代海麗 王 艷 孫 權(quán) 時(shí)連瑞

(山東英才學(xué)院醫(yī)學(xué)院,濟(jì)南 250101)

柯薩奇病毒B3(CVB3) 是單正鏈RNA病毒，屬于腸道病毒，小RNA病毒科，基因組序列全長約7.4kb，有開放讀碼框架一個(gè)。一旦感染本病毒，即會(huì)在宿主體內(nèi)進(jìn)行大量復(fù)制，造成溶細(xì)胞性感染，可導(dǎo)致宿主很快出現(xiàn)大量的細(xì)胞損傷死亡。CVB3可引發(fā)多種疾病，如肝炎、干燥綜合征、胰腺炎、病毒性心肌炎[1-2]、擴(kuò)張型心肌病[3]、無菌性腦膜炎等疾病[4]。目前應(yīng)用的各種防治方法均未起到滿意效果，需要進(jìn)一步探究更加安全的、效果更好的防治策略。

RNA干擾( RNA interference,RNAi) 近年來在抗病毒研究領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的潛力。siRNA對很多種病毒的抑制效果均比較理想[5-7]，針對siRNA抑制CVB3復(fù)制的研究目前也有很多團(tuán)隊(duì)在進(jìn)行，有研究證實(shí)VP1區(qū)[8]、2A區(qū)[9]、3C區(qū)[10]、3D區(qū)[11]均可以設(shè)計(jì)出有效的siRNA序列，Kim等[12]已證實(shí)2C區(qū)的CRE部位是設(shè)計(jì)siRNA序列的有效靶點(diǎn)。

本文將設(shè)計(jì)的siRNA序列轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，篩選抑制效果好的siRNA序列，同時(shí)探究2C區(qū)CRE以外的基因是否可以設(shè)計(jì)CVB3特異性較高的siRNA序列。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病毒和細(xì)胞 HeLa細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所細(xì)胞中心提供。CVB3 H3株是用包含CVB3基因全長的感染性克隆PMSK-1質(zhì)粒[13](登錄號(hào)U57056)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后獲得[14]，該病毒是由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)的鐘照華教授饋贈(zèng)，將其在HeLa細(xì)胞中活化，滴定該病毒滴度為108TCID50/ml。

1.1.2主要試劑和儀器 EntransterTM-R轉(zhuǎn)染試劑購自英格恩生物公司；熒光定量PCR試劑盒 Premix Ex Taq TM(DRR039) 由寶生物工程有限公司銷售提供；LEICA-HC熒光顯微鏡購自Leica公司。

1.2 方法

1.2.1病毒TCID50滴定 在96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中接種HeLa細(xì)胞，密度為5×104個(gè)細(xì)胞/孔，將細(xì)胞培養(yǎng)12h后，進(jìn)行病毒50%組織培養(yǎng)感染劑量(50% Tissue culture infective dose,TCID50)的滴定。稀釋病毒，其濃度依次為1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010，各取100μL分別加入96孔板中，每個(gè)稀釋度進(jìn)行了8個(gè)重復(fù)，第11列和12列為對照，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞的病變(cytopathic effect,CPE)，記錄結(jié)果，直至CPE的終點(diǎn)出現(xiàn)。該過程要保證設(shè)置的對照組始終保持正常的形態(tài)和特征。用Reed-Muench法計(jì)算本病毒的TCID50/ml。

1.2.2siRNA的設(shè)計(jì)、合成和標(biāo)記 CVB3基因序列在GenBank中已登錄，其登錄號(hào)為U57056，按照Elbashir等[15]及Reynolds[16]的設(shè)計(jì)原則，在CVB3的3D、3C、2C、2A、VP3、VP2和VP1區(qū)設(shè)計(jì)了siRNA序列共計(jì)11條，分別命名為siRNA1-11。增設(shè)了用FAM標(biāo)記的無關(guān)siRNA序列設(shè)置為陰性對照組siRNA-NC，陽性對照組siRNA-PC選取往年發(fā)已表驗(yàn)證的抑制效率較高的siRNA序列[10]。13條siRNA制備合成時(shí)3′端均設(shè)計(jì)了dTdT懸突(序列見表1)。合成的siRNA序列是干粉狀，將其融入DEPC水中，稀釋至終濃度為20μM，存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 siRNA序列和對應(yīng)靶區(qū)域

1.2.3確定最佳轉(zhuǎn)染條件 將FAM標(biāo)記的陰性對照序列siRNA-NC稀釋濃度分別為200nM、、150nM和100nM，EntransterTM-R(μL)：siRNA(μg)設(shè)為4∶2和5∶2， HeLa細(xì)胞接到細(xì)胞培養(yǎng)板中用不含抗生素的DMEM營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到40%左右的融合度時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染siRNA 12h后通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)觀察篩選最適宜的轉(zhuǎn)染siRNA的條件。

