申志慧 王亞 李昊聰 卯新蕊 馮發(fā)運 任立云 余向陽

摘要：從廢棄農(nóng)藥廠周邊土壤中分離篩選得到1株以氟環(huán)唑為唯一碳源的降解菌，命名為F1。經(jīng)過對菌落菌體的形態(tài)觀察、16S rRNA序列相似性及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步鑒定其為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）菌株，其親緣關(guān)系與昆明假單胞菌（Pseudomonas kunmingensis）最近。進一步優(yōu)化F1降解氟環(huán)唑的條件，結(jié)果表明，氟環(huán)唑初始濃度為20 mg/L、溫度為30 ℃、pH值為7.0時，菌株降解氟環(huán)唑的效果最佳。在最佳條件下，接入菌懸液使無機鹽液體培養(yǎng)基在600 nm處的吸光度（D600 nm）為0.1，培養(yǎng)4 d后，菌株達到生長高峰，培養(yǎng)6 d時氟環(huán)唑降解率達90.4%。研究還發(fā)現(xiàn)，增加接菌量能明顯提高F1對氟環(huán)唑的降解效率。

關(guān)鍵詞：農(nóng)藥;氟環(huán)唑;假單胞菌屬;生物修復;影響因子;降解特性

中圖分類號： X592;S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）04-0273-05

收稿日期：2019-10-17

基金項目：國家自然科學基金（編號：31772197）。

作者簡介：申志慧（1991-），女，河南安陽人，碩士研究生，主要從事微生物降解農(nóng)藥研究。E-mail：1097130928@qq.com。

通信作者：余向陽，博士，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。E-mail：yuxy@jaas.ac.cn。

氟環(huán)唑（epoxiconazole）是一類新型三唑類含氟殺菌劑，具有內(nèi)吸和殘留活性，可以通過抑制麥角甾醇的形成，阻礙病菌的細胞壁形成[1]，通常用于防治谷物條銹病等多種病害[2]。由于具有良好的內(nèi)吸性和殺菌活性，氟環(huán)唑在殺菌劑市場中所占的份額日漸增大[2-4]，其殘留危害也日漸受到關(guān)注。Taxvig等發(fā)現(xiàn)，高劑量氟環(huán)唑?qū)θ焉锲诤筒溉槠诘拇笫笥猩扯拘?，而低劑量的氟環(huán)唑可導致大鼠子代體質(zhì)量增加，另外可通過參與擾亂類固醇激素合成的關(guān)鍵酶對大鼠的胎兒分化及內(nèi)分泌產(chǎn)生影響[5]。Hester等研究發(fā)現(xiàn)，氟環(huán)唑能夠引起肝細胞腫大，肝癌細胞增殖，且可對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、細胞色素P450和氧化應激的基因轉(zhuǎn)錄等造成影響[6]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，氟環(huán)唑等被大量運用于作物病害防治，它在土壤、水體等環(huán)境中的滯留期及非生物降解半衰期較長，給農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量帶來安全隱患[7-8]。

近年來，有研究表明，利用微生物降解有機污染物，進行環(huán)境修復是一種安全有效、易于操作、低成本且無二次污染的生物修復技術(shù)[9-10]。國內(nèi)外關(guān)于三唑類殺菌劑的降解研究主要集中于戊唑醇[11-15]、丙環(huán)唑[15-17]、烯唑醇[18]、三唑醇[19]、苯醚甲環(huán)唑[20-21]等上。微生物降解農(nóng)藥的機制包括酶促反應和非酶促反應，微生物對三唑類農(nóng)藥的降解大多通過酶促反應，包括氧化、羥基化、脫鹵及還原等反應過程[22]。此外，溫度、濕度、pH值、含氧量等環(huán)境因素可能會影響微生物對三唑類農(nóng)藥的降解效率。目前，有關(guān)微生物降解三唑類殺菌劑的研究較多，且以往研究篩選到的菌株對幾種三唑類殺菌劑均有較好的降解效果[11-21]。然而，作為1種新型三唑類殺菌劑，國內(nèi)外還未發(fā)現(xiàn)氟環(huán)唑相關(guān)降解菌的篩選及其降解特性研究。

本研究篩選到1株對氟環(huán)唑有良好降解效果的假單胞菌，初步分析其對氟環(huán)唑的降解特性及影響因素，以期為三唑類農(nóng)藥污染土壤的生物修復提供借鑒和材料。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?樣本來源?土樣采自江蘇省蘇科農(nóng)化有限責任公司廠區(qū)。

1.1.2?主要試劑?95%氟環(huán)唑原藥，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司;98.5%氟環(huán)唑標準品，德國Dr. Ehrensterfer公司;色譜純乙腈，德國Darmstadt公司;其他試劑除特別說明外均為分析純。

