn)行主成分分析聚類（圖3），結(jié)果表明，新老窖泥樣本分別聚類，兩者在第1主成分（74.97%）的差異非常明顯，而在第2主成分（13.29%）的差異較小。兩組樣本組內(nèi)聚類效果相比，老窖泥樣本的聚類更集中，說明老窖泥菌群之間一致性更好，即該研究中老窖泥菌群已經(jīng)達(dá)到老熟狀態(tài)[4]。而新窖泥樣本聚類分散，說明各新窖泥菌群之間差異性比較大。老窖泥菌群一致性好于新窖泥菌群的一致性，與Liang Huipeng等[7]的結(jié)論一致。

圖 2 窖泥中豐度最高的20 個(gè)屬的相對(duì)豐度Fig. 2 Relative abundances of the top 20 genera in PM

圖 3 新老窖泥菌群OTU組成的主成分分析聚類圖Fig. 3 Cluster analysis of the OTU composition of old and young PMs based on principal component analysis

鑒于新老窖泥菌群聚類（圖3）分為兩組，分組分析相對(duì)豐度最多的20 個(gè)屬在新老窖泥中的菌種組成（圖4）。其20 個(gè)屬中，12 個(gè)屬的組成具有顯著差異。Ruminococcus和Lactobacillus在新老窖泥中相對(duì)豐度都很大，前者差異不顯著，后者差異顯著，其在新窖泥中的平均相對(duì)豐度（39.69%）遠(yuǎn)高于老窖泥中的平均相對(duì)豐度（5.97%）。而相對(duì)豐度排名4～8的Clostridium、Aminobacterium、Syntrophomonas、Methanoculleus和Sedimentibacter在老窖泥中的平均相對(duì)豐度比新窖泥中的平均相對(duì)豐度高5.3%～10.3%，其在新老窖泥中的組成差異可能和兩者的代謝功能差異有密切關(guān)系。Clostridium，如現(xiàn)已知克氏梭菌[13]與濃香型白酒中典型風(fēng)味物質(zhì)己酸的產(chǎn)生有關(guān)。Aminobacterium參與降解氨基酸[14-15]，很可能與提供窖泥菌群豐富的銨態(tài)氮有關(guān)。Methanoculleus參與代謝短鏈脂肪酸，產(chǎn)生甲烷，參與提高濃香型白酒的釀酒質(zhì)量[16]。Sedimentibacter可以降解氨基酸[17]，有可能與生成銨態(tài)氮有關(guān)。

圖 4 新老窖泥樣本相對(duì)豐度最高的20 個(gè)屬的相對(duì)豐度Fig. 4 Relative abundances of the top 20 genera in young and old PMs

2.4 新老窖泥中主要OTU之間的相關(guān)性分析

圖 5 新窖泥中數(shù)量最多的前50 個(gè)OTU之間的Pearson相互關(guān)系圖Fig. 5 Pearson’s r correlation among the top 50 OTUs in young PM samples

新窖泥中數(shù)量最多的50 個(gè)OTU（占82.35%）之間的Pearson關(guān)系如圖5所示。圖中顯示了OTU的排名與注釋信息，如圖5中第1個(gè)OTU，“BN24_denovo218_g_Methanocorpusoculum”即為新窖泥中數(shù)量排名第24的OTU，注釋信息為Methanocorpusoculum屬。圖中下劃線標(biāo)注的為新老窖泥所共有的14 個(gè)OTU，占新窖泥的59.17%。根據(jù)各OTU之間的相關(guān)關(guān)系，分為I組（56.42%）與II組（25.93%），組內(nèi)OTU呈強(qiáng)烈正相關(guān)，而組間呈負(fù)相關(guān)。I組可以分為兩個(gè)小組： I（A）與I（B）組，小組內(nèi)部OTU呈正相關(guān)，而彼此之間呈現(xiàn)微弱的相關(guān)關(guān)系。I（B）組中，含有一些排名比較靠前的OTU，比如排名第1（BN1_denovo2919_g_Lactobacillus）與排名第2（BN2_denovo3167_g_Ruminococcus）的OTU，兩個(gè)OTU的序列總數(shù)高達(dá)44.51%。盡管I（A）組中與老窖泥共有的OTU數(shù)目比較多，不過序列比例很低（3.8%）。推測I組和II組的OTU在組內(nèi)呈現(xiàn)協(xié)同關(guān)系，而兩組之間呈現(xiàn)競爭/拮抗關(guān)系。

