Apelin-13對急性心肌梗死家兔的治療作用

張彥宏 張波 李顯東

【摘要】 目的 探討Apelin-13對急性心肌梗死（AMI）家兔的治療作用。方法 30只雄性家兔， 隨機(jī)分為假手術(shù)組、AMI對照組和Apelin組， 各10只。術(shù)后開始給藥， Apelin組耳緣靜脈注射Apelin-130.1 mg/（kg·d）， 連續(xù)7 d， AMI對照組及假手術(shù)組注射等量生理鹽水。比較三組家兔血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、梗死邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù)、凋亡指數(shù)（AI）、心臟重量/體重， 觀察三組心肌損傷程度及膠原沉積情況。結(jié)果 假手術(shù)組VEGF含量、梗死邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù)、AI、心臟重量/體重分別為（44.94±2.76）ng/L、（7.820±1.059）個(gè)、（42.84±2.65）%、（1.90±0.12）‰， 顯著低于AMI對照組的（59.72±

4.17）ng/L、（13.540±1.704）個(gè)、（73.97±5.03）%、（2.70±0.01）‰， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Apelin組VEGF含量、梗死邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù)分別為（68.65±4.91）ng/L、（16.130±2.220）個(gè)， 均高于AMI對照組， AI及心臟重量/體重分別為（65.73±4.42）%、（2.60±0.15）‰， 均低于AMI對照組， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HE染色可見假手術(shù)組家兔心肌組織結(jié)構(gòu)排列整齊， AMI對照組可見心肌組織中有廣泛的炎性細(xì)胞浸潤， 心肌纖維斷裂， 排列紊亂， 心肌細(xì)胞壞死。Apelin-13組可見炎性細(xì)胞浸潤、心肌纖維斷裂比AMI對照組減輕。結(jié)論 Apelin-13可促進(jìn)AMI家兔梗死周圍新生血管生成、側(cè)支循環(huán)形成， 縮小心肌梗死面積， 且可有效抑制心肌細(xì)胞凋亡、減輕心肌細(xì)胞損傷、改善AMI家兔心肌重構(gòu)。

【關(guān)鍵詞】 Apelin-13;急性心肌梗死;心肌細(xì)胞凋亡;心肌重構(gòu)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.07.085

Effect of Apelin-13 on the treatment of acute myocardial infarction in rabbits ? ZHANG Yan-hong， ZHANG Bo， LI Xian-dong. Department of Emergency Medicine， Jilin Provincial Peoples Hospital， Changchun 130021， China

【Abstract】 Objective ? To discuss the therapeutic effect of apelin-13 on acute myocardial infarction （AMI） in rabbits. Methods ? A total of 30 male rabbits were randomly divided into sham operation group， AMI control group and Apelin group， with 10 rabbits in each group. After operation， Apelin-130.1 mg/（kg·d） was injected into the ear margin of Apelin group for 7 d. The same amount of normal saline was injected into the control group and sham operation group. The vascular endothelial growth factor （VEGF）， microvessel count in infarcted margin， apoptotic index （AI）， heart weight / body weight were compared in three groups of rabbits， and the degree of myocardial injury and collagen deposition of three groups were observed. Results ? The VEGF content， microvessel count in infarcted margin， AI and heart weight / body weight were （44.94±2.76） ng/L， （7.820±1.059） pieces，

（42.84±2.65）% and （1.90±0.12）‰ in sham operation group， which were significantly lower than （59.72±

4.17） ng/L， （13.540±1.704） pieces， （73.97±5.03）% and （2.70±0.01）‰ in AMI control group， and their difference was statistically significant （P<0.05）. The VEGF content and microvessel count in infarcted margin were （68.65±4.91） ng/L and （16.130±2.220） pieces in Apelin group， which were higher than those in the control group， and AI and heart weight / body weight were （65.73±4.42）% and （2.60±0.15）‰ respectively， which were lower than those in the AMI control group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. HE staining showed that the myocardial tissue structure of the sham operation group was neatly arranged; AMI control group showed extensive inflammatory cell infiltration， myocardial fiber rupture， disordered arrangement， and myocardial cell necrosis; Apelin-13 group showed inflammatory cell infiltration， and myocardial fiber rupture is reduced compared with AMI control group. Conclusion ? Apelin-13 can promote neovascularization and collateral circulation formation around AMI rabbit infarction， reduce the area of myocardial infarction， and can effectively inhibit myocardial cell apoptosis， reduce myocardial cell damage， and improve myocardial remodeling.