1.2.4轉(zhuǎn)染siRNA后感染CVB3 將濃度為150nM的siRNA和Entranster TM-R按照2∶5的比例進(jìn)行混合后轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞。本次實(shí)驗(yàn)共分16組，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、siRNA-5、siRNA-6、siRNA-7、siRNA-8、siRNA-9、siRNA-10、siRNA-11組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA序列，siRNA-PC為轉(zhuǎn)染陽性對照組，siRNA-NC為轉(zhuǎn)染陰性對照組，mock為僅加轉(zhuǎn)染試劑Entranster TM-R組，virus only組為HeLa細(xì)胞未轉(zhuǎn)染任何物質(zhì)組。于轉(zhuǎn)染后12h在以上15組HeLa細(xì)胞上分別感染0.01MOI的CVB3，sham infected是正常細(xì)胞對照組，未轉(zhuǎn)染siRNA和未感染病毒。于病毒感染HeLa細(xì)胞36h后收獲目的細(xì)胞和病毒，檢測siRNA對病毒復(fù)制的抑制效果。

1.2.5MTT法檢測抑制效率 收獲16個(gè)觀察組的目的細(xì)胞，分別加入MTT液培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液上清分別加入二甲基亞砜，在酶聯(lián)免疫檢測儀A490nm處測量各孔的吸光值。sham infected是正常細(xì)胞對照組，將其細(xì)胞的活率設(shè)定為100%，分別計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。

1.2.6Real-time RT-PCR檢測抑制效率 收獲目的細(xì)胞和病毒采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR進(jìn)行檢測，選取β-actin為內(nèi)參，將siRNA-NC處理組設(shè)置為calibrate定為1，通過相對定量方法，檢測設(shè)計(jì)的11條siRNA序列對CVB3復(fù)制的抑制情況。

1.2.7Western blot檢測VP1蛋白表達(dá)變化 收獲目的細(xì)胞，處理后樣品按20μl/孔上樣，分別用β-actin單克隆抗體(1∶5000)和VP1蛋白特異性的多克隆抗體(1∶1000)37℃孵育1h，洗膜后分別加入辣根(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗和山羊抗兔IgG二抗，孵育處理后，掃膜儀掃膜。

1.2.8毒價(jià)滴定檢測病毒抑制率 HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染13條siRNA序列12h后感染CVB3，感染病毒36h后收獲HeLa細(xì)胞，滴定病毒液上清TCID50值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染率的測定

在倒置熒光顯微鏡下觀察不同濃度下siRNA-NC的轉(zhuǎn)染率，發(fā)現(xiàn)siRNA染率在濃度為200nM和150nM時(shí)較高。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示當(dāng)siRNA濃度為150nM，EntransterTM-R(μL):siRNA(μg)=5∶2時(shí)，siRNA轉(zhuǎn)染的效率最好，確定此時(shí)為最佳轉(zhuǎn)染條件(圖1)。

2.2 siRNA在細(xì)胞病變方面對CVB3的抑制

siRNA并感染病毒36h后HeLa細(xì)胞的病變情況，發(fā)現(xiàn)三個(gè)對照組siRNA-NC、mock和virus only中大部分的HeLa細(xì)胞均已出現(xiàn)病變。siRNA-1、siRNA-2、siRNA-6三組細(xì)胞病變情況與陰性對照組相似，基本未表現(xiàn)出保護(hù)效果。siRNA-5組病變最少，siRNA-8和siRNA-4組病變次之(見圖2)。與倒置顯微鏡下觀察的細(xì)胞病變結(jié)果相似，MTT法檢測結(jié)果顯示三個(gè)對照組mock、siRNA-NC、virus only和siRNA-1、siRNA-2、siRNA-6處理組中細(xì)胞死亡率高達(dá)80%，而其它組細(xì)胞的死亡率排序依次為：siRNA-11>siRNA-10>siRNA-9>siRNA-3>siRNA-4>siRNA-8>siRNA-5。因siRNA-1、siRNA-2、siRNA-6三組siRNA未表現(xiàn)出保護(hù)效果，故在此處淘汰此三組，后期不再進(jìn)行檢測和實(shí)驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行了三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，三次重復(fù)之間進(jìn)行比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：(A)熒光顯微鏡觀察；(B)流式細(xì)胞技術(shù)檢測

注：A,倒置顯微鏡下觀察HeLa的細(xì)胞病變情況(200×); B,MTT法檢測不同組細(xì)胞存活率

圖2 siRNA對CVB3導(dǎo)致的細(xì)胞病變的抑制

2.3 RNA水平上siRNA對CVB3病毒的抑制

Real-time PCR方法結(jié)果顯示siRNA-5對病毒的抑制率最高，為84%，siRNA-8次之，為82%，siRNA-11最低僅為28%。siRNA-PC、siRNA-3、siRNA-4、、siRNA-9和siRNA-10分別為：62%、72%、80%、72%和63%。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行了三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，三次重復(fù)之間進(jìn)行比較，*P<0.05，**P<0.01(圖3)。