圖 6 老窖泥中數(shù)量最多的前50 個(gè)OTU之間的Pearson相互關(guān)系圖Fig. 6 Pearson’s r correlation among the top 50 OTUs in old PM samples

老窖泥中數(shù)量最多的50 個(gè)OTU（72.63%）之間的Pearson關(guān)系如圖6所示。首先，老窖泥OTU之間的關(guān)系相對(duì)復(fù)雜。根據(jù)OTU之間的相互關(guān)系，可以將老窖泥OTU分為5 個(gè)小組（A、B、C、D、E），組內(nèi)OTU呈正相關(guān)，而組間既有正相關(guān)又有負(fù)相關(guān)。其次，5 組OTU的分布比較均勻。老窖泥中新老窖泥所共有的OTU，其比例由59.17%變?yōu)?0.27%，有所下降，其余OTU的增加說明老窖泥中菌種的變化。有些細(xì)菌盡管屬名沒有發(fā)生改變，其菌種及其功能已經(jīng)發(fā)生了改變。新窖泥中排名第1的OTU（BN1_denovo2919_g_Lactobacillus）在老窖泥中排名第7，新窖泥排名第2的OTU（BN2_denovo3167_g_Ruminococcus）在老窖泥排名變?yōu)榈?。兩者之間的關(guān)系也由新窖泥中的正相關(guān)變?yōu)槔辖涯嗟呢?fù)相關(guān)關(guān)系。老窖泥5 組窖泥菌群之間既有協(xié)同關(guān)系（相互依存）又有競爭關(guān)系。Deng Bo等[3]PCR-DGGE得出結(jié)論：窖泥菌群內(nèi)部合作與限制關(guān)系共存促進(jìn)了窖泥菌群的進(jìn)化演變。比較圖5與圖6，老窖泥菌群內(nèi)部既相互依存又相互競爭的關(guān)系更強(qiáng)，即隨著窖泥的老熟，窖泥菌群之間的關(guān)系更加復(fù)雜融合。

2.5 窖泥理化性質(zhì)與菌群之間的CCA

圖 7 新老窖泥差異顯著的10 個(gè)理化因子與窖泥菌群之間的CCA關(guān)系圖Fig. 7 Canonical correlation analysis of the 10 physicochemical factors that significantly differed between young and old PMs versus microbial communities in them

新老窖泥具有顯著性差異的理化因子與窖泥菌群OTU之間的CCA如圖7所示，2 個(gè)主成分可以解釋56.78%微生物菌群的變異。乙醇、乳酸、丙酸、己酸乙酯、總酯和可溶性Ca2+含量與新窖泥菌群呈正相關(guān)，表明與老窖泥相比，新窖泥中乙醇、乳酸、丙酸、己酸乙酯、總酯和Ca2+含量相對(duì)較多，推測新窖泥菌群中降解乙醇、酸（乳酸、丙酸）和酯的菌相對(duì)較少，酸和醇的存在，形成了更多的酯，如己酸乙酯在新窖泥中含量相對(duì)老窖池較多，與陳彬等[18]的研究結(jié)果一致。乙酸、銨態(tài)氮、pH值和K+含量與老窖泥菌群呈正相關(guān)，表明老窖泥中乙酸、銨態(tài)氮和pH值相對(duì)較高，說明老窖池中代謝形成乙酸、銨態(tài)氮的菌較多，同時(shí)對(duì)酸的降解和銨態(tài)氮的合成使得老窖池中pH值升高。新窖泥中存在更多的Ca2+，且已知新窖泥和退化窖泥中常有乳酸鈣結(jié)晶析出的情況[19]發(fā)生，推測可能與新窖泥的偏酸性環(huán)境有關(guān)，尤其是其中存在大量的乳酸，促進(jìn)了窖泥環(huán)境中固態(tài)鈣與乳酸之間發(fā)生酸解，產(chǎn)生更多游離態(tài)Ca2+，同時(shí)生成的乳酸鈣由于溶解度較低而析出。老窖泥中較高濃度的K+的存在有可能與其中細(xì)菌通過運(yùn)輸系統(tǒng)積累K+有關(guān)[20]。

