孫 悅 李 曉 劉梅芳

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826)

蘋(píng)果多酚(apple polyphenols，AP)是蘋(píng)果中所含多元酚類物質(zhì)的總稱，具有清除自由基、抗氧化、降血壓等多種生物學(xué)功能[1]。AP可通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶來(lái)降低血壓[2],緩解和減少高血壓以及心肌缺血過(guò)程中的氧化應(yīng)激和炎癥[3]，改善血管內(nèi)皮功能，降低血中膽固醇，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[4-6]。經(jīng)常吃蘋(píng)果可使心臟病的發(fā)病率降低13%～22%[7]。本研究以蟾蜍為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在離體和在體兩個(gè)水平觀測(cè)AP對(duì)于心臟活動(dòng)的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 健康蟾蜍，體重80～100g，雌雄不限，由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院日照校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在體研究中，蟾蜍分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只；離體水平研究中，每組5～8只，制備離體蛙心，用于灌流實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要試劑 AP干粉由東北林業(yè)大學(xué)王振宇教授惠贈(zèng)，純度約70%[8]；鹽酸腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司)。所用其他試劑均為分析純，包括 NaCl、KCl、無(wú)水CaCl2、NaHCO3、NaH2PO4和葡萄糖。蛙心灌流所用任氏液6種，無(wú)鈣任氏液和5種不同鈣離子濃度的任氏液(CaCl2濃度分別為0.06、0.12、0.18、0.24和0.30mg/ml)。其中含有0.12mg/ml CaCl2的任氏液為正常鈣離子濃度任氏液(正常任氏液)。用正常任氏液將AP干粉配制成100mg/ml的原液，分裝后置于-20℃凍存，實(shí)驗(yàn)前將AP原液配稀釋成不同濃度的灌流液。

1.1.3儀器 FT-100生物張力換能器、蛙心插管、BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟科技有限公司。其他實(shí)驗(yàn)用品均由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院綜合實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1在體心搏曲線記錄法 記錄蟾蜍在體心搏曲線[9]，待曲線穩(wěn)定后，采用大腿淋巴囊注射給藥的方式研究AP對(duì)心臟活動(dòng)的影響。對(duì)照組注射正常任氏液100μl；實(shí)驗(yàn)組注射100mg/ml AP液100μl。比較兩組給藥后3min和6min的心率以及心肌收縮力變化。

1.2.2離體蛙心灌流法 采用斯氏法制備離體蛙心標(biāo)本[9]。為保證曲線的穩(wěn)定性，我們對(duì)傳統(tǒng)蛙心灌流法進(jìn)行改進(jìn)[10]。蛙心離體后每3min更換1次正常任氏液，待收縮曲線穩(wěn)定后進(jìn)行藥物灌流實(shí)驗(yàn)，為觀察AP對(duì)腎上腺素作用的影響，采用以下灌流方案。對(duì)照灌流組，首先更換新鮮正常任氏液，觀察正常曲線1min，然后換入含0.1μg/ml腎上腺素的灌流液，觀察效應(yīng)2min；實(shí)驗(yàn)灌流組采用藥物預(yù)孵育的方式，先用含AP(0.5mg/ml或1mg/ml)的灌流液預(yù)孵育1min，再換入含有0.1μg/ml腎上腺素和AP的灌流液，觀察2min。為觀察灌流液中鈣離子濃度對(duì)AP作用的影響，采用以下灌流方案：首先，用正常任氏液進(jìn)行灌流。曲線穩(wěn)定后，加入含有特定濃度CaCl2的任氏液，待曲線穩(wěn)定后(約1min)，再加入1mg/ml AP灌流液，觀察2min。觀察效應(yīng)完畢后，均更換3～4次正常任氏液，每次間隔1min，待曲線恢復(fù)到正常水平進(jìn)行下一組灌流觀察[10-11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 在體條件下AP對(duì)心臟活動(dòng)的影響

淋巴囊注射給藥后，實(shí)驗(yàn)組蟾蜍心肌收縮力下降幅度大于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.11，P=0.0067)；不同時(shí)間點(diǎn)的心肌收縮力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.39，P<0.001)；AP對(duì)心肌收縮力的抑制作用隨時(shí)間發(fā)生改變(F=50.34,P<0.001)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組蟾蜍的心肌收縮力在AP注射后第3min和第6min均顯著降低，而心率沒(méi)有顯著性變化。見(jiàn)圖1、表1。

注：圖為蟾蜍在體心搏曲線，曲線分兩段，給藥前和給藥后。組別如圖所示，A 對(duì)照組，注射正常任氏液100μl；B 實(shí)驗(yàn)組，注射100mg/ml AP 100μl。

