源自嗜熱菌的α-L-鼠李糖苷酶交聯(lián)聚集體的制備及應(yīng)用

許錦，徐佳慧，張小濛，盧昌寧，趙林果*

(1. 南京林業(yè)大學(xué)江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京210037;2. 南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,南京210037)

α-L-鼠李糖苷酶(E. C. 3.2.1.40)是一種能特異性水解α-1, 2、α-1, 3、α-1, 4、α-1, 6和 α-1鼠李糖苷鍵的水解酶[1-2]，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中[3]。α-L-鼠李糖苷酶作為一種重要的糖苷水解酶，可應(yīng)用于橘汁類飲料的脫苦、葡萄酒的增香以及催化含鼠李糖基的天然產(chǎn)物以提高其生物活性[4]。在生物催化含鼠李糖基的天然產(chǎn)物中，高溫α-L-鼠李糖苷酶的催化轉(zhuǎn)化效率、反應(yīng)體系的底物濃度明顯高于常溫α-L-鼠李糖苷酶[5-6]。由于游離酶不能重復(fù)利用，導(dǎo)致酶的使用成本較高，很大程度上限制了工業(yè)應(yīng)用。另一方面，酶在實(shí)際應(yīng)用過程中受反應(yīng)體系的溫度和pH的影響容易失活，繼而影響了酶的催化效率。

酶的固定化是一種節(jié)約酶的使用成本的有效手段，其能使酶在工業(yè)應(yīng)用中被重復(fù)利用，且在一定程度上能夠提高酶的穩(wěn)定性。常見固定化酶的方法有共價(jià)結(jié)合、吸附、交聯(lián)和包埋等[7]，也可分為載體固定化和無載體固定化[8-9]。其中，無載體固定化酶技術(shù)中的交聯(lián)酶聚集體(cross-linked enzyme aggregates，CLEAs)技術(shù)應(yīng)用較廣，該法不需要載體，而且對酶的純度要求低、操作簡便、酶回收率高[10]。添加聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物F127(Pluronic F127)制備交聯(lián)酶聚集體是一種提高固定化酶穩(wěn)定性和催化效率的有效方法，其可通過聚合物的疏水段與酶表面疏水區(qū)的相互作用提高酶的穩(wěn)定性和活性[11-13]。因此，Pluronic F127可用于交聯(lián)酶聚集體的制備。

筆者在前期研究中克隆表達(dá)了來源ThermotogapetrophilaDSM 13995的GH78家族的耐高溫的α-L-鼠李糖苷酶(TpeRha)，該酶能夠有效催化多種黃酮類底物(淫羊藿苷、朝霍定C等)，但該酶存在高溫條件下穩(wěn)定性較差、酶使用成本高等缺點(diǎn)。因此，筆者研究了添加共聚物Pluronic F127制備α-L-鼠李糖苷酶交酶聚集體的方法，并將固定化酶(PAG-R)應(yīng)用于蘆丁的轉(zhuǎn)化，旨在將固定化酶和高溫酶的優(yōu)勢有機(jī)結(jié)合起來，改善高溫α-L-鼠李糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)，提高酶的催化性能和重復(fù)利用率。研究結(jié)果為α-L-鼠李糖苷酶在含鼠李糖基的天然產(chǎn)物中的規(guī)?；瘧?yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

嗜熱菌T.petrophilaDSM 13995、克隆宿主菌株Escherichiacoli(E.coil) TOP 10F’、表達(dá)宿主菌株E.coilBL21(DE3) 、表達(dá)載體pET-28a均由本實(shí)驗(yàn)室保藏；Pluronic F127購自美國Sigma-Aldrich公司；戊二醛、硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀購自國藥集團(tuán)(上海)化學(xué)試劑有限公司，均為國產(chǎn)分析純；蘆丁(純度為97%)購自上海Aladdin化學(xué)試劑有限公司；異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品購自成都曼思特生物技術(shù)有限公司；酵母提取物、蛋白胨購自英國OXOID公司；麥芽糊精購自南京姜華化玻有限公司；Bradford蛋白含量檢測試劑盒購自日本 TaKaRa公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BS124S電子天平：北京Sartorius儀器系統(tǒng)有限公司；TOMY SX-500型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器：日本TOMY公司；5417R小型高速冷凍離心機(jī)：德國 Eppendorf公司；HH-4型恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；ZHWY-2102C 搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；SpectraMax190酶標(biāo)儀：美國分子儀器公司；Agilent 1260高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 游離酶的制備