【Key words】 Apelin-13; Acute myocardial infarction; Cardiomyocyte apoptosis; Myocardial remodeling

AMI是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的主要分型之一， 極易引起心力衰竭， 嚴(yán)重威脅人類健康。Apelin是從牛胃分泌物中提取出的一種新的血管活性肽， 具有許多重要的生物學(xué)作用[1]。Apelin-13 作為 Apelin 亞型之一， 具有很強(qiáng)的生物活性。大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)Apelin-13具有增強(qiáng)心肌收縮力、降壓、減輕心臟負(fù)荷、減少心肌損傷、調(diào)節(jié)水鹽代謝及體液平衡等多種心血管保護(hù)作用[2， 3]， 本實(shí)驗(yàn)旨在研究Apelin-13對AMI家兔的治療作用， 從而為AMI的診治提供新的治療方法。具體研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取雄性家兔30只（吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）， 體重2.0～3.0 kg， 將其隨機(jī)分為假手術(shù)組、AMI對照組、Apelin組， 每組10只。

1. 2 方法

1. 2. 1 AMI模型制備[3] 開胸結(jié)扎家兔左冠狀動(dòng)脈前降支， 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎成功與否依靠心電圖ST段抬高， 局部心肌變暗紅， 節(jié)段性運(yùn)動(dòng)不良確認(rèn)， 假手術(shù)組只開胸剪破心包而不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

1. 2. 2 給藥方法 術(shù)后開始給藥， Apelin組耳緣靜脈注射Apelin-13（長春寶信生物制品公司提供）0.1 mg/（kg·d），

連續(xù)7 d， AMI對照組及假手術(shù)組注射等量生理鹽水。

1. 2. 3 標(biāo)本采集 術(shù)后2周采耳緣靜脈血5 ml， 以10%氯化鉀耳緣靜脈注射處死動(dòng)物， 摘取心臟。

1. 3 觀察指標(biāo)

1. 3. 1 血清VEGF 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定， 按試劑盒操作。

1. 3. 2 梗死邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù) 在左室乳頭肌橫切面處切取心肌組織， 經(jīng)甲醛固定、常規(guī)脫水后再經(jīng)石蠟包埋， 切成組織切片。將組織切片進(jìn)行免疫組化染色， 計(jì)算梗死邊緣區(qū)微血管數(shù)量， 免疫組化步驟按試劑盒說明書操作。不是必須出現(xiàn)血管腔以及紅細(xì)胞， 凡染成棕色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞叢都被看作一個(gè)微血管。具體計(jì)數(shù)方法：低倍鏡下找到梗死邊緣區(qū)組織， 切換為200倍鏡后觀察并計(jì)算微血管數(shù)， 每張切片觀察5個(gè)視野區(qū)， 取均數(shù)為最后計(jì)數(shù)。

1. 3. 3 心肌細(xì)胞凋亡檢測 自結(jié)扎線下0.5 cm處取心肌組織， 將心肌組織置入10%多聚甲醛中， 固定24 h

后行常規(guī)石蠟包埋、切片， 貼附于表面涂有多聚賴氨酸的載玻片上。檢測心肌細(xì)胞凋亡采用Tunel法， 按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。光鏡下觀察細(xì)胞核中呈棕黃色顆粒染色為凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（×400）， 算出凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞的數(shù)量， 得出AI。AI=視野中凋亡細(xì)胞數(shù)量/視野中細(xì)胞總數(shù)量×

100%。

1. 3. 4 稱取心臟重量， 計(jì)算心臟重量/體重。

1. 3. 5 心臟組織病理學(xué)觀察 取左心室心肌甲醛固定， 石蠟包埋， 行光鏡分析， 觀察心肌損傷程度及膠原沉積。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 三組血清VEGF含量、梗死邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù)、AI及心臟重量/體重比較 假手術(shù)組VEGF含量、梗死邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù)、AI、心臟重量/體重低于AMI對照組， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Apelin組VEGF含量、梗死邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù)均高于AMI對照組， AI及心臟重量/體重均低于AMI對照組， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 心肌損傷程度 HE染色可見假手術(shù)組家兔心肌組織結(jié)構(gòu)排列整齊（見圖1）。AMI對照組可見心肌組織中有廣泛的炎性細(xì)胞浸潤， 心肌纖維斷裂， 排列紊亂， 心肌細(xì)胞壞死（見圖2）。Apelin-13組可見炎性細(xì)胞浸潤、心肌纖維斷裂比AMI對照組減輕（見圖3）。