圖1 在體條件下AP對(duì)蟾蜍心率和心肌收縮力的影響

表1 在體條件下AP對(duì)蟾蜍心率和心肌收縮力的影響(n=8)

注：與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)相比，*P<0.01，**P<0.001。

3.2 不同濃度AP對(duì)心肌收縮力的影響

AP在離體水平也可以顯著降低心肌收縮力(見(jiàn)圖2)。0.125mg/ml AP對(duì)心肌收縮力沒(méi)有明顯影響；0.25mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml AP均使心肌收縮力顯著降低(見(jiàn)表2)。計(jì)算給藥前后的差值，對(duì)不同濃度AP的負(fù)性肌力作用進(jìn)行比較，結(jié)果顯示不同濃度AP對(duì)心肌收縮力的抑制作用不同(F=63.41，P<0.001)，其作用隨濃度增加而增強(qiáng)(見(jiàn)表2)。此外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) 2 mg/ml AP可以引起心臟收縮驟停(圖2E)。值得注意的是AP的抑制作用可以通過(guò)換洗消除，三次換洗后心肌收縮力可以恢復(fù)到正常水平，甚至高于正常水平。這說(shuō)明，AP對(duì)心肌收縮力的抑制作用不是由于急性損傷導(dǎo)致的。

注：圖為蛙心灌流心搏曲線，A-E來(lái)自同一只蟾蜍，灌流液中AP濃度如圖所示。每組灌流曲線分為3段，給藥前、給藥后以及換洗恢復(fù)階段。

圖2 不同濃度AP對(duì)蟾蜍心肌收縮力的影響

表2 不同濃度AP對(duì)蟾蜍心肌收縮力的影響(n=8)

注：與給藥前相比，*P<0.001；與0.25mg/ml AP組的差值相比，**P<0.001；與0.5mg/ml AP組的差值相比，***P<0.001。

3.3 不同孵育時(shí)間對(duì)AP負(fù)性肌力作用的影響

1mg/ml AP可以降低蟾蜍心肌收縮力(F=26.22，P=0.0005)；孵育時(shí)間不同，AP對(duì)心肌收縮力的抑制作用也有差異(F=210.20，P<0.001)；AP的負(fù)性肌力作用隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生改變(F=464.90,P<0.001)。與對(duì)照組相比，1mg/ml AP在第1min已經(jīng)使心肌收縮力略有下降，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在第3、5、7min AP均表現(xiàn)出顯著的負(fù)性肌力作用；不同時(shí)間點(diǎn)，AP對(duì)心肌收縮力的抑制作用不同(F=55.18，P<0.001)，且其抑制作隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。見(jiàn)圖3、表3。

注：圖為蛙心灌流心搏曲線，A,B來(lái)自同一只蟾蜍，組別如圖所示；每組灌流曲線分為兩段，給藥前和給藥后。

圖3 AP對(duì)心肌收縮力的抑制作用與時(shí)間的關(guān)系

表3 1mg/ml AP在不同孵育時(shí)間對(duì)心肌收縮力的抑制作用(n=6)

注：與同一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，*P<0.01；與AP處理后1min組相比，#P<0.01；與AP處理后3min組相比，△P<0.01。

3.4 AP對(duì)腎上腺素(AD)正性肌力作用的影響

與給藥前相比，0.1μg/ml AD、0.1μg/ml AD+0.5mg/ml AP和0.1μg/ml AD+1mg/ml AP 3個(gè)組均可以使心肌收縮力明顯增強(qiáng)，但是在0.5mg/ml和1mg/ml AP存在的條件下，AD的正性肌力作用顯著降低。見(jiàn)圖4、表4。

注：圖為蛙心灌流心搏曲線，A、B、C來(lái)自同一只蟾蜍，灌流組別如圖所示。每組灌流曲線分為4段，給藥前、預(yù)孵育、給藥后以及換洗恢復(fù)階段。

圖4 AP對(duì)腎上腺素刺激條件下心肌收縮力的影響

表4 AP抑制腎上腺素刺激引起的心肌收縮力增強(qiáng)(n=6)

