譚建兵，周亮

（1.重慶市開州區(qū)婦幼保健院，重慶 405400；2.重慶市開縣疾病預防控制中心，重慶 405400）

1 實驗

1.1 材料 （1）考核樣品編號：CQ-ZK15，無菌管裝，每管裝3 g×2支。（2）培養(yǎng)基。腸道增菌肉湯、緩沖蛋白胨水（BPW）、GN增菌肉湯、EC肉湯、7.5%Nacl肉湯、李氏增菌肉湯、胰酪胨大豆多粘菌素肉湯、伊紅美藍（EMB）、山梨醇麥康凱（SorbitolMacConKey），血平板，李斯特氏菌科瑪嘉瓊脂、甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂、阪崎桿菌顯色培養(yǎng)基（DFI）、腸桿菌科細菌生化編碼鑒定系統(tǒng)E75/15，以上培養(yǎng)基均為北京陸橋試劑有限公司生產。API20E細菌生化編碼鑒定系統(tǒng)由法國梅里埃公司生產[1]。（3）診斷學清：致病性大腸埃希氏菌、侵襲性大腸埃希氏菌、產毒性大腸埃希氏菌診斷血清、出血性大腸埃希氏菌O157血清、沙門菌A-F多價O血清均為寧波天潤生物藥業(yè)有限公司生產，均在有效期內。

1.2 樣品處理 用40-50oC滅菌過的生理鹽水將奶粉充分溶解。

1.3 增茵培養(yǎng) 移取1 mL分別加入10 mL腸道增菌肉湯、緩沖蛋白胨水（BPW）、GN增菌肉湯、EC肉湯、7.5%Nacl肉湯、李氏增菌肉湯、胰酪胨大豆多粘菌素肉湯中，李氏增菌肉湯和胰酪胨大豆多粘菌素肉湯于30oC培養(yǎng)24 h，其余增菌液于36oC培養(yǎng)18-24 h。

1.4 分離培養(yǎng) 無菌操作取增菌液一環(huán)分別劃線接種相對的伊紅美藍（EMB）、木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽培養(yǎng)基（XLD）、山梨醇麥康凱，血平板，李斯特氏菌科瑪嘉瓊脂、甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂、阪崎桿菌顯色（DFI）平板各1塊。MYP瓊脂平板于30oC培養(yǎng)24 h，其余平板于36oC培養(yǎng)24 h。觀察所有培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)、色澤等特點。發(fā)現李斯特氏菌科瑪嘉瓊脂平板、甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）平板、阪崎桿菌顯色（DFI）平板、山梨醇麥康凱平板、木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽（XLD）平板、伊紅美藍（EMB）平板上有可疑菌落，并將其涂片染色。

1.5 生化和血清學鑒定 （1）將李斯特氏菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上的可疑菌落接種木糖、鼠李糖，36oC培養(yǎng)24 h，同時于TSA-YE平板上純化30oC培養(yǎng)48 h，挑取純培養(yǎng)的單個菌落接種SIM培養(yǎng)基30oC培養(yǎng)48 h并同時做生化鑒定，結果觀察如下：動力見傘狀生長，過氧化氫酶+，MR/VP+/-,溶血反應+，鼠李糖+，木糖-，甘露醇-，葡萄糖+，麥芽糖+，生化結果完全符合單增李斯特氏菌的生化特性。（2）將甘露醇卵黃多粘菌素培養(yǎng)基上的可疑菌落接種于營養(yǎng)瓊脂平板上純化，營養(yǎng)瓊脂平板上可見粗糙、毛玻璃狀的邊緣向外擴展菌落，挑取典型菌落做生化鑒定，結果如下：過氧化氫酶+、西蒙氏枸櫞酸鹽+、動力+、硝酸鹽+、VP+、木糖-、明膠+、甘露醇-、葡萄糖+，生化結果完全符合蠟樣芽胞桿菌的生化特性。（3）挑取山梨醇麥康凱培養(yǎng)基、木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基上的可疑菌落轉種于TSI上，36oC培養(yǎng)24 h后，三種培養(yǎng)基上的可疑菌落在TSI上生化表現相同，上層下層均變黃并產生大量氣體，挑取TSI斜面上的菌落進行純化培養(yǎng)后與致病性大腸埃希氏菌、侵襲性大腸埃希氏菌、產毒性大腸埃希氏菌多價O血清和出血性大腸埃希氏菌O157血清做玻片凝集試驗，結果都未發(fā)生凝集，生理鹽水對照不凝集。將木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽培養(yǎng)基上的可疑菌落進行純培養(yǎng)后與沙門氏菌多價O血清做玻片凝集試驗，結果為強凝集，生理鹽水對照不凝集。在進行血清凝集試驗的同時用北京陸橋有限責任公司生產的E75/15腸桿菌科細菌鑒定系統(tǒng)鑒定三種培養(yǎng)基上可疑菌落的純化菌落，生化鑒定結果均相同，鑒定編碼均為54265，查檢索表結果為：阪崎腸桿菌概率為97.36%，見表1。