2. 3 膠原沉積 經(jīng)特殊染色（Masson染色）， 假手術(shù)組心肌細(xì)胞周圍可見少量藍(lán)色的膠原成分（見圖4）。AMI對照組可見大量增粗的膠原纖維沉積在血管及間質(zhì)（見圖5）。Apelin-13組與AMI對照組相比， 膠原沉積顯著減少（見圖6）。

3 討論

VEGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、誘導(dǎo)血管形成， 從而促進(jìn)血管新生、側(cè)支循環(huán)的形成及心肌細(xì)胞再生， 因此可對AMI患者發(fā)揮重要的心臟保護(hù)作用[4]， 血管新生可促進(jìn)缺血周圍組織側(cè)支循環(huán)的建立， 良好的側(cè)支循環(huán)可減少心肌缺血和心肌梗死范圍、保護(hù)冬眠心肌及頓抑心肌、改善心功能。早期促進(jìn)心肌梗死邊緣區(qū)新生血管形成， 能改善AMI后心臟功能， 改善疾病預(yù)后。本研究顯示， Apelin-13可明顯增加AMI后VEGF及梗死邊緣區(qū)微血管數(shù)， 表明Apelin-13可促進(jìn)AMI家兔梗死周圍新生血管生成、減少梗死面積， 盡早形成側(cè)支循環(huán)。

心肌重構(gòu)是由于心肌細(xì)胞及間質(zhì)進(jìn)行性改變引起的心臟重量、體積及形狀結(jié)構(gòu)的變化， AMI后愈合和心肌纖維化是同時(shí)進(jìn)行的動(dòng)態(tài)過程， 心肌纖維化是心肌正常組織中成纖維細(xì)胞聚集、活化、增生及細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂、膠原過度沉積的病理生理過程， 是AMI后心力衰竭的重要原因。AMI后心室內(nèi)壓力改變及內(nèi)分泌和旁分泌的調(diào)節(jié)作用， 都會(huì)導(dǎo)致非梗死區(qū)域結(jié)締組織增生， 引起非梗死區(qū)反應(yīng)性纖維化， 反應(yīng)性纖維化會(huì)改變心室順應(yīng)性、增加心室壁僵硬度， 從而影響心功能。而且， 這種間質(zhì)纖維化還會(huì)干擾心臟正常的電傳導(dǎo)從而誘發(fā)心律失常的發(fā)生[5， 6]。本研究顯示Apelin-13可降低AMI家兔心臟重量/體重， 減少心肌膠原沉積。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）參與實(shí)驗(yàn)小鼠早期血管炎癥反應(yīng)及繼發(fā)冠狀動(dòng)脈中層的增厚[7]。Apelin-13可減輕心肌纖維化， 其機(jī)制可能與阻礙血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（AngⅡ）誘導(dǎo)的膠原蛋白生成、降低轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）及結(jié)締組織生長因子的活性、抑制NF-κB表達(dá)有關(guān)。還有研究證明給予Apelin-13可改善AMI 大鼠血流動(dòng)力學(xué)， 有效抑制腦鈉肽， 調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）/組織抑制因子-1（TIMP-1）平衡， 從而抑制心肌纖維化， 保護(hù)心肌 [7]。

心肌細(xì)胞凋亡是發(fā)生心肌重構(gòu)及細(xì)胞功能紊亂的另一個(gè)重要原因， 有研究顯示， 當(dāng)心肌梗死時(shí)， AMI動(dòng)物模型及人均表現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡增加， 促凋亡相關(guān)基因Bax、Bak、凋亡蛋白（caspase-3）上調(diào)、抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白下調(diào)[8]。因此提出抑制細(xì)胞凋亡可能是阻止心肌梗死的有效方法[9]。本研究結(jié)果顯示， Apelin-13可明顯抑制心肌細(xì)胞凋亡， 其機(jī)制考慮為通過PI3K/Akt信號系統(tǒng)使Bax、Bak升高 、caspase-3表達(dá)降低， Bcl-2 表達(dá)升高所致[10]。還有研究顯示Apelin-13可減輕氧化應(yīng)激和心肌炎癥反應(yīng)， 對心肌細(xì)胞凋亡有改善作用[11]。

綜上所述， Apelin-13可促進(jìn)AMI家兔梗死周圍新生血管生成、盡早形成側(cè)支循環(huán)、有效抑制心肌細(xì)胞凋亡、減輕心肌細(xì)胞損傷、改善心肌重構(gòu)、減少梗死面積， 可為急性心肌梗死的診治提供新的治療方法。

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[收稿日期：2019-10-16]