崔銀 李明 杜道林

摘要：鄰苯二甲酸酯（PAEs）類(lèi)化合物是一種被廣泛使用的環(huán)境激素類(lèi)塑化劑，其對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康的危害已經(jīng)引發(fā)多方關(guān)注，該類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)，特別是簡(jiǎn)便快速檢測(cè)對(duì)于保障環(huán)境食品安全及消費(fèi)者健康具有重要意義。目前，已有一系列免疫快速檢測(cè)技術(shù)以其簡(jiǎn)單快速、低成本、高靈敏、高特異性、高通量的優(yōu)勢(shì)而被應(yīng)用于PAEs檢測(cè)，可以彌補(bǔ)色譜檢測(cè)技術(shù)設(shè)備昂貴、操作繁瑣、需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員、難以實(shí)現(xiàn)大量樣品篩選目標(biāo)等不足。本文介紹了PAEs抗體及其免疫快速檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，并進(jìn)行評(píng)價(jià)和展望，以期為PAEs快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供指導(dǎo)和幫助。

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸酯;塑化劑;免疫檢測(cè);研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào)： X132;TS207文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）04-0033-08

收稿日期：2019-01-09

基金項(xiàng)目：中國(guó)博士后基金（編號(hào)：2016M601745）;江蘇大學(xué)高級(jí)人才啟動(dòng)基金（編號(hào)：16JDG035）。

作者簡(jiǎn)介：崔?銀（1994—），女，江蘇鎮(zhèn)江人，碩士研究生，主要從事有毒有害物質(zhì)的快速分析研究。Tel：（0511）88790955;E-mail：candyminicy@163.com。

通信作者：杜道林，博士，教授，主要從事環(huán)境污染物的生態(tài)效應(yīng)和毒理研究。Tel：（0511）88790955;E-mail：ddl@ujs.edu.cn。

鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，簡(jiǎn)稱(chēng)PAEs，別稱(chēng)酞酸酯）類(lèi)化合物是廣泛存在的一類(lèi)環(huán)境激素類(lèi)塑化劑，其作為增塑劑、軟化劑、載體及添加劑，被廣泛用于塑料、汽車(chē)、潤(rùn)滑劑、化妝品、服裝、農(nóng)藥等行業(yè)[1-4]。PAEs具有很強(qiáng)的生物富集性和抗降解性，不僅對(duì)人體生殖、發(fā)育有很大影響，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)也有較大危害，此外還有致癌風(fēng)險(xiǎn)和環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[5-8]。隨著長(zhǎng)期使用和暴露，PAEs在環(huán)境介質(zhì)中釋放和進(jìn)入食物供應(yīng)鏈，導(dǎo)致其在大氣、水體、土壤和食品中均有不同程度的檢出，對(duì)環(huán)境和人體有極大的風(fēng)險(xiǎn)[9-11]。

2011年“中國(guó)臺(tái)灣塑化劑風(fēng)波”和2012年“大陸白酒塑化劑事件”使PAEs為廣大消費(fèi)者熟知并引起一定程度的恐慌[12-13]。近年來(lái)，PAEs的環(huán)境食品污染和毒理學(xué)研究已經(jīng)受到廣泛關(guān)注并成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。PAEs種類(lèi)繁多，其20余種常見(jiàn)品種及其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表1，最常見(jiàn)的是DBP、DEHP，其中DEHP已經(jīng)被美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局（Environmental Protection Agency，簡(jiǎn)稱(chēng)USEPA）列為2B類(lèi)致癌物[14]。許多國(guó)家已經(jīng)將多種PAEs確定為環(huán)境優(yōu)先控制的污染物，并制定限量或禁用標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)不允許在食品接觸材料中添加DBP、DIBP和DEHP，要求兒童玩具或兒童護(hù)理用品中6種PAEs（DEHP、DBP、BBP、DINP、DIDP、DnOP）的總含量不得超過(guò)0.1%[15]。歐盟指令2008/105/EC規(guī)定，地表水中DEHP的限值為1.3 μg/L。此外，歐盟不允許在食品接觸材料中添加DIBP，允許DBP、DEHP在非油脂食品接觸材料中使用，遷移限量為0.3 mg/kg[16]。原中國(guó)衛(wèi)生部規(guī)定（衛(wèi)辦監(jiān)督函[2011]551號(hào)），食品及食品添加劑中DBP、DEH、DINP的最大殘留量分別為0.3、1.5、9.0 mg/kg。GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中水質(zhì)參考指標(biāo)及限值規(guī)定，DEP的限值為0.3 mg/L，DBP的限值為0.003 mg/L，水質(zhì)非常規(guī)指標(biāo)及限值規(guī)定，DEHP的限值為0.008 mg/L[17]。