1.1.3?培養(yǎng)基?無機鹽液體培養(yǎng)基：0.4 gMgSO4·7H2O，0.2 g FeSO4·7H2O，0.2 g K2HPO4，0.2 g （NH4）2SO4，0.08 g CaSO4，去離子水定容至1 000 mL，pH值為7.0±0.2。

LB液體培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，去離子水定容至1 000 mL。LB固體培養(yǎng)基分別在上述液體培養(yǎng)基中加瓊脂15 g/L，pH值為7.0。以上培養(yǎng)基均在溫度為121 ℃條件下，滅菌20 min后，備用。

1.1.4?儀器設備?WH-3微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司;A-1506型紫外可見分光光度計 ，上海奧析科學儀器有限公司;SW-CJ-1D凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;ZQZY-70BF振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司;Five go便攜式pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;Agilent LC/MS-1260/6410液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2?氟環(huán)唑降解菌的篩選和純化

初篩：取5 g土壤，置于LB液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)24 h后，依次轉(zhuǎn)移至含氟環(huán)唑50、100、200 mg/L的無機鹽液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)5 d。利用平板劃線法在LB固體培養(yǎng)基上分離純化菌株，獲得純化菌株8株，分別編號為F1～F8。將菌株F1～F8接種于LB液體培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，并將富集的純菌種保存在30%的甘油中，于-60 ℃ 冰箱中保存待用。

復篩：將初篩得到的F1～F8單菌落分別接種于以氟環(huán)唑為唯一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min 下振蕩培養(yǎng)，以不接菌的處理組為對照，每個處理重復3次。培養(yǎng)6 d后取樣測定氟環(huán)唑含量并計算降解率。選擇降解效能高且生長速度快的細菌為目標菌株，進一步研究其降解特性。

1.3?菌株鑒定

細菌16S rRNA的測序與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建基本步驟如下：提取細菌DNA基因組→16S rRNA PCR擴增→PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳及純化回收→TA克隆→驗證（陽性）→測序→NCBI比對同源性。16S rRNA擴增引物為通用引物，正向引物為27F（5′-TTGATCMTGGCTCAG-3′），反向引物為1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）;TA克隆后測序的正向引物為M13F（5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3′），反向引物為M13R（5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′）。測序方式為雙向測序，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。將測序結(jié)果在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中與具有相似性的細菌16S rRNA序列進行比對，選擇同源性最高（≥97%）的序列，利用ClustalX進行多重序列比對后，用MEGA 6.0軟件進行遺傳距離計算，鄰接法（NJ法）構(gòu)建細菌的系統(tǒng)進化樹。

1.4?生長曲線測定

將菌種接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)，每隔2 h測定1次培養(yǎng)基在600 nm處的吸光度（D600 nm），連續(xù)測定24 h，繪制菌株生長曲線。取處于穩(wěn)定生長期的液體菌種進行氟環(huán)唑降解試驗。

1.5?菌株對氟環(huán)唑的降解特性

1.5.1?菌懸液制備

將“1.4”節(jié)中所得到的菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，放置在30 ℃、200 r/min培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)14 h。取20 mL富集菌液于4 ℃、5 000 r/min 下離心5 min，棄去上清液，用10 mL 無菌水清洗濃縮菌體，重復3次，用5 mL無菌水稀釋后配制成菌懸液母液。

1.5.2?菌株對氟環(huán)唑的降解特性及其生長規(guī)律

將“1.5.1”節(jié)中的菌懸液母液接種到50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中，調(diào)整D600 nm為0.1，添加氟環(huán)唑至其質(zhì)量濃度為20 mg/L，測定初始D600 nm和氟環(huán)唑含量。以不接菌（加入與接菌液等體積的無菌水）的培養(yǎng)基作為對照，每處理重復3次。于30 ℃、200 r/min 搖床中避光培養(yǎng)，每天定時取樣測定D600 nm及氟環(huán)唑殘留量。

1.5.3?溫度和初始pH值對菌株降解效率的影響

用1 mol/L氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)無機鹽液體培養(yǎng)基的pH值分別為5、6、7、8、9[培養(yǎng)基中3-（N-嗎啉基）丙磺酸（MOPS）緩沖液濃度為5 mmol/L]。滅菌后，將“1.5.1”節(jié)中的菌懸液母液接種到50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中，調(diào)整D600 nm為0.1，添加氟環(huán)唑使其質(zhì)量濃度為20 mg/L，分別置于25、30、35 ℃的搖床（轉(zhuǎn)速為200 r/min）中避光培養(yǎng)6 d后取樣測定培養(yǎng)液中氟環(huán)唑的殘留量。每個處理3次重復。

