秦春萍,王先流,唐 寒,易兵成,劉 暢,張彥中

(東華大學化學化工與生物工程學院,上海 201620)

骨組織是人體硬組織的主要構成部分,擔負支撐肢體、保護器官、造血、貯鈣和代謝等機體功能,是人體最重要的組織器官之一.如果受到創(chuàng)傷、感染和骨腫瘤等引起的骨缺損,將給患者帶來嚴重的生理和心理創(chuàng)傷.盡管骨骼具有自愈和再生能力,但大面積骨缺損仍需骨移植和替代治療[1,2].目前,臨床應用較多的骨移植替代物主要為自體骨和同種異體骨.但自體骨存在來源有限及對供體部位造成二次創(chuàng)傷等缺陷; 而同種異體骨則有免疫反應和攜帶疾病的風險[3].隨著全球人口老齡化加劇,對骨缺損修復的臨床需求大大增加.因此,研發(fā)人工骨替代物,特別是可誘導骨再生的骨替代物具有重要意義.其中,基于生物材料的骨組織工程技術(BTE)能夠構建在組成、結構和功能上高度仿生天然骨的骨組織工程支架,在骨再生修復領域極具應用潛力[1].BTE支架一般應滿足合適的力學性能、孔隙率、生物可吸收性和生物相容性等需求[1～4].目前,基于可降解聚合物和骨傳導材料(如磷酸三鈣和羥基磷灰石等)的骨組織工程支架廣泛應用于BTE,而這些材料的生物活性不佳仍然是限制其應用功效的一個主要障礙[5].

近年來,科研工作者開始關注源于天然組織的生物活性材料,尤其是骨組織的衍生物(如脫鈣骨和脫細胞骨)在骨組織再生中的作用[6,7].基于組織或細胞的脫細胞基質材料由于保留了天然組織細胞外基質(ECM)的特異性結構和生物活性成分,在應用于多種組織或器官的修復和重建時具有較好的修復和再生功效[8～10].源于骨組織的脫細胞基質(DBM)保留了天然骨組織的結構和生化信號,是一種極具潛力的生物活性材料,并有研究證明DBM具有骨誘導性[6,11,12].近年來,可塑填料、水凝膠和納米微粒[13～15]等多種形式的DBM廣泛應用于生物醫(yī)學研究或臨床實驗.但制備方法的不同及供體間差異仍會極大地影響DBM的穩(wěn)定性和臨床表現(xiàn); 且現(xiàn)有的DBM基支架的制備方法難以調控DBM的理化性能,難以適應不同應用場景[13].因此,發(fā)展新型的性能可調控的基于DBM的骨組織工程支架對于增強DBM的應用功效具有重要意義.

靜電紡絲技術是一種簡單可行的制備納米纖維支架的方法,由于這種超細纖維結構可仿生天然ECM中的納米纖維細度,從而影響細胞響應行為,并且纖維的理化性質可通過改變紡絲參數(shù)進行調控,因而廣泛應用于骨組織工程支架的制備[16～18].由于可以保留合成聚合物的力學性能和可電紡性及天然材料的生物活性等優(yōu)點,合成-天然材料雜化電紡已成為一種最常見的且簡單有效的仿生纖維制備方法[19].Gao等[20]將半月板脫細胞基質(DMECM)與聚己內酯(PCL)共混電紡形成DMECM/PCL纖維,發(fā)現(xiàn)DMECM/PCL纖維有利于半月板細胞分泌膠原和糖胺聚糖及促進細胞外基質的有序排列.目前將DBM與電紡纖維結合用于骨組織工程的研究鮮有報道.本文首先制備了DBM,并通過酶消化法使其結構變得松散易于溶解; 通過靜電紡絲技術制備了含有DBM的左旋聚乳酸(PLLA)電紡纖維(PLLA/DBM); 研究了PLLA/DBM電紡纖維對骨髓間充質干細胞(BMSCs)的增殖、黏附及成骨分化等行為的影響及體外生物礦化能力.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