圖3 mRNA水平檢測siRNA的抑制效果

2.4 蛋白水平上檢測siRNA對CVB3的抑制

VP1蛋白的特異性條帶出現(xiàn)在所有感染CVB3的細(xì)胞組中，三個(gè)對照組virus only、mock和siRNA-NC處理的HeLa細(xì)胞中VP1蛋白表達(dá)的量相差不大，均較多。但siRNA-5、siRNA-8、siRNA-4處理的HeLa細(xì)胞中VP1蛋白的量明顯減少。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行了三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，三次重復(fù)之間進(jìn)行比較，*P<0.05，**P<0.01。見圖4。

2.5 siRNA處理后CVB3毒價(jià)的變化

毒價(jià)滴定結(jié)果顯示，siRNA-11對病毒的抑制率最低，與siRNA-NC相比，CVB3的毒價(jià)只降低了0.7log10。其中siRNA-5的抑制率最高，CVB3的毒價(jià)下降了2log10。與MTT、CPE、Western blot和real-time PCR結(jié)果相吻合，siRNA對CVB3的抑制率依是：siRNA-5>siRNA-8>siRNA-4>siRNA-3>siRNA-9>siRNA-10>siRNA-11(見圖5)。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行了三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，三次重復(fù)之間進(jìn)行比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖4 蛋白水平檢測siRNAsiRNA對CVB3的抑制

圖5 siRNA對 CVB3毒價(jià)的抑制

3 討論

柯薩奇病毒B3呈球形，直徑約22～30nm，為單股正鏈RNA，全長由7396個(gè)堿基組成，具有mRNA 活性和感染性[17]。依功能分區(qū)為5′端非編碼區(qū)(5′-untranslated region，5′-UTR)、P1區(qū)、P2區(qū)、P3區(qū)、3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)和一個(gè)Poly(A) 尾，CVB3可以引起很多疾病，至今尚無有效治療手段。部分研究表明，在哺乳類細(xì)胞，甚至人類細(xì)胞中導(dǎo)入21～23個(gè)核苷酸(nucleotide,nt)的短雙鏈RNA(small interfering RNA,siRNA)可使靶向基因的表達(dá)產(chǎn)生明顯的特異性強(qiáng)抑制效應(yīng)，而且不會(huì)誘發(fā)免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性，因此siRNA應(yīng)用于臨床治療成為可能[18]。

CRE對病毒復(fù)制是必不可缺的，在CVB3基因組中3’-UTR區(qū)、5’-UTR區(qū)和2C區(qū)各有一個(gè)CRE存在。研究發(fā)現(xiàn)一旦病毒的CRE遭到破壞，其在宿主體內(nèi)的復(fù)制將會(huì)受到嚴(yán)重影響，因3’-UTR區(qū)和5’-UTR區(qū)不是設(shè)計(jì)siRNA的適宜靶點(diǎn)，故很多研究選取2C區(qū)的CRE為靶點(diǎn)進(jìn)行研究。Merl等[11]的研究已證實(shí)在EV71和CAV24兩種病毒中在其基因序列中的2C區(qū)CRE部分設(shè)計(jì)的siRNA序列有效的沉默了這兩種病毒的致病性。然而針對CVB3目前僅有Kim等[12]組成的團(tuán)隊(duì)在其2C區(qū)的CRE部分發(fā)現(xiàn)了一條沉默效率較高的siRNA靶序列，那么在CVB3基因組中2C區(qū)CRE以外的部分是否是設(shè)計(jì)siRNA的有效靶點(diǎn)迄今為止沒有任何研究證實(shí)。為此，本研究設(shè)計(jì)了siRNA-5和siRNA-6兩條siRNA序列，它們均以2C區(qū)CRE以外的基因序列為靶點(diǎn)。本文結(jié)果顯示本次篩選的11條siRNA序列中，siRNA-5對CVB3的抑制率最高，其沉默效率高達(dá)84%，經(jīng)siRNA-5處理的HeLa細(xì)胞組其細(xì)胞活率達(dá)到了86%。首次證實(shí)驗(yàn)證了CVB3基因組中2C區(qū)CRE以外的部分也是設(shè)計(jì)siRNA的有效靶點(diǎn)。

部分研究發(fā)現(xiàn)針以2A區(qū)為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的siRNA序列對病毒的沉默效率較高[11]。本研究設(shè)計(jì)的siRNA-3以2A區(qū)為靶點(diǎn)，其對CVB3的沉默效率達(dá)到了72%。但本研究中以2C區(qū)為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的siRNA-5對CVB3的沉默效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在2A區(qū)設(shè)計(jì)的siRNA-3，因此，本研究團(tuán)隊(duì)推測CVB3基因組中2A區(qū)可能并非是設(shè)計(jì)siRNA靶序列最理想的區(qū)域。

本文發(fā)現(xiàn)了5條新的siRNA靶序列，它們對CVB3的沉默效率均較高，同時(shí)首次證實(shí)了2C區(qū)CRE以外的部分也是設(shè)計(jì)siRNA的理想靶點(diǎn)。本研究為防治CVB3感染引起的病毒性疾病提供了新的靶點(diǎn)和策略。