1.5.4?接菌量對菌株降解效率的影響

將“1.5.1”節(jié)中的菌懸液母液接種到50 mL滅菌的無機鹽液體培養(yǎng)基（pH值為7.0）中，調(diào)整D600 nm分別為0.05、0.10、0.20、0.50，添加氟環(huán)唑至其質(zhì)量濃度為20 mg/L，于30 ℃、200 r/min下避光培養(yǎng)，分別于0、2、4、6 d取樣測定培養(yǎng)液中氟環(huán)唑殘留量。每個處理重復3次。

1.5.5?氟環(huán)唑質(zhì)量濃度對菌株降解效率的影響

將“1.5.1”節(jié)中的菌懸液母液接種到50 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中，調(diào)整D600 nm為0.1，添加氟環(huán)唑至其初始質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50 mg/L，培養(yǎng)、取樣及測定方法同“1.5.4”節(jié)。每個處理重復3次。

1.6?氟環(huán)唑提取及分析方法

1.6.1?提取及凈化

采用Quechers法[23]提取氟環(huán)唑：取2 mL樣品溶于10 mL乙腈中，添加1 g NaCl渦旋振蕩1 min后，在5 000 r/min下離心5 min，吸取上清液0.5 mL置于10 mL離心管中，加3.5 mL乙腈渦旋振蕩1 min，最后加入0.05 g N-丙基乙二胺和0.100 g無水硫酸鎂進行凈化，過0.22 μm有機系濾膜，待測。

1.6.2?儀器檢測條件

液相色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18（3.5 μm，2.1×150 mm）;流動相比例設置為9 ∶1，其中A相為100%色譜乙腈，B相為0.1%甲酸;等梯度洗脫;流速為0.4 mL/min;進樣體積為5 μL;柱溫為室溫。

質(zhì)譜條件：多反應監(jiān)測掃描模式;電噴霧正離子源;離子化電壓為4 000 V;霧化溫度為350 ℃;噴霧氣壓為25 Psi。具體質(zhì)譜監(jiān)測參數(shù)見表1。

在上述條件下，氟環(huán)唑的添加回收率為91.6%～96.5%。

2?結(jié)果與分析

2.1?氟環(huán)唑降解菌的分離篩選

經(jīng)過富集培養(yǎng)、梯度馴化、分離純化等過程，得到8株可在含氟環(huán)唑的無機鹽液體培養(yǎng)基中生長并可耐受200 mg/L氟環(huán)唑的菌株，通過初步降解試驗發(fā)現(xiàn)，其中1株菌株能夠以氟環(huán)唑為唯一碳源快速生長，且對氟環(huán)唑有較好的降解效果，將其命名為F1。在LB固體培養(yǎng)基上，菌落呈白色突起、圓形、邊緣整齊、質(zhì)地光滑、黏稠。

2.2?菌種鑒定

菌株F1的DNA通過PCR擴增得到約1.4 kb的16S rRNA基因片段，對該基因片段進行測序，并將測序結(jié)果在NCBI上進行Blast同源性比對，結(jié)果表明，該菌株與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）相似度達99%，將該菌株的16S rRNA序列提交至GenBank，獲得的登錄號為MN515069。使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，該菌株與昆明假單胞菌Pseudomonas kunmingensis HL22-2同源性最為高。

2.3?降解菌的生長曲線

從圖2可以看出，F(xiàn)1菌株接入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后進入對數(shù)生長期，10 h后生長速度減緩，到14 h時達到生長高峰。F1菌株處于穩(wěn)定生長期的時間為培養(yǎng)后14～18 h。取處于穩(wěn)定生長期的細菌制備成菌懸液母液，進行下一步氟環(huán)唑降解試驗。

2.4?菌株F1對氟環(huán)唑的降解特性及其生長規(guī)律

從圖3可以看出，在以20 mg/L氟環(huán)唑為單一碳源的無機鹽液體培養(yǎng)基中，菌株F1的生長繁殖均以氟環(huán)唑為唯一碳源和能源，菌株在培養(yǎng)0～4 d內(nèi)逐步生長繁殖，同時氟環(huán)唑被快速代謝;在培養(yǎng)4 d 后因氟環(huán)唑含量降低，菌株生長進入衰退期（數(shù)量減少），氟環(huán)唑降解速率降低。在培養(yǎng)4 d時菌株F1數(shù)量達到最大值，其對氟環(huán)唑的降解率達75.3%;至培養(yǎng)6 d時，氟環(huán)唑的殘留量為1.92 mg/L，降解率達到90.4%，而在未接菌的處理中，氟環(huán)唑的自降解率僅為12.8%，表明接菌處理組培養(yǎng)基中氟環(huán)唑濃度的下降主要是由于菌株F1的作用。