注：與給藥前相比，*P<0.001；與0.1μg/ml AD組差值相比，#P<0.001。

3.5 灌流液中鈣濃度對(duì)AP抑制作用的影響

我們進(jìn)一步觀察灌流液中鈣離子濃度對(duì)AP負(fù)性肌力作用的影響。將正常灌流液更換為無(wú)鈣任氏液后，心肌收縮幅度很小，此時(shí)AP對(duì)心肌收縮力抑制作用微弱；灌流液中CaCl2濃度范圍在0.06～0.30mg/ml時(shí)，1mg/ml AP均能降低心肌收縮力(見(jiàn)圖5)。AP給藥前后心肌收縮力變化顯著(F=965.78，P<0.001)，不同鈣離子灌流液條件下心肌收縮力有差異(F=236.27，P<0.001)，AP對(duì)心肌收縮力的抑制作用隨灌流液中鈣離子濃度的變化而改變(F=48.99，P<0.001)。計(jì)算不同鈣離子濃度灌流條件下給藥前后的差值后進(jìn)行比較，結(jié)果顯示AP對(duì)心肌收縮力的抑制作用隨著鈣離子濃度的增加而增強(qiáng)(見(jiàn)表5)。

注：圖為蛙心灌流心搏曲線，A-F來(lái)自同一只蟾蜍，灌流液中CaCl2濃度如圖所示，AP均為1mg/ml；每組灌流曲線分為3段，正常灌流，特定鈣離子濃度任氏液灌流，特定鈣離子濃度任氏液+AP灌流階段。

圖5 灌流液中鈣離子濃度對(duì)AP抑制作用的影響

表5 灌流液中鈣離子濃度對(duì)AP抑制心肌收縮力的影響(n=5)

注：與給藥前相比，*P<0.001；與0.06mg/ml鈣離子濃度組相比，#P<0.001；與0.12mg/ml鈣離子濃度組相比，△P<0.001。

4 討論

AP是一種非常安全的功能性食品[12]，具有良好的抗氧化性和抗炎作用[3-4,7]，其對(duì)于心臟的保護(hù)作用受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。蘋(píng)果提取物可以降低小鼠血清中膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯的含量，增加高密度脂蛋白，增強(qiáng)血液的抗氧化活性，從而減少心血管疾病的發(fā)生[5]。蘋(píng)果類黃酮可以擴(kuò)張血管，降低血壓，具有預(yù)防心血管疾病的作用[6]。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道，AP可以通過(guò)抗氧化和減少性粒細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)揮對(duì)缺血-再灌注后心肌的保護(hù)作用[13]。這些研究表明，AP可以通過(guò)擴(kuò)張血管、降血壓、抗氧化、抑制炎癥等作用對(duì)心臟發(fā)揮保護(hù)作用。但是AP對(duì)心臟的直接影響卻鮮有報(bào)道。

本文以蟾蜍為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在離體和在體兩個(gè)水平研究AP對(duì)于心臟的直接作用。在體的研究結(jié)果表明，AP可以顯著抑制蟾蜍心肌收縮力，但對(duì)心率無(wú)明顯影響；離體水平的研究結(jié)果顯示，AP可呈劑量和時(shí)間依賴性抑制正常條件下的心肌收縮力，并可顯著拮抗腎上腺素的正性肌力作用。這提示AP抑制心肌收縮力的作用可能與抑制β受體有關(guān)。交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮時(shí)，血中腎上腺素和去甲腎上腺素增加，作用于心臟β1受體引起心肌收縮力增強(qiáng)，升高血壓。本文結(jié)果顯示AP可以抑制腎上腺素刺激引起的心肌收縮力增強(qiáng)，這提示AP可能通過(guò)抑制心肌收縮力發(fā)揮降低血壓的作用。此外，心臟β1受體過(guò)度激動(dòng)會(huì)誘發(fā)心肌缺血和損傷，AP可能通過(guò)抑制心肌收縮力避免心肌過(guò)度勞累，從而發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)作用。

鈣離子是心肌細(xì)胞電活動(dòng)和機(jī)械活動(dòng)的關(guān)鍵離子，本文結(jié)果顯示，AP對(duì)心肌收縮力的抑制效果隨灌流液中鈣離子濃度增加而增強(qiáng)。這提示AP對(duì)心肌收縮力的抑制作用具有鈣離子依賴性。研究還發(fā)現(xiàn)，AP可以抵消或者部分抵消高鈣引起的心肌收縮力增強(qiáng)，這說(shuō)明AP對(duì)心肌收縮力的抑制作用與抑制鈣離子內(nèi)流有關(guān)。鈣超載是引起心肌缺血—再灌注損害的重要機(jī)制之一。心肌細(xì)胞內(nèi)大量Ca2+累積，會(huì)影響線粒體氧化磷酸化過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙[12]。本文結(jié)果提示，AP可能通過(guò)抑制鈣離子內(nèi)流，防止心肌細(xì)胞鈣超載，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

綜上所述，本文首次發(fā)現(xiàn)AP可以顯著降低正常以及腎上腺素刺激條件蟾蜍心肌收縮力，其作用具有鈣離子依賴性，可能與抑制β受體和鈣離子內(nèi)流有關(guān)。