樊 曄,李 倩,方 云,夏詠梅

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無(wú)錫 214122)

溶致液晶是表面活性劑水溶液濃度增大時(shí)形成的一類(lèi)有序自組裝體,分為六角相、層狀相和立方相.目前,溶致液晶廣泛應(yīng)用于納米材料制備[1～5]、日用化學(xué)品[6,7]、三次采油[8]及藥物載體[9～15]等領(lǐng)域.溶致液晶用作藥物傳遞系統(tǒng)(DDS)不僅具有高載藥量和高生物利用率等優(yōu)點(diǎn)而且具有緩/控釋功能,其中層狀液晶的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜骨架磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)較相似,具有更好的膜通透性,已用于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)[9～11]及黏膜給藥系統(tǒng)[12～15]等.已有研究表明溶致液晶材料多為一些無(wú)毒低刺激的非離子表面活性劑,如辛基酚聚氧乙烯醚(TX-100)[16,17]、脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)系列[18,19]、卵磷脂[20]或單油酸甘油酯[12,21,22]等,而脂肪酸通常只作為溶致液晶的油相[23]或助表面活性劑[24,25],很少以其為主構(gòu)筑溶致液晶并用于DDS的研究.

脂肪酸作為生物質(zhì)小分子原料,具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、環(huán)境和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn); 調(diào)整pH即可調(diào)節(jié)水溶液中羧酸及其共軛堿的比例,表現(xiàn)出良好的自組裝活性和形貌多樣性; 構(gòu)筑層狀液晶可以顯示其在DDS中的應(yīng)用潛能.共軛亞油酸(CLA)存在于自然界中,并可通過(guò)來(lái)源豐富的亞油酸半合成轉(zhuǎn)化,具有一定的抗氧化性和抗癌性等[26,27].在本課題組前期研究[28～30]基礎(chǔ)上,本文將通過(guò)調(diào)節(jié)水相中CLA與其鈉鹽(SCL)的比例,借助偏光織構(gòu)并輔以目測(cè)確定CLA/SCL/H2O三元體系中層狀液晶相區(qū); 利用偏光顯微鏡、小角X射線(xiàn)散射儀和旋轉(zhuǎn)流變儀綜合考察了層狀液晶相中含水量、CLA/SCL比例及溫度變化對(duì)層狀液晶結(jié)構(gòu)及流變性的影響; 并以層狀液晶作為親水性藥物5-氟尿嘧啶及親油性藥物姜黃素的DDS,考察了其體外釋藥性能.該研究對(duì)利用脂肪酸構(gòu)筑層狀液晶具有理論指導(dǎo)意義,對(duì)探索其DDS應(yīng)用具有實(shí)用價(jià)值.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

CLA(純度≥95%),大連醫(yī)諾生物有限公司; SCL,自制; 5-氟尿嘧啶(5-FU)、姜黃素和其它試劑均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm),自制.

Axio Imager A2POL型熱臺(tái)偏光顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss AG公司); CP70ME型超速離心機(jī)(日本Hitachi公司; SAXSpoint2.0型小角X射線(xiàn)散射儀(SAXS,奧地利Anton Paar公司); DHR-3型旋轉(zhuǎn)流變儀(美國(guó)Waters公司); SHZ-B型水浴恒溫振蕩器(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司); TU-1950型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司); 透析袋(截留分子量3500,上海源葉生物科技有限公司).

1.2 CLA/SCL/H2O三元體系的偏光紋理測(cè)定

在25 ℃下,將CLA與SCL按不同質(zhì)量比混合均勻,在磁力攪拌下逐漸加入水相中,靜置自組裝48 h后于20～40 ℃溫度范圍內(nèi)用熱臺(tái)偏光顯微鏡觀察載玻片和蓋玻片間樣品的偏光紋理并攝影; 目測(cè)觀察樣品的外觀及黏稠度,兩者結(jié)合確定層狀液晶相區(qū).