Terrific Broth(TB)培養(yǎng)基的配制：A液，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))麥芽糊精，1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蛋白胨，2.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))酵母提取物；B液，磷酸二氫鉀2.3 g，磷酸氫二鉀16.43 g溶于100 mL蒸餾水中，A液與B液體積比為9∶1。

將活化后的菌種[E.coilBL21(DE3)-pET-28a-TpeRha]轉(zhuǎn)入TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.8左右，加入IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)48 h后收集菌體、超聲破碎、離心，上清液即為TpeRha粗酶液。將粗酶液超濾后得到濃縮粗酶液。

1.3.2 固定化酶的制備

將粗酶TpeRha與Pluronic F127按一定質(zhì)量比加入到50 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液中處理30 min，再加入硫酸銨沉淀30 min，最后加入40 mmol/L戊二醛交聯(lián)3 h，6 000 r/min離心3 min得到的沉淀即為固定化酶。將固定化酶用pH 7.0的緩沖液反復(fù)清洗幾次后加入pH 7.0的緩沖液中，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 酶活力的測定

以對硝基苯酚-α-鼠李糖苷(pNPR)為底物，水解得到的pNP與碳酸鈉發(fā)生顯色反應(yīng)，在405 nm 的波長下測定產(chǎn)物的吸光度。反應(yīng)體系為: 75 μL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(50 mmol/L)，20 μL底物，混勻預(yù)熱后加入5 μL游離酶(或者固定化酶)，在酶的最適溫度和pH下反應(yīng)5 min，以不加酶液的反應(yīng)體系作空白對照。酶活力單位(U)定義：在酶的最適溫度和pH下反應(yīng)，每分鐘水解相應(yīng)底物pNPR釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。對硝基苯酚(pNP)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.376x+0.048，決定系數(shù)R2=0.999 0。

酶活計(jì)算公式如下：

(1)

式中：c為對硝基苯酚含量，μmol/mL；V1為反應(yīng)體系總體積，mL；t為反應(yīng)時(shí)間，min；V2為酶液的體積，mL；N為酶液稀釋倍數(shù)。

1.3.4 蛋白含量的測定

配置不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)體系為200 μL Bradford溶液加入6 μL標(biāo)準(zhǔn)品，測定其在595 nm下的吸光度，以不含牛血清蛋白的吸光值為空白對照，根據(jù)所測吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可算得蛋白含量。蛋白含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.000 8x+0.008 1，決定系數(shù)R2=0.992 4。

1.3.5 固定化酶制備條件優(yōu)化

以酶活回收率大小確定酶固定化的條件。

1)酶蛋白與Pluronic F127的質(zhì)量比：將2 mg/mL的酶液置于pH 7.0緩沖體系中，加25 mg/mL的硫酸銨沉淀，分別按酶蛋白與Pluronic F127的質(zhì)量比1∶0,1∶2,1∶4,1∶6,1∶8,1∶10加入相應(yīng)量的Pluronic F127，處理30 min，最后加入40 mmol/L戊二醛交聯(lián)3 h，探究酶蛋白與Pluronic F127的質(zhì)量比對酶活回收率的影響。

2)硫酸銨濃度：將2 mg/mL的酶液置于pH 7.0緩沖體系中，分別加入25,50,75,100，150 mg/mL的硫酸銨沉淀，再加入質(zhì)量比為1∶8的Pluronic F127處理，最后加入40 mmol/L戊二醛交聯(lián)3 h，探究沉淀劑濃度對酶活回收率的影響。

3)戊二醛濃度：將2 mg/mL的酶液置于pH 7.0緩沖體系中，加75 mg/mL硫酸銨沉淀，再加入質(zhì)量比為1∶8的Pluronic F127處理，最后加入30,40,60,90,120 mmol/L濃度戊二醛交聯(lián)3 h，探究戊二醛濃度對酶活回收率的影響。