3 討論與結(jié)論

各種理化性質(zhì)中，老窖泥的pH值、銨態(tài)氮、乙酸和K+含量相對(duì)較高；新窖泥的乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、可溶性Ca2+和總酯含量相對(duì)較高。新老窖泥理化性質(zhì)的差異造成了新老窖泥菌群生存環(huán)境的差異。新窖泥中Lactobacillus的相對(duì)豐度（39.69%）幾乎是老窖泥中相對(duì)豐度（5.97%）的7 倍。與新窖泥相比，老窖泥中豐度排名第4～8位的Clostridium（2.87% vs 8.16%）、Aminobacterium（0.015% vs 10.26%）、Syntrophomonas（0.34% vs 7.42%）、Methanoculleus（0.25% vs 7.37%）和Sedimentibacter（0.62% vs 6.43%）相對(duì)豐度差異百分比總和達(dá)到35.54%，彌補(bǔ)了老窖泥中缺失的Lactobacillus相對(duì)豐度。新老窖泥細(xì)菌菌群的組成存在巨大差異必然導(dǎo)致新老窖泥菌群的代謝功能存在差異。比如，Lactobacillus代謝產(chǎn)生乳酸且耐酸[21]，很可能與新窖泥中的高乳酸含量和低pH值特性有關(guān)；Aminobacterium[14-15]和Sedimentibacter[17]具有降解氨基酸的功能，很可能與老窖泥中銨態(tài)氮的增加有關(guān)。老窖泥中含量相對(duì)較高的Clostridium[22]、Aminobacterium[14]、Syntrophomonas[23]、Sedimentibacter[17]、Methanoculleus[24]菌屬，其適宜生存pH值比乳酸菌高，所以更宜在pH值稍高的老窖泥中生存。本研究通過高通量測序得到的新老窖泥的菌群結(jié)構(gòu)與Liang Huipeng等[7]通過PCR-DGGE得到的菌群規(guī)律基本一致，除本研究老窖泥中Actinobacteria相對(duì)豐度顯著低于新窖泥這一點(diǎn)，而Liang Huipeng等[7]指出老窖泥中Actinobacteria相對(duì)豐度高于新窖泥，并可以將其作為區(qū)分新老窖泥的依據(jù)。不過，本研究認(rèn)為Liang Huipeng等[7]通過PCR絕對(duì)定量得到的數(shù)據(jù)與本研究得到的相對(duì)定量數(shù)據(jù)并無本質(zhì)差異。很可能老窖泥中Actinobacteria的絕對(duì)含量值較高[25]，而新窖泥中Actinobacteria的相對(duì)定量值較高。