關(guān)于PAEs檢測(cè)方法的報(bào)道以氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）等色譜檢測(cè)技術(shù)和一系列免疫快速檢測(cè)技術(shù)為主。加強(qiáng)PAEs檢測(cè)技術(shù)，特別是高靈敏、簡(jiǎn)便快速、高通量篩選、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法的應(yīng)用，對(duì)于保障環(huán)境生態(tài)安全和食品消費(fèi)安全尤為重要。本文重點(diǎn)闡述國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注的PAEs免疫快速檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，以期為PAEs快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供研究思路和方向。

免疫快速檢測(cè)方法的靈敏度和特異性與抗體的質(zhì)量和分析方法的類(lèi)型密切相關(guān)。半抗原、人工抗原、抗體、標(biāo)記物是免疫分析的基本要素，其中抗體是免疫分析的核心試劑，半抗原、抗原的合成是小分子化合物抗體制備和分析方法建立的關(guān)鍵步驟[18]。研究表明，半抗原的結(jié)構(gòu)、連接臂的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)及其活性基團(tuán)的連接位點(diǎn)、抗體獲得途徑對(duì)抗體的特異性識(shí)別和靈敏度具有不同程度的影響。

1.1?抗原

對(duì)PAEs類(lèi)塑化劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式進(jìn)行分析可知，該類(lèi)化合物擁有1個(gè)相同剛性平面芳烴-鄰苯二甲酸酯基團(tuán)，區(qū)別在于2個(gè)可塑的非線性脂肪側(cè)鏈基團(tuán)。因此，PAEs半抗原化學(xué)合成改造也具有相似的途徑。分析當(dāng)前的報(bào)道可知，目前主要采用3種策略合成PAEs半抗原。第1種策略如Ius等以4- 羥基鄰苯二甲酸、甲醇為原料，合成4-羥基DMP后，與羧甲基羥胺半鹽酸鹽進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，獲得帶有—COOH間隔臂的DMP目標(biāo)半抗原[19]。第2種策略如Yanaihara等以4-硝基鄰苯二甲酸和甲醇為原料，從DMP分子苯環(huán)的酯基間位引入—NO2，合成4-硝基DMP，酯化反應(yīng)和還原反應(yīng)后獲得4-氨基DMP半抗原[20]。第3種策略如Tang等在DMP的苯環(huán)酯基間位引入—NH2后，通過(guò)縮合反應(yīng)與羧甲基羥胺半鹽酸鹽、丁二酸酐分別合成了2種長(zhǎng)度—COOH間隔臂的DMP半抗原[21]。在PAEs免疫分析研究中，研究人員主要采用上述第2種策略，即從PAEs分子苯環(huán)酯基間位引入—NH2活性基團(tuán)的策略化學(xué)合成半抗原。在隨后的研究中，研究人員同樣采用第2種策略分別合成DCHP、DMP、DPrP、DIBP、DEP和DBP的4-氨基半抗原[22-31]。

在PAEs半抗原合成的基礎(chǔ)上，研究人員通常采用重氮法將—NH2化半抗原與牛血清白蛋白（BSA）或雞卵清蛋白（OVA）分別偶聯(lián)獲得免疫抗原和包被抗原，采用碳二亞胺法將—COOH半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備人工抗原。

1.2?抗體

研究人員用制備獲得的人工免疫抗原免疫新西蘭大白兔，從兔血清中分別純化獲得DCHP多克隆抗體、DPrP多克隆抗體、DIBP多克隆抗體、DEP多克隆抗體、DBP多克隆抗體和DMP多克隆抗體[22，24-26，28，30，32-33]。Wei等通過(guò)小白鼠免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選和抗體生產(chǎn)等流程，獲得DBP單克隆抗體[29，31]。Ius等用連接臂較長(zhǎng)的DMP半抗原偶聯(lián)蛋白制備抗原后免疫新西蘭大白兔，獲得的多克隆抗體對(duì)DMP和其他多種PAEs均表現(xiàn)出較高程度的親和力，可以作為廣譜抗體對(duì)多種PAEs塑化劑進(jìn)行多組分檢測(cè)，表明較長(zhǎng)的間隔臂有利于制備廣譜PAEs抗體[19，21]。