1.3 層狀液晶的穩(wěn)定性

以100000 r/min的轉(zhuǎn)速對(duì)層狀液晶區(qū)內(nèi)選定的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)離心10 min,根據(jù)分相情況及偏光紋理判斷實(shí)驗(yàn)點(diǎn)是否為單相體系.

1.4 SAXS測(cè)定

在25 ℃下對(duì)樣品進(jìn)行SAXS測(cè)試,銅靶,波長(zhǎng)0.1542 nm,測(cè)試電壓50 kV; 根據(jù)所得散射矢量比(q1∶,q2∶,q3)判斷樣品的液晶類(lèi)型,并計(jì)算層間距(d).

1.5 流變性測(cè)定

1.6 體外釋藥

采用透析法考察負(fù)載5-FU層狀液晶的體外釋放.將3 mg 5-FU與1 g層狀液晶材料在磁力攪拌下進(jìn)行簡(jiǎn)單混合,靜置48 h后獲得負(fù)載5-FU層狀液晶.稱(chēng)取定量載藥液晶于透析袋中,密封置于pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中,在37 ℃下以80 r/min的速率在水浴恒溫振蕩器中振蕩,定時(shí)從緩沖介質(zhì)中取樣5 mL并補(bǔ)加5 mL新鮮介質(zhì).用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定樣品于266 nm處的吸光度,計(jì)算體外釋藥實(shí)驗(yàn)中5-FU的累計(jì)釋放率(CR).在負(fù)載姜黃素層狀液晶的體外釋藥過(guò)程中,為了有利于釋出的油溶性藥物姜黃素穩(wěn)定在緩沖介質(zhì)中,溶出介質(zhì)選用pH=7.4含30%(體積分?jǐn)?shù))乙醇的磷酸鹽緩沖液,測(cè)定波長(zhǎng)為430 nm,其它過(guò)程與5-FU相同.

2 結(jié)果與討論

2.1 用偏光織構(gòu)判別三元相圖中層狀液晶相區(qū)

Fig.1 Phase diagram of CLA/SCL/H2O system at 25 ℃(A),textures of the lamellar liquid crystals(Lα) obtained by polarizing microscopy before(B) and after(C) ultracentrifugation

在25 ℃下用偏光顯微鏡初步判斷CLA/SCL/H2O三元體系的層狀液晶相區(qū),結(jié)果見(jiàn)圖1(A),其中偏光紋理顯示出油紋狀織構(gòu)的Lα區(qū)為層狀液晶相區(qū),目測(cè)顯示中等黏度; 實(shí)驗(yàn)點(diǎn)a1,a2至a3表示固定CLA/SCL比例而增加水含量,實(shí)驗(yàn)點(diǎn)b1,b2至b3表示固定水含量而增加CLA/SCL比例.由圖1(B)可見(jiàn),6個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)明顯的油紋狀織構(gòu)初步表明皆為層狀液晶[9,23,24]; 由圖1(C)可見(jiàn),經(jīng)超速離心處理后樣品并無(wú)明顯分層現(xiàn)象,其偏光紋理照片仍保持明顯的十字花和油紋狀織構(gòu),可以確認(rèn)為層狀液晶,排除了為SCL層狀液晶穩(wěn)定的CLA/H2O型乳狀液的可能性.以這6個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)為代表研究不同因素對(duì)層狀液晶的結(jié)構(gòu)、流變性以及體外釋藥性能的影響.