4)固定順序：將酶分別按照以下步驟固定——①硫酸銨沉淀、戊二醛交聯(lián)(CLEA)；②硫酸銨沉淀、戊二醛交聯(lián)、Pluronic F127處理(AS-GL-PL)；③Pluronic F127處理、硫酸銨沉淀、戊二醛交聯(lián)(PL-AS-GL)；④硫酸銨沉淀、Pluronic F127處理、戊二醛交聯(lián)(AS-PL-GL)，其中硫酸銨濃度為75 mg/mL、酶蛋白與Pluronic F127的質(zhì)量比為1∶8、戊二醛濃度為40 mmol/L。研究不同固定化順序?qū)γ富罨厥章实挠绊憽?/p>

1.3.6 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

1)最適溫度和最適pH：分別將固定化酶和游離酶置于60,65,70,75,80,85,90,95 ℃水浴中和pH為4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0緩沖溶液中測定酶活，并計(jì)算相對酶活，以最高酶活力為100%，確定最適溫度和最適pH。

2)溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性：將固定化酶和游離酶置于60,65,70,75,80,85,90,95 ℃水浴中保溫3 h后，在其最適溫度和最適pH下測定剩余酶活力，探究其溫度穩(wěn)定性；將固定化酶和游離酶置于70 ℃和pH為4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0緩沖溶液保溫3 h測定剩余酶活力，探究其pH穩(wěn)定性。

3) 鼠李糖耐受性：在酶反應(yīng)體系中加入5,10,15,20,25,50 mmol/L的鼠李糖，以不加鼠李糖的酶活力為對照，探究鼠李糖(即產(chǎn)物)對酶活力的影響。

4)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定：將酶加入不同濃度的底物中反應(yīng)5 min后測定其吸光度值，按照米氏動(dòng)力學(xué)方程計(jì)算其Vmax、Km及kcat值。

1.3.7 HPLC分析

色譜柱為ZORBAX SB-Aq(填料顆粒直徑5 μm；內(nèi)徑4.6 mm；長度250 mm)。HPLC檢測條件為：柱溫40 ℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長369 nm；流動(dòng)相為甲醇/0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲酸水=40/60 (體積比)；時(shí)間20 min。蘆丁出峰時(shí)間為13.091 min，異槲皮素為 14.545 min。以不同濃度異槲皮素及相對應(yīng)的色譜峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=21 456x-245.42，決定系數(shù)R2=0.999 5。

1.3.8 PAG-R轉(zhuǎn)化蘆丁

1)溫度和pH對轉(zhuǎn)化的影響：以1 g/L蘆丁為底物，10 U/mL的PAG-R，在65～95 ℃和pH 4.0～7.0緩沖液中反應(yīng)30 min，液相檢測產(chǎn)物異槲皮素濃度計(jì)算其產(chǎn)率，確定最適轉(zhuǎn)化溫度和pH。

2)加酶量對轉(zhuǎn)化的影響：以1 g/L蘆丁為底物，在轉(zhuǎn)化最適溫度和pH條件下，加入0.25～12.00 U/mL的PAG-R，反應(yīng)30 min，液相檢測確定最佳加酶量。

3)底物濃度與轉(zhuǎn)化時(shí)間的關(guān)系：在轉(zhuǎn)化最適溫度、pH和加酶量的條件下，分別轉(zhuǎn)化 3和 4 g/L底物，每隔30 min取樣至反應(yīng)240 min，探究底物濃度與轉(zhuǎn)化時(shí)間的關(guān)系。

4)PAG-R與游離酶催化效果的比較：在相同轉(zhuǎn)化條件下分別使用固定化酶和游離酶進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)異槲皮素產(chǎn)率比較其催化效果。

圖1 固定化酶的條件對酶活力的影響Fig. 1 The effect of immobilized conditions on enzyme activity

5)重復(fù)使用次數(shù)：以一定底物，適量加酶量下反應(yīng)時(shí)間90 min為一次轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后離心回收固定化酶，將回收的固定化酶用緩沖液洗滌2～3次后繼續(xù)反應(yīng)，循環(huán)數(shù)次，確定其重復(fù)使用性能。

1.4 數(shù)據(jù)分析

固定化酶酶活回收率、相對酶活力、異槲皮素產(chǎn)率和相對轉(zhuǎn)化率的計(jì)算公式如下：

固定化酶酶活回收率=

(2)

相對酶活力=

(3)

(4)

(5)