2.5?菌株F1對氟環(huán)唑降解條件的優(yōu)化

2.5.1?溫度和初始pH值對菌株F1降解氟環(huán)唑的影響?從圖4可以看出，在pH值為6.0～8.0范圍內(nèi)，菌株F1對氟環(huán)唑的降解效率較高，最適初始pH值為7.0，pH值過高或者過低均會影響菌株的生長及對氟環(huán)唑的降解率。在相同pH值、不同溫度（25～35 ℃）條件下，菌株F1在25 ℃下生長較慢，對氟環(huán)唑的降解能力也最小;在30 ℃ 下菌株F1對氟環(huán)唑降解效率最高，培養(yǎng)6 d后氟環(huán)唑降解率達90.1%。

2.5.2?接菌量對菌株F1降解氟環(huán)唑的影響?從圖5可以看出，在底物氟環(huán)唑濃度均是20 mg/L的無機鹽液體培養(yǎng)基中，隨著初始接菌量的逐漸增加，菌株F1對氟環(huán)唑的降解效率明顯提高。接菌量（即無機鹽培養(yǎng)基的D600 nm）在0.05～0.50范圍內(nèi)時，培養(yǎng)6 d后菌株F1對氟環(huán)唑的降解率為22.0%～92.1%;其中當接菌量為0.05時，菌株F1的適應期延長，氟環(huán)唑降解緩慢;當接菌量分別為0.10、0.20時，菌株F1在培養(yǎng)4 d內(nèi)快速降解氟環(huán)唑，隨后降解速率變緩;而當接菌量為0.50時，菌株F1在培養(yǎng)2 d內(nèi)快速降解氟環(huán)唑，之后降解速率變慢。

2.5.3?氟環(huán)唑底物濃度對菌株F1降解氟環(huán)唑的影響?從圖6可以看出，在菌株F1接菌量為0.10、底物氟環(huán)唑的質(zhì)量濃度為5～50 mg/L時，培養(yǎng)6 d后，隨著初始氟環(huán)唑濃度的增加，降解率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當?shù)孜餄舛葹?0 mg/L時，推測由于底物濃度較大，菌株F1適應時期較長，導致培養(yǎng)6 d后氟環(huán)唑的降解率僅為38%;當?shù)孜餄舛鹊陀诨虻扔?0 mg/L時，菌株F1快速降解氟環(huán)唑，培養(yǎng)6 d后降解率均高于80%，表明該菌株對濃度低于或等于20 mg/L的氟環(huán)唑有較高的降解效果。

3?結(jié)論與討論

本研究在農(nóng)藥廠區(qū)污染土壤中采樣，經(jīng)過以氟環(huán)唑為唯一碳源的梯度馴化、分離純化等步驟，得到1株對氟環(huán)唑降解性能較好的菌株F1。經(jīng)過16S rRNA同源性比較分析，初步鑒定該菌株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），其親緣關(guān)系與昆明假單胞菌Pseudomonas kunmingensis最為接近。目前已報道的三唑類（戊唑醇[13]、丙環(huán)唑[17]、多效唑[24]）農(nóng)藥降解菌大多屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。假單胞菌屬細菌是從污染物中分離出的常見菌株，且大部分種屬對人類危害較小，有望應用于三唑類農(nóng)藥污染環(huán)境的微生物修復。

本研究表明，菌株F1降解氟環(huán)唑的最佳環(huán)境條件是pH值為6.0～8.0，溫度為30 ℃。細菌都具有一定的最適pH值和溫度生長范圍，其中溫度通過控制微生物的酶促反應速率來影響降解菌的生長，進而影響降解菌對農(nóng)藥的降解速率[22]。當氟環(huán)唑初始濃度為20 mg/L，接菌量（D600 nm）為0.1，pH值為7.0，溫度為30 ℃時，培養(yǎng)6 d后，氟環(huán)唑降解率達90.4%。除以上影響因素外，能源物質(zhì)的添加也可能影響微生物對農(nóng)藥的降解效率。Sarkar等研究表明，葡萄糖作為碳源物質(zhì)或硝態(tài)氮作為氮源物質(zhì)的加入均能促進微生物對土壤中三唑類殺菌劑的降解作用[17]。在氟環(huán)唑的降解過程中是否具有類似的規(guī)律，需要進一步研究。

菌株F1是1株降解氟環(huán)唑功效良好的降解菌，對主要影響因素適應性良好，但還需進一步研究該菌株介導的氟環(huán)唑代謝途徑及降解氟環(huán)唑過程中起關(guān)鍵作用的酶或控制基因等。另外，該菌株對其他三唑類農(nóng)藥的降解效果如何還需要進一步研究。目前，國內(nèi)外對氟環(huán)唑的生物降解研究尚無報道，本研究為三唑類農(nóng)藥氟環(huán)唑的生物降解提供了微生物資源。該降解菌在已被氟環(huán)唑污染的化工廢水及農(nóng)田環(huán)境的生物修復中可能具有良好的應用前景。

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