2.2 層狀液晶的相參數(shù)

Fig.2 SAXS patterns of Lα at 25 ℃ corresponding to different water contents(a1—a3)(A) and CLA contents(b1—b3)(B)

Table 1 Compositions and the related Lα parameters obtained by SAXS

2.3 層狀液晶的流變性

Fig.3 Viscosity(η) vs. shear of the a series(A) and the b series(B) at 25 ℃

圖3給出了流變曲線(xiàn),可見(jiàn)6個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的黏度隨著剪切速率的增大而不斷降低,是典型的切稀流體,這可能緣于層狀液晶層間在剪切下滑移導(dǎo)致黏度下降.由圖3(A)可見(jiàn),含水量增加導(dǎo)致剪切黏度略微減小,這是由于d值增大使層間更易滑移; 圖3(B)進(jìn)一步表明CLA含量增加導(dǎo)致剪切黏度有所降低,也與d值增大有關(guān).層狀液晶用于DDS時(shí)會(huì)受到外界的擠壓和振蕩,從而引起流變性乃至液晶穩(wěn)定性改變.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該層狀液晶不因剪切而發(fā)生相轉(zhuǎn)變,因此具有一定的抗剪切能力,組成在一定范圍內(nèi)變化也不會(huì)顯著影響其抗剪切能力,推斷其作為DDS可較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定,有利于藥物緩釋.

動(dòng)態(tài)流變性可以反映振蕩對(duì)層狀液晶結(jié)構(gòu)的影響.固定頻率為1 Hz,以實(shí)驗(yàn)點(diǎn)a1和b1為例進(jìn)行應(yīng)力(σ)掃描,得到G′,G″和復(fù)合模量(G*)與σ的關(guān)系,由圖4(A)和(C)可知,G′和G″不隨應(yīng)力變化的區(qū)域?yàn)榫€(xiàn)性黏彈區(qū),而后接近臨界應(yīng)力(σc)時(shí)G′減小而G″增加,大于σc后2個(gè)模量均迅速下降.由圖4(B)和(D)的G*-σ關(guān)系獲得6個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的σc值列于表2,可以看出,σc值隨含水量增加而不斷減小,說(shuō)明層狀液晶結(jié)構(gòu)變得更為松散而不穩(wěn)定;σc值隨CLA含量增加也有類(lèi)似規(guī)律.

Fig.4 Linear viscoelastic region and critical stress of Lα at 25 ℃(A) Stress sweep of a1 at 1 Hz; (B) complex modulus(G*) vs.shear stress(σ) of the a series; (C) stress sweep of b1 at 1 Hz; (D) complex modulus(G*) vs.shear stress(σ) of the b series.

Table 2 Steady-state and dynamic rheologicalparameters of Lα at 25 ℃

Fig.5 Storage modulus(G′) and loss modulus(G″) as a function of ω for the a series(A) and the b series(B) at 25 ℃

圖5給出了在線(xiàn)性黏彈區(qū)內(nèi)層狀液晶的G′和G″與角頻率(ω)的關(guān)系.可以看出,在整個(gè)頻率范圍內(nèi),G′比G″約高1個(gè)數(shù)量級(jí),且隨著ω增加G′變化不大,而G″出現(xiàn)最小值,這是層狀液晶較為典型的流變特征.將同一頻率(ω=1 rad/s)下的模量值列于表2,可以看出,隨含水量增加G′和G″值均減小,這是由于水含量增加會(huì)增大液晶層間距,層層相互作用變?nèi)跛? CLA含量增加也會(huì)導(dǎo)致類(lèi)似結(jié)果.通常層狀液晶的動(dòng)態(tài)流變性好表明彈性好及液晶界面膜穩(wěn)定,由于該層狀液晶具有良好的黏彈性,因此在DDS方面具有應(yīng)用前景.

以實(shí)驗(yàn)點(diǎn)a1和b1為例研究溫度對(duì)層狀液晶的影響.當(dāng)溫度由25 ℃升至37 ℃時(shí),從圖6(A)和(C)可見(jiàn),體系的黏度基本不變或稍有降低,從圖6(B)和(D)可見(jiàn),樣品儲(chǔ)能模量與損耗模量曲線(xiàn)的形狀基本保持不變,表明該層狀液晶不會(huì)因從室溫升高到人體溫度而被破壞,因而適用于DDS.

Fig.6 Effect of temperatures on steady-state and dynamic rheology(A) η vs. of a1; (B) G′ and G″ as a function of ω for a1; (C) η vs. of b1; (D) G′ and G″ as a function of ω for b1.