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化酶的條件

2.1.1 酶蛋白與Pluronic F127的質(zhì)量比

在固定化酶的過程中加入不同質(zhì)量的Pluronic F127處理，對固定化酶的酶活回收率有很大的影響，結(jié)果如圖1a所示。不加Pluronic F127處理的固定化酶酶活力為10 U/mL，酶活回收率僅為17.00%，而隨著加入Pluronic F127質(zhì)量的增加，固定化酶酶活力和酶活回收率會逐漸提高，在酶蛋白與Pluronic F127的質(zhì)量比為1∶8時(shí)，固定化酶酶活力為20 U/mL，回收率達(dá)到36.52%；這是由于Pluronic F127的疏水段與酶表面疏水區(qū)的相互作用逐漸增強(qiáng)，酶的穩(wěn)定性逐漸提高[14]；但當(dāng)達(dá)到一定程度后，相互作用力過大會影響酶的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而使其酶活降低。因此，最佳酶蛋白與Pluronic F127的質(zhì)量比為1∶8。

2.1.2 硫酸銨質(zhì)量濃度

加入沉淀劑的作用是改變?nèi)芤旱撵o電參數(shù)，破壞酶蛋白分子內(nèi)的非共價(jià)鍵，使其空間結(jié)構(gòu)變形，從而聚集形成沉淀[15-16]。在一定濃度內(nèi)，隨著沉淀劑的濃度越高，酶蛋白沉淀越快，其空間結(jié)構(gòu)改變一定程度上會較小，從而對其酶活性中心的破壞越小；當(dāng)濃度過高時(shí)，會導(dǎo)致酶空間結(jié)構(gòu)包括活性中心變形，影響其酶活力[17]，這與圖1b結(jié)果符合。因此，最佳硫酸銨質(zhì)量濃度為75 mg/mL。

a. 最適溫度; b. 最適pH; c. 溫度穩(wěn)定性; d. pH穩(wěn)定性。圖2 游離酶和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)Fig. 2 Enzymatic properties of free and immobilized enzymes

2.1.3 戊二醛濃度

（4）綜合性實(shí)驗(yàn)、實(shí)訓(xùn)教學(xué)的應(yīng)用與管理。將一系列單一項(xiàng)目按其內(nèi)在關(guān)系有機(jī)結(jié)合在一起進(jìn)行的綜合性實(shí)驗(yàn)、實(shí)訓(xùn)教學(xué)，是培養(yǎng)和提升學(xué)生綜合素質(zhì)和綜合能力的主要途徑和必然選擇，應(yīng)予以廣泛倡導(dǎo)與運(yùn)用。

在無載體的固定化酶-交聯(lián)酶聚集體制備過程中，戊二醛兩端的醛基官能團(tuán)能夠與酶蛋白上的多種官能團(tuán)共價(jià)結(jié)合，并形成聚集體。當(dāng)戊二醛的濃度過小時(shí)，交聯(lián)不充分導(dǎo)致部分酶蛋白脫落，暴露在環(huán)境中容易失活；而戊二醛的濃度過高時(shí)，會導(dǎo)致酶蛋白活性中心構(gòu)象改變而失活[18]。因此，最佳戊二醛的濃度如圖1c所示，為40 mmol/L。

2.1.4 固定順序

探究了試劑處理順序?qū)潭ɑ傅挠绊?，結(jié)果如圖1d所示。常用的交聯(lián)酶聚集體——CLEA的制備順序所制備的固定化酶的酶活回收率為30.85%，而先加入Pluronic F127對酶蛋白進(jìn)行處理，所制備的固定化酶的酶活回收率為60.90%，是前者的1.97倍，此時(shí)固定化酶酶活力可達(dá)到34 U/mL。這可能是由于Pluronic F127的疏水片段與酶的疏水片段相互作用，保證了酶蛋白在沉淀劑沉淀作用下的酶活損失少。

2.2 PAG-R的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適溫度和最適pH

固定化酶的最適溫度及最適pH如圖2a、b所示。PAG-R的最適溫度為90 ℃、最適pH為5.0，較游離酶差別不大。PAG-R的反應(yīng)溫度和pH范圍較游離酶均有所擴(kuò)寬，在其他不同溫度和pH條件下，PAG-R的相對酶活亦明顯高于游離酶。