新老窖泥菌群組成的轉(zhuǎn)變除直接表現(xiàn)在種屬含量變化，還有其內(nèi)部關(guān)系變化和代謝功能變化。新窖泥菌群內(nèi)部關(guān)系相對(duì)簡單，主要表現(xiàn)在其中相對(duì)豐度占絕對(duì)優(yōu)勢的乳酸菌所在的I組（56.42%）與II組（25.93%）呈強(qiáng)烈負(fù)相關(guān)。其可能與乳酸菌的產(chǎn)乳酸和產(chǎn)細(xì)菌素[26-27]功能有關(guān)，乳酸和細(xì)菌素的抑菌功能有助于乳酸菌在菌群競爭中占優(yōu)勢。同時(shí)低pH值環(huán)境不適于不耐酸菌株的生存。老窖泥菌群的內(nèi)部關(guān)系相對(duì)復(fù)雜。新窖泥中排名第1的OTU（BN1_denovo2919_g_Lactobacillus）在老窖泥中排名第7，相對(duì)豐度由31.67%變?yōu)?.88%，盡管其所在的E組與其余各組之間多呈負(fù)相關(guān)，但其含量太少，影響較小。新窖泥排名第2的OTU（BN2_denovo3167_g_Ruminococcus），在老窖泥排名第1，其與BN1_denovo2919_g_Lactobacillus在新窖泥中的正相關(guān)轉(zhuǎn)變?yōu)槔辖涯嘀胸?fù)相關(guān)。兩者相關(guān)關(guān)系的改變可能與代謝功能的轉(zhuǎn)變有關(guān)?，F(xiàn)已知瘤胃菌科的某些菌屬[28-29]在pH 5.0～6.5具有降解乳酸生成己酸的功能。有些乳酸菌如L. buchneri，可以在pH值低于5.8的條件下降解乳酸生成乙酸和1,2-丙二醇[30]。有些梭菌如克氏梭菌[31]，在pH 5.5～7.5具有以乙醇和乙酸為碳源生成己酸的功能。隨著窖泥老熟，pH值逐漸升高，糖類匱乏但乳酸豐富，使得各種菌共同降解乳酸，成為競爭關(guān)系。同時(shí)，降解乳酸的行為又促進(jìn)了pH值的進(jìn)一步升高。另外，一些厭氧菌在與甲烷菌共存時(shí)降解脂肪酸生成乙酸和氫氣[32]， 兩者為協(xié)作關(guān)系。甲烷菌被認(rèn)為是濃香型老窖泥的標(biāo)志性菌[33]，老窖泥中很多菌與甲烷菌具有正相關(guān)關(guān)系 （圖6）。同時(shí)，甲烷菌等產(chǎn)氣菌產(chǎn)生的厭氧氣體為窖泥中的厭氧菌創(chuàng)造了更適宜的厭氧生存環(huán)境。最終，乳酸菌在老窖泥的菌群競爭中趨于劣勢。

窖泥老熟過程中，窖泥菌群逐漸適應(yīng)并改造理化環(huán)境，其自身也發(fā)展壯大?，F(xiàn)已知，安徽北部地區(qū)濃香型窖池，50 a窖齡窖泥的細(xì)菌總量比10 a窖齡窖泥的細(xì)菌總量多4 個(gè)數(shù)量級(jí)[25]。窖泥菌群數(shù)量越多，其代謝功能越強(qiáng)。窖泥中營養(yǎng)物質(zhì)主要來源于黃水。與新窖泥菌群呈正相關(guān)的乳酸、乙醇、丙酸和己酸乙酯黃水中含量豐富，說明新窖泥菌群對(duì)各組分的代謝能力差；而乙酸和銨態(tài)氮等二次代謝產(chǎn)物與老窖泥菌群正相關(guān)，說明老窖泥菌群代謝功能強(qiáng)，其中相應(yīng)代謝產(chǎn)物含量較多。以己酸乙酯為例，其由己酸和乙醇酯化形成。老窖泥菌群降解己酸和乙醇的功能強(qiáng)，使己酸乙酯的酯化平衡向分解方向進(jìn)行。所以，老窖泥中己酸乙酯含量相對(duì)較少。老窖泥中總酯含量相對(duì)較少，也是同樣的原因。一些理化性質(zhì)，如pH值，與窖泥菌群的相關(guān)性分析結(jié)果也正體現(xiàn)了窖泥菌群的作用結(jié)果。

綜上所述，在周期性發(fā)酵作用的影響下，窖泥菌群的變化與理化環(huán)境的變化相互適應(yīng)，相互影響，共同轉(zhuǎn)變。新老窖泥理化性質(zhì)的差異體現(xiàn)了窖泥菌群對(duì)窖泥的作用效應(yīng)。在窖泥菌群作用過程中，其代謝功能也逐漸發(fā)生適應(yīng)性改變。本研究深入解讀新老窖泥菌群的差異并分析其轉(zhuǎn)變原因，為窖泥的改良提供了理論依據(jù)。