新鮮豬股骨,購于上海龍源菜場; 左旋聚乳酸,分子量1×105,濟南岱岡生物材料有限公司; 鹽酸(HCl),上海凌峰化學試劑有限公司; 無水乙醚(純度99.7%)、多聚甲醛(純度95%)、氫氧化鈉(NaOH,純度96%)和十六烷基氯化吡啶(CPC,純度98%),國藥集團化學試劑有限公司; 六氟異丙醇(HFIP),分析純,上海達瑞精細化學品有限公司; 胃蛋白酶,源于豬胃黏膜,美國Sigma-Aldrich公司; 動物基因組DNA快速抽提試劑盒,生工生物工程股份有限公司; DMEM/F12培養(yǎng)基,杭州吉諾生物醫(yī)藥技術公司; 胎牛血清(FBS)和鏈霉素/青霉素(P/S),美國Gibco公司; CCK-8試劑,日本同仁化學研究所; 堿性磷酸酶(ALP)試劑盒,南京建成生物工程研究所; 茜素紅S染色液(ARS),pH=4.2,北京索萊寶科技有限公司; ALP顯色試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司; 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料和鬼筆環(huán)肽染料,美國Invitrogen公司; 改良型模擬體液(SBF),無菌,福建飛凈生物科技有限公司.

PB100型手持式組織勻漿儀,英國Prima公司; Nanodrop 2000c型分光光度計、MULTISKAN MK3型酶標儀、Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀和Quanta 250型環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM),美國賽默飛世爾科技公司; HE safe1200A2型生物安全柜和HF90型二氧化碳培養(yǎng)箱,力康生物醫(yī)療科技控股有限公司; Nikon Ti-2型倒置熒光顯微鏡,日本Nikon公司; Phenom XL型掃描電子顯微鏡(SEM),復納科學儀器有限公司; DSA30型接觸角測量儀,克呂氏科學儀器有限公司; TXR1020N30-30型高壓電源,大連泰思曼科技有限公司; KDS-100型微量注射泵,美國KD Scientific公司; D/Max2550VB+/PC 型X射線衍射(XRD)儀,日本理學公司.

1.2 DBM的提取與鑒定

將新鮮豬股骨松質骨切碎后在液氮中研磨至顆粒狀,置于0.5 mol/L HCl中室溫攪拌脫鈣72 h,用去離子水洗滌24 h后經乙醇浸泡3.5 h及乙醚浸泡1.5 h進行脫脂,水洗后凍干得到脫鈣骨; 將脫鈣骨加入少量去離子水中,用手持式組織勻漿儀進行均質; 隨后用1 mol/L的NaOH溶液處理3.5 h,于3500 r/min離心10 min,棄去上清液,重復3次以徹底除去NaOH溶液,凍干后研磨得到DBM粉末.

將DBM粉末和脫鈣骨顆粒經過石蠟包埋并切片后進行蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson三色染色,在光學顯微鏡下觀察DBM中細胞核的去除情況與骨膠原分布情況.

用動物基因組DNA提取試劑盒提取天然骨組織和DBM中的雙鏈DNA,通過Nanodrop 2000c分光光度計測定DNA含量.

1.3 PLLA/DBM電紡纖維的制備與表征

配制濃度為1 mg/mL的胃蛋白酶-HCl溶液(HCl濃度為0.01 mol/L),將DBM按5 mg/mL的濃度加入到胃蛋白酶-HCl溶液中,室溫攪拌,反應48～72 h,使DBM中的蛋白成分在酶消化作用下水解,直至溶液中無肉眼可見的DBM顆粒; 用NaOH溶液調節(jié)pH值至7.4,冷凍干燥后獲得可溶性DBM; 將PLLA與DBM分別以質量比10∶,0,9∶,1,7∶,3和5∶,5溶于HFIP中,磁力攪拌48 h,直至形成質量分數(shù)為8%的穩(wěn)定、無明顯顆粒的紡絲液; 在注射速率為1 mL/h,接收距離為15 cm,電壓15 kV條件下進行靜電紡絲; 將PLLA/DBM電紡纖維于室溫真空干燥72 h以上,以去除纖維中殘留的有機溶劑.根據(jù)PLLA與DBM的質量比,所得PLLA/DBM電紡纖維分別命名為PLLA/DBM-10/0,PLLA/DBM-9/1,PLLA/DBM-7/3和PLLA/DBM-5/5.