2.2.2 溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

PAG-R、TpeRha的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性如圖2c、d所示。在不同溫度保溫3 h后，PAG-R和TpeRha的相對酶活力相差很大，TpeRha在90,95 ℃保溫后，酶活力完全喪失，而PAG-R的相對酶活仍有77.13%和54.12%，說明固定化后酶的熱穩(wěn)定性顯著提高。另一方面，PAG-R在pH6.0～8.0條件下、70 ℃保溫3 h，PAG-R的相對酶活仍保持在72.41%以上，是TpeRha的3倍左右。說明固定化后不僅酶的熱穩(wěn)定性顯著提高，酶的pH穩(wěn)定性也得到了極大的改善，可能是由于固定化酶具有更加穩(wěn)定的空間立體結(jié)構(gòu)，酶蛋白耐受熱變性的能力提高[19]。

2.2.3 鼠李糖耐受性

a. 最適溫度; b. 最適pH; c. 加酶量優(yōu)化; d. 底物濃度與轉(zhuǎn)化時(shí)間關(guān)系。圖4 PAG-R催化蘆丁轉(zhuǎn)化的最適條件Fig. 4 The optimum conditions of rutin conversion catalyzed by PAG-R

α-L-鼠李糖苷酶在底物的水解過程中，通常被水解產(chǎn)物所抑制。固定化酶技術(shù)有望能改善其糖耐受性。在相同條件下分別研究游離酶和固定化酶對鼠李糖的耐受性，結(jié)果如圖3所示。TpeRha隨著鼠李糖濃度逐漸升高，相對酶活下降非常迅速，鼠李糖濃度為5 mmol/L時(shí)，其相對酶活僅為29.21%，說明TpeRha對鼠李糖極不耐受，導(dǎo)致其在實(shí)際應(yīng)用中催化效果不佳。而PAG-R在相同鼠李糖濃度下，相對酶活為65.50%，比游離酶高36.29%，有效提高了該酶的鼠李糖的耐受性。分析原因可能是固定化后，酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，鼠李糖苷酶的催化通道內(nèi)，與鼠李糖結(jié)合的非催化位點(diǎn)變多，降低了其與催化活性位點(diǎn)結(jié)合的幾率，從而提高了鼠李糖苷酶的糖耐受性，這與Yoshida等[20-21]研究的葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性結(jié)果相似。

圖3 游離酶和固定化酶的鼠李糖耐受性Fig. 3 Tolerance of rhamnose for free and immobilized enzymes

2.2.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定

根據(jù)米氏方程計(jì)算得出TpeRha 和 PAG-R的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表1所示。由表1可見，PAG-R和TpeRha的Vmax值相近，Km值分別為5.77和4.66 mmol/L，這與Wu等[22]發(fā)現(xiàn)的多形擬桿菌來源的鼠李糖苷酶BtRha的Km值相近，且固定化酶對底物pNPR的親和力略大于游離酶。

表1 TpeRha 和 PAG-R的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of TpeRha and PAG-R

2.3 PAG-R催化蘆丁轉(zhuǎn)化的應(yīng)用

2.3.1 最適溫度和最適pH

PAG-R催化蘆丁轉(zhuǎn)化生成異槲皮素過程中，溫度在65～80 ℃時(shí)，隨溫度的升高異槲皮素產(chǎn)率逐漸提高(圖4a)，80～90 ℃時(shí)達(dá)到平衡，PAG-R在此溫度下的催化效果相同，但在95 ℃產(chǎn)率有所下降，可能是由于95 ℃時(shí)酶活力有所下降導(dǎo)致。根據(jù) PAG-R的溫度和pH穩(wěn)定性檢測結(jié)果，選擇80 ℃為轉(zhuǎn)化最適溫度，pH 6.0為轉(zhuǎn)化的最適pH(圖4b)。

2.3.2 加酶量優(yōu)化

加酶量對異槲皮素產(chǎn)率的影響結(jié)果如圖4c所示。轉(zhuǎn)化率隨酶量的增加而逐漸升高，加酶量為4～12 U/mL 時(shí)產(chǎn)率均達(dá)到100%。結(jié)合用酶成本，選擇4 U/mL為轉(zhuǎn)化時(shí)的最佳加酶量。