取分純后的菌落同時采用API20E細菌生化編碼鑒定系統(tǒng)做生化鑒定，鑒定編碼均為3305373，查檢索結果為阪崎腸桿菌概率為98.40%，見表2。

2 結果

根據菌落特征、菌體形態(tài)、生化反應結果和血清凝集試驗，最終判定李斯特氏菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上的可疑菌落為單增李斯特氏菌。甘露醇卵黃多粘菌素培養(yǎng)基上的可疑菌落為蠟樣芽胞桿菌。中山梨醇麥康凱培養(yǎng)基、木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基上的可疑菌落和阪崎桿菌顯色培養(yǎng)基上的可疑菌落為同一菌落，都是阪崎腸桿菌[2]。

表1 E75/15腸桿菌科細菌生化鑒定

表2 API20E細菌生化編碼鑒定系統(tǒng)

3 討論

本次考核樣檢測出了單增李斯特氏菌、蠟樣芽胞桿菌、阪崎腸桿菌共三株。通過這次食源性致病菌考核樣的檢測，總結出食源性致病菌鑒定經驗，也提高了實驗室的檢測能力和水平。在此次考核檢驗過程中也發(fā)現了一些問題：（1）分離培養(yǎng)時盡量采用多種增菌液和選擇性平板進行增菌培養(yǎng)和分離，比如這次檢出的阪崎桿菌在多種培養(yǎng)基如營養(yǎng)瓊脂、伊紅美藍、山梨醇麥康凱、木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽（XLD）上均能良好生長，在阪崎桿菌顯色培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基上呈典型生長。在檢驗過程中，應該盡量多地挑選可疑菌落進行生化鑒定，以防漏檢。（2）做生化鑒定時，要將可疑菌進行分離純化，不然會影響最后結果判定。（3）在做血清凝集實驗時，選擇的菌落應用純培養(yǎng)菌落。在這次血凝實驗中出現了木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽（XLD）上生長的可疑菌落與沙門氏多價O抗原發(fā)生交叉凝集，最后該菌落經生化反應鑒定證實為阪崎桿菌，在實際工作中常出現生化結果與血清凝集實驗結果不符的情況，經過查閱文獻資料見[3]，發(fā)現阪崎桿菌與多種菌有交叉凝集的現象，比如沙門氏菌F群血清等，所以不能單憑凝集反應而做出結論，還應結合生化判定。（4）隨著致人類感染的致病微生物種、屬的不斷增加，以傳統(tǒng)生化試驗來鑒定微生物已不能適應鑒定的需要，而成套鑒定系統(tǒng)及編碼鑒定方法如API20E細菌生化編碼鑒定系統(tǒng)在實際工作中可以使細菌鑒定更加準確、簡易、快速[4-6]。