將PLLA/DBM電紡纖維固定在粘有導電膠的掃描電子顯微鏡樣品臺上,放入噴金儀噴金90 s,觀察PLLA/DBM電紡纖維表面形貌,使用Image J1.44P軟件測量纖維直徑并分析纖維直徑分布情況; 用FTIR光譜表征不同比例PLLA/DBM電紡纖維的組成,掃描波長范圍為4000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)為128次; 將樣品平整鋪于接觸角載物臺上,將3 μL去離子水滴在待測樣品上,實時觀測接觸角變化并拍攝照片.

1.4 PLLA/DBM電紡纖維的生物特性評價

將PLLA/DBM電紡纖維包覆于直徑為15 mm的玻片上,經UV光照射2 h、75%乙醇浸泡1 h、無菌PBS清洗3次進行滅菌.選用本課題組提取的大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)進行細胞實驗[21],培養(yǎng)基為含體積分數(shù)為15% FBS和1% P/S的DMEM/F12培養(yǎng)基.

將PLLA/DBM-10/0,PLLA/DBM-9/1,PLLA/DBM-7/3和PLLA/DBM-5/5電紡纖維置于24孔板內,選取第4代BMSCs,將胰酶消化后的細胞懸液按每孔2×104Cell的細胞密度接種于24孔板內,用培養(yǎng)基培養(yǎng),每2 d更換培養(yǎng)基; 分別培養(yǎng)1,4,7 d,用CCK-8試劑檢測細胞在纖維上的增殖情況.以種植在空白24孔板(TCP)中的細胞為空白對照.

將PLLA/DBM-10/0和PLLA/DBM-7/3置于24孔板內,選取第4代BMSCs,將胰酶消化后的細胞懸液按每孔5×103Cell的細胞密度接種于24孔板內; 分別培養(yǎng)2和24 h,用4%多聚甲醛固定細胞,先后用鬼筆環(huán)肽染液和DAPI染液分別對細胞骨架和細胞核進行熒光染色,隨后在倒置熒光顯微鏡下觀察.

將PLLA/DBM-10/0和PLLA/DBM-7/3置于24孔板內,選取第4代BMSCs,將細胞懸液按每孔1×104Cell的細胞密度接種于24孔板內,用培養(yǎng)基培養(yǎng),每2 d更換1次培養(yǎng)基; 培養(yǎng)7 d時對細胞進行ALP染色,在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的ALP分泌情況; 根據(jù)ALP定量試劑盒說明書對細胞ALP活性進行定量檢測,于492 nm處測定反應液光密度(OD)值; 培養(yǎng)21 d時對細胞進行ARS染色,然后用10%的十六烷基氯化吡啶(CPC)溶液將染料洗脫,洗脫液于570 nm測定OD值進行染色定量.ALP活性定量和ARS定量結果除以相應時間點對應的細胞CCK-8數(shù)值,以消除細胞數(shù)量對定量結果的影響.

將PLLA/DBM-10/0和PLLA/DBM-7/3電紡纖維裁剪成5 mm×5 mm的小塊,分別置于5 mL改良型模擬體液(SBF)中,于37 ℃搖床中振蕩孵育14 d,每天更換SBF; 分別于第7和第14 d時取出纖維,用去離子水清洗后自然干燥; 通過SEM觀察纖維表面磷灰石的形成情況.利用X射線衍射儀分析礦化樣品的結晶結構,通過ESEM連接的能量色散X射線光譜儀(EDS)分析礦化樣品的元素組成.

1.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示,采用Origin 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,用單因素方差分析(One way ANOVA)分析數(shù)據(jù)間是否有顯著性差異.當*P<0.05時認為有顯著性差異,**P<0.01時認為有極顯著性差異.