2.3.3 底物濃度與轉(zhuǎn)化時(shí)間的關(guān)系

以4 U/mL的酶量分別轉(zhuǎn)化3和4 g/L的底物，轉(zhuǎn)化隨時(shí)間的變化如圖4d所示。由圖4d 可見，3 g/L的底物在90 min時(shí)異槲皮素產(chǎn)率到100%，4 g/L的底物在120 min時(shí)異槲皮素產(chǎn)率到95.88%。結(jié)合圖4c，1 g/L的底物在30 min時(shí)異槲皮素產(chǎn)率達(dá)到100%，說明PAG-R催化蘆丁轉(zhuǎn)化的能力在一定底物濃度范圍不受底物和產(chǎn)物的影響，也與鼠李糖耐受性的研究結(jié)果相符合。

2.3.4 PAG-R與游離酶催化效果的比較

分別以4 U/mL的PAG-R 和游離酶TpeRha轉(zhuǎn)化3 g/L的蘆丁，結(jié)果如圖5所示。PAG-R和TpeRha催化蘆丁的轉(zhuǎn)化量均隨著時(shí)間的延長而逐漸增加，但在相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，PAG-R催化蘆丁生成異槲皮素的產(chǎn)率顯著高于TpeRha。轉(zhuǎn)化90 min時(shí)，PAG-R生成異槲皮素的產(chǎn)率100%， TpeRha的異槲皮素產(chǎn)率43.36%，PAG-R催化異槲皮素的生成量是TpeRha的2.31倍。這是由于PAG-R 在80 ℃和pH 6.0條件下的穩(wěn)定性較游離酶TpeRha高很多，綜合圖2c、d可知，固定化后的PAG-TpeRha在80 ℃和pH 6.0條件下保溫3 h后，剩余酶活力均達(dá)到85%以上，而游離酶TpeRha在80 ℃和pH 6.0條件下極不穩(wěn)定，這是導(dǎo)致兩者催化效果差距大的主要原因。另一方面，隨著催化反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)體系中的產(chǎn)物鼠李糖的含量不斷增加，游離酶的產(chǎn)物反饋抑制作用比PAG-R更嚴(yán)重，導(dǎo)致其催化活力下降。

圖5 PAG-R與游離酶催化效果的比較Fig. 5 Comparison of catalytic effects of PAG-R and free enzymes

2.3.5 重復(fù)使用次數(shù)

游離酶的不可重復(fù)使用性是限制其在工業(yè)應(yīng)用的最重要因素之一，利用固定化酶技術(shù)提高酶的重復(fù)利用率是減少酶使用成本的重要途徑。以4 U/mL PAG-R、3 g/L蘆丁反應(yīng)90 min為一個(gè)循環(huán)，重復(fù)反應(yīng)10次后，相對轉(zhuǎn)化率保持在60%以上(圖6)，這有利于嗜熱α-L-鼠李糖苷酶的工業(yè)應(yīng)用。

圖6 PAG-R的重復(fù)使用次數(shù)Fig. 6 Reusability of PAG-R

3 結(jié) 論

1)固定化酶(PAG-R)制備適宜條件為：酶蛋白與Pluronic F127質(zhì)量比為1∶ 8、沉淀劑硫酸銨質(zhì)量濃度為75 mg/mL、戊二醛濃度為40 mmol/L、固定順序?yàn)镻luronic F127-硫酸銨-戊二醛；酶活回收率最高達(dá)到60.90%，酶活力為34 U/mL。

2)固定化酶的最適溫度和pH與游離酶相近，反應(yīng)溫度和pH范圍較游離酶均有所擴(kuò)寬；固定化后酶的溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和鼠李糖耐受性均顯著提高。

3)固定化酶(PAG-R)轉(zhuǎn)化蘆丁的最適條件為：80 ℃、pH 6.0、加酶量4 U/mL；在相同條件下轉(zhuǎn)化蘆丁，PAG-R催化異槲皮素的生成量是TpeRha的2.31倍；且重復(fù)使用10次后，相對轉(zhuǎn)化率仍達(dá)到60%以上。研究結(jié)果為來自嗜熱菌T.petrophilaDSM 13995耐高溫GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶應(yīng)用于催化淫羊藿苷、朝霍定C等溶解性差的黃酮化合物轉(zhuǎn)化提供了技術(shù)支持。