Fig.7 Cumulative release(CR) rate of 5-FU(A) and curcumin(B) in PBS solution at 37 ℃ and schematic illustration for drug release mechanism of lamellar liquid crystal DDS(C)

2.4 層狀液晶的DDS行為

層狀液晶負(fù)載藥物的原理為簡(jiǎn)單增溶,只需與藥物簡(jiǎn)單混合即可,比其它包埋方法簡(jiǎn)單; 既可負(fù)載親水性藥物也可負(fù)載親油性藥物[9～15,19～24],載藥量高; 且其雙分子層結(jié)構(gòu)具有優(yōu)秀的膜通透性.由于層狀液晶是表面活性劑濃溶液,分為層內(nèi)和層間結(jié)構(gòu),不存在稀溶液中膠束相以外的稀水相,故通過(guò)增溶的負(fù)載量近似為投藥量.上述流變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CLA/SCL/H2O層狀液晶具有良好的抗剪切能力及黏彈性,并且在一定溫度范圍內(nèi)可保持自身結(jié)構(gòu)及流變性基本不變,表明具有用于DDS的潛能.分別研究了用4種CLA/SCL/H2O層狀液晶負(fù)載和緩釋親水性藥物5-FU及親油性藥物姜黃素的性能.作為對(duì)照,圖7(A)和(B)插圖中給出了游離藥物的釋藥曲線(xiàn).圖7(A)為2種含水量的負(fù)載5-FU層狀液晶的緩釋曲線(xiàn),48 h內(nèi)5-FU基本達(dá)到釋藥平衡; 自12 h后釋藥速度較為緩慢,且層狀液晶水含量較低者(a1)釋藥速度更慢且更均一,表明層狀液晶結(jié)構(gòu)越緊致或?qū)娱g距越小越有利于緩/控釋親水性藥物.圖7(B)為2種CLA含量的負(fù)載姜黃素層狀液晶的緩釋曲線(xiàn),姜黃素在48 h內(nèi)基本達(dá)到釋藥平衡,0～24 h時(shí)間內(nèi)釋藥速度極為均一,且CLA含量變化對(duì)其影響不大.這是因?yàn)槭杷运幬锝S素自層狀液晶層內(nèi)釋放,而5-FU自層間釋放,因而層狀液晶具有更好的緩/控釋疏水性藥物的能力.層狀液晶對(duì)2種藥物均有較好的緩釋能力,其釋藥機(jī)理如圖7(C)所示.

3 結(jié) 論

以CLA為分子砌塊,與其鈉鹽SCL共同在水中構(gòu)筑層狀液晶體系,利用偏光顯微鏡并輔以目測(cè)初步確定了體系的層狀液晶相,結(jié)果顯示,易于獲得較為寬闊的層狀液晶相區(qū).偏光顯微鏡、小角X射線(xiàn)散射儀和旋轉(zhuǎn)流變儀獲得的偏光織構(gòu)、層間距等相參數(shù)、穩(wěn)態(tài)和動(dòng)態(tài)流變參數(shù)等表明,含水量和CLA含量增加均使層狀液晶的黏度降低、層間距增加,儲(chǔ)能模量和損耗模量減小,從而使層狀液晶結(jié)構(gòu)更為松散; 而實(shí)驗(yàn)溫度變化對(duì)層狀液晶流變性的影響不大.因此,該層狀液晶具有良好的抗剪切能力和黏彈性,及良好的耐溫變能力,具有用作DDS的潛能.采用透析研究了負(fù)載親水性藥物5-FU或親油性藥物姜黃素的層狀液晶作為DDS的體外釋藥曲線(xiàn),表明層狀液晶對(duì)這2種藥物均有良好的緩釋能力,48 h內(nèi)藥物基本達(dá)到釋藥平衡.研究結(jié)果可為脂肪酸層狀液晶的理論研究和開(kāi)發(fā)實(shí)際應(yīng)用提供參考.