2 結果與討論

2.1 DBM的制備與表征

Fig.1 Optical(A1,A2),HE staining(B1,B2) and Masson trichrome staining(C1,C2) images of demineralized bone matrix(A1—C1) and decellularized bone matrix(A2—C2)

Fig.2 DNA content comparison between decellularized bone matrix and the native bone(**P< 0.01)

豬股骨松質骨經過研磨、脫鈣及脫脂處理后,變?yōu)榘咨撯}骨顆粒[圖1(A1)].進一步均質、脫細胞后,得到白色粉末狀固體DBM[圖1(A2)].對脫鈣骨和DBM進行組織學染色,HE染色結果[圖1(B1)和(B2)]表明脫鈣處理后,脫鈣骨中仍存在細胞核,但經脫細胞處理后,細胞核幾乎被完全去除.由Masson三色染色結果[圖1(C1)和(C2)]可見,成熟的骨膠原中有更多二糖苷鏈,交聯(lián)度更高,在Masson三色染色中更傾向于著紅色; 不成熟的骨質或軟骨傾向于著藍色[22].由Masson三色染色結果可知,經過脫細胞處理后,骨組織中的膠原成分得到保留,且脫細胞前后骨膠原結構沒有明顯變化.DNA含量檢測結果(圖2)顯示,天然骨組織和DBM中DNA含量分別為(1730.37±602.28)和(8.53±2.21) ng/mg,表明經過脫細胞處理后,與天然骨組織相比,DBM中DNA含量顯著下降,且低于以往研究中認可的脫細胞組織中DNA殘留含量標準(低于50 ng/mg組織)[23].以上結果表明,本文采用的脫細胞處理方法能夠有效去除骨組織中的細胞成分及細胞核,并較好地保留了骨基質中的膠原成分.

Fig.3 SEM images(A—D) and the corresponding diameter distributions(E—H) of PLLA/DBM-10/0(A,E),PLLA/DBM-9/1(B,F),PLLA/DBM-7/3(C,G) and PLLA/DBM-5/5(D,H) electrospun nanofibers

2.2 PLLA/DBM電紡纖維的形貌及性能

DBM經胃蛋白酶消化后,成為分散的膠原纖維,變?yōu)橥该鞒吻迦芤?用NaOH溶液調節(jié)pH值至7.4,凍干后形成的海綿狀固體能夠均勻分散于HFIP中,形成可電紡溶液.由圖3可見,通過電紡可制備PLLA/DBM質量比分別為10∶,0,9∶,1,7∶,3和5∶,5的電紡纖維; PLLA/DBM-10/0,PLLA/DBM-9/1,PLLA/DBM-7/3和PLLA/DBM-5/5電紡纖維呈現(xiàn)較為均一的形貌,直徑范圍為100～400 nm[平均直徑Dav分別為(305±52),(239±36),(221±48)和(169±53)nm].隨著DBM比例增加,纖維直徑有變細的趨勢,這可能是因為DBM分子量較PLLA低,加入后使紡絲液黏度降低,分子鏈纏結程度較低,聚合物分子鏈獲得較充分的電場力拉伸,使纖維直徑變細.

圖4(A)為PLLA/DBM電紡纖維和DBM粉末的紅外光譜圖.圖4(A)中1753 cm-1附近的吸收峰為PLLA的酯鍵中的羰基伸縮振動峰,1640 cm-1附近的吸收峰為膠原成分酰胺鍵中的羰基伸縮振動峰,1550 cm-1附近的吸收峰為酰胺鍵中的—N—H彎曲振動峰和—C—N伸縮振動峰[24].結果表明,隨著DBM含量升高,1640和1550 cm-1附近的吸收峰出現(xiàn)并增強,證明DBM與PLLA成功復合.

材料親水性對于細胞的黏附和增殖有重要影響.由圖4(B)可見,PLLA表面疏水性較強,不利于細胞黏附[25]; 隨著DBM成分的引入,纖維的水浸潤性明顯增強.這可能是由于DBM中富含氨基及羧基等親水性基團,因此DBM的引入使纖維表面親水性增強.研究表明纖維直徑可能影響材料的親水性,纖維直徑較小時,材料的比表面積較大,具有吸附介質以降低表面勢能的趨勢[26].纖維水浸潤性的增強有利于后續(xù)細胞黏附和生長.

Fig.4 FTIR spectra(A) and water contact angles(B) of PLLA/DBM electrospun nanofibers(A) a.DBM; b.PLLA/DBM-10/0; c.PLLA/DBM-9/1; d.PLLA/DBM-7/3; e.PLLA/DBM-5/5. (B) a.PLLA/DBM-10/0; b.PLLA/DBM-9/1; c.PLLA/DBM-7/3; d.PLLA/DBM-5/5.

2.3 BMSCs在PLLA/DBM電紡纖維上的增殖和形貌

圖5給出BMSCs在不同比例PLLA/DBM電紡纖維膜上培養(yǎng)1,4,7 d后的CCK-8檢測結果.在各個時間點,各組纖維均能支持BMSCs的增殖.培養(yǎng)1 d時,與PLLA/DBM-9/1和PLLA/DBM-5/5電紡纖維相比,細胞在PLLA/DBM-10/0和PLLA/DBM-7/3電紡纖維上的增殖能力更強; 培養(yǎng)4 d時,PLLA/DBM-7/3電紡纖維對細胞增殖有最明顯的促進作用; 培養(yǎng)7 d時,各組電紡纖維上的細胞增殖無顯著性差異.以上結果表明,PLLA/DBM能支持BMSCs的增殖,沒有細胞毒性,這可能是因為DBM的引入使纖維的親水性增強,且其主要成分是與成骨相關的活性蛋白,能夠為細胞黏附提供位點,促進細胞黏附及增殖等行為[19].在引入DBM的各組纖維中,PLLA/DBM-7/3電紡纖維對細胞增殖的影響較明顯,因此選擇該樣品進行后續(xù)實驗.

Fig.6 Cell morphologies of BMSCs cultured on PLLA/DBM-10/0(A,C) and PLLA/DBM-7/3(B,D) electrospun nanofibers after 2 h(A,B) and 24 h(C,D)

細胞早期的黏附和鋪展對于后續(xù)的細胞增殖及分化等行為有重要的影響.對種植在PLLA/DBM-10/0和PLLA/DBM-7/3電紡纖維上2和24 h的細胞進行細胞核-細胞骨架染色,觀察細胞在纖維表面的形貌.由圖6可見,細胞種植2 h后,PLLA/DBM-10/0電紡纖維上的細胞呈圓形形貌,細胞鋪展并不明顯; 而PLLA/DBM-7/3電紡纖維上的細胞呈現(xiàn)出多邊形形貌,其偽足向四周鋪展.細胞種植24 h后,與PLLA/DBM-10/0電紡纖維相比,PLLA/DBM-7/3電紡纖維上的細胞數(shù)量更多,且呈現(xiàn)被拉長的形貌.以上結果表明,DBM的加入能夠為BMSCs的黏附提供活性位點,有利于細胞鋪展,尤其是沿細胞長軸方向的鋪展,良好的細胞黏附和鋪展行為將對成骨分化有促進作用.

2.4 BMSCs在PLLA/DBM電紡纖維上的成骨分化

將BMSCs分別在PLLA/DBM-10/0和PLLA/DBM-7/3電紡纖維上培養(yǎng),7 d后進行ALP染色和定量檢測; 21 d后進行ARS染色及定量,以研究DBM成分的引入對于BMSCs成骨分化的影響.ALP染色結果[圖7(A,B)]表明,兩組纖維上的細胞都分泌了堿性磷酸酶,但與PLLA/DBM-10/0電紡纖維相比,PLLA/DBM-7/3電紡纖維上的細胞有更明顯的ALP染色陽性.ALP定量結果[圖7(C)]與染色結果一致,與PLLA/DBM-10/0電紡纖維相比,PLLA/DBM-7/3電紡纖維上的BMSCs具有更強的ALP活性,證明DBM的引入能夠促進BMSCs早期成骨分化.圖7(D,E)給出PLLA/DBM電紡纖維上細胞ARS染色結果,PLLA/DBM-10/0電紡纖維上鈣沉積較少,而PLLA/DBM-7/3電紡纖維上有明顯的大片鈣沉積.定量結果[圖7(F)]與染色結果一致.以上結果證明,DBM的引入能夠促進BMSCs的成骨分化,這可能是因為DBM的主要成分為Ⅰ型膠原,Ⅰ型膠原蛋白可以促進干細胞的成骨分化[27]; 另外,我們推測DBM中或許也含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族(BMPs)的生長因子,能夠通過WNT信號通路誘導成骨分化[28].

Fig.7 ALP staining(A,B), quantified ALP activity(C,**P<0.01),ARS staining(D,E) and ARS quantification(F,**P<0.01) of BMSCs cultured on PLLA/DBM electrospun nanofibers(A),(D) PLLA/DBM-10/0; (B),(E) PLLA/DBM-7/3.

Fig.8 SEM images(A—D) and XRD patterns(E) of PLLA/DBM electrospun nanofibers after being incubated in SBF(A) PLLA/DBM-10/0,7 d; (B) PLLA/DBM-7/3,7 d; (C) PLLA/DBM-10/0,14 d; (D) PLLA/DBM-7/3,14 d.(E) a.PLLA/DBM-7/3; b.PLLA/DBM-7/3 after mineralization for 14 d; c.PLLA/DBM-10/0; d.PLLA/DBM-10/0 after mineralization for 14 d.

2.5 PLLA/DBM電紡纖維的生物礦化

通過將生物材料置于含有與人體血漿相近離子濃度的模擬體液(SBF)中孵育,檢測材料表面磷灰石的形成情況,從而預測材料植入體內后的骨結合能力,減少實驗動物的使用并縮短實驗周期[29].將PLLA/DBM-10/0和PLLA/DBM-7/3電紡纖維分別置于SBF中孵育7和14 d,取出,通過SEM觀察纖維表面的礦化情況,并通過XRD及EDS對纖維表面的礦化進行結構和元素分析.由圖8(A—D)可見,礦化7 d時,PLLA/DBM-7/3電紡纖維上有明顯的磷灰石沉積,并且磷灰石沿纖維方向生長,沒有使纖維完全失去表面形貌; 而PLLA/DBM-10/0電紡纖維上僅有少量磷灰石沉積.礦化14 d時,磷灰石在PLLA/DBM-7/3電紡纖維上進一步沿纖維生長； 而PLLA/DBM-10/0電紡纖維上的礦化仍不明顯.XRD結果[圖8(E)]顯示,礦化后的PLLA/DBM-7/3電紡纖維在26°和32°出現(xiàn)衍射峰,為羥基磷灰石的特征衍射峰,而PLLA/DBM-10/0電紡纖維中并未出現(xiàn)與羥基磷灰石吻合的衍射峰.EDS結果(表1)顯示礦化14 d后,PLLA/DBM-10/0電紡纖維上僅含有少量Ca和P元素,幾乎可以忽略不計; 而PLLA/DBM-7/3電紡纖維上的Ca和P元素分別達到10.43%和18.6%,Ca/P比值為1.78,接近天然羥基磷灰石的Ca/P比值(1.67).研究表明,膠原蛋白能夠作為模板誘導磷灰石在其表面成核,形成礦化沉積[30].以上實驗結果表明,DBM的引入確實有利于電紡纖維的生物礦化,可以預測其植入體內后能與天然骨有良好的融合,促進骨再生.

Table 1 Chemical composition of PLLA/DBM electrospun nanofibers after beingincubated in SBF by EDS analysis

3 結 論

通過脫細胞技術制備了DBM,再通過胃蛋白酶消化使DBM變?yōu)榭扇苄问?將可溶性DBM與PLLA共混電紡成功制備了PLLA/DBM電紡纖維,DBM含量最高可達50%.DBM的引入不會明顯影響纖維形貌,各比例電紡纖維具有均一的形貌,且隨著DBM的含量升高,纖維的水浸潤性增強.含有DBM的纖維有利于BMSCs的黏附和鋪展,無細胞毒性,ALP染色、定量及ARS染色及定量實驗結果表明含有DBM的纖維有利于BMSCs向成骨分化.含有DBM的纖維能夠在SBF中形成礦化層,可以預測其在體內具有良好的骨結合性.