2?PAEs免疫的快速分析檢測(cè)

根據(jù)檢測(cè)模式、載體和標(biāo)記物的不同，多種免疫快速檢測(cè)技術(shù)被開(kāi)發(fā)用于PAEs的分析檢測(cè)。研究人員將各種免疫分析模式和標(biāo)記物質(zhì)用于PAEs的快速分析檢測(cè)，開(kāi)發(fā)獲得一系列免疫分析方法，并對(duì)方法的性能開(kāi)展詳細(xì)的評(píng)估，使PAEs分析檢測(cè)技術(shù)得到極大的豐富，可以為PAEs安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控儲(chǔ)備關(guān)鍵技術(shù)和重要生化材料。

2.1?微孔免疫分析檢測(cè)

2.1.1?酶免疫分析檢測(cè)?作為免疫分析方法的經(jīng)典方法和基礎(chǔ)方法，酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ELISA）被廣泛用于PAEs分析方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用中，其中針對(duì)DMP、DBP的ELISA研究最多，也最深入。Zhang等將DMP多克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)獲得酶標(biāo)記抗體，建立直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（dc-ELISA）檢測(cè)DMP，線性范圍為0.1～2 000 ng/mL，檢測(cè)限為0.09 ng/mL，與其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)很低（<8.8%）[23]。Sun等在將DMP抗體生物化的基礎(chǔ)上，建立生物素-鏈霉親和素放大ELISA方法檢測(cè)DMP，檢測(cè)范圍為24～6 027 ng/mL，IC50為356 ng/mL，檢測(cè)限（LOD）為8.2 ng/mL，特異性較高，與類(lèi)似物的交叉率低于10%，在檢測(cè)實(shí)際牛奶和奶制樣品中表現(xiàn)出很高的準(zhǔn)確度和精密度，并用GC-MS驗(yàn)證其檢測(cè)結(jié)果[27]。Wei等采用聚乙烯微孔表面羧基化和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）偶聯(lián)反應(yīng)將半抗原4-氨基DBP直接固定，建立基于單克隆抗體DBP的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（ic-ELISA）方法，相比于將包被抗原固定在微孔表面（IC50為106 ng/mL），這種直接固定半抗原的策略使靈敏度得到很大提高（IC50為14.6 ng/mL）。在特異性方面，除了對(duì)BBP的交叉率為21.3%外，其余的均低于7.98%，在食品樣品檢測(cè)中也表現(xiàn)出良好的準(zhǔn)確性和精確性，并通過(guò)GC-MS驗(yàn)證[29]。萬(wàn)宇平等建立白酒中DBP檢測(cè)的ELISA方法，并研制成功試劑盒應(yīng)用于白酒樣品的檢測(cè)，方法檢測(cè)IC50為86.5 ng/mL，檢測(cè)范圍為0～1 620 ng/mL，在特異性方面對(duì)DIBP有45%的交叉率，對(duì)其他的交叉率均較低[34]。Xu等建立ic-ELISA檢測(cè)白酒中的DBP，檢測(cè)限達(dá)到64.5 ng/mL，檢測(cè)范圍為64.5～1 606.2 ng/mL，并與GC-MS進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其相關(guān)系數(shù)為0.928[30]。Sun等將DBP多克隆抗體生物素化，建立生物素-親和素系統(tǒng)放大的ELISA檢測(cè)方法，檢測(cè)限達(dá)到5 pg/mL，IC50為0.36 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.45～7.06 ng/mL，具有很高的特異性（<3.8%），在飲料和應(yīng)用水檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)0.45～7.06 ng/mL的DBP被檢出[35]。Zhou等設(shè)計(jì)合成DBP半抗原和人工抗原，制備獲得單克隆抗體，建立的ELISA的最低檢測(cè)限為0.06 ng/mL，IC50為7.34 ng/mL，具有很高的特異性（<1.25%），該方法比多克隆抗體提高了1 000 倍的靈敏度，比其他報(bào)道的單抗靈敏度高5倍，并被應(yīng)用于人類(lèi)尿液中DBP含量的分析檢測(cè)。結(jié)果表明，在1 246份尿液樣本中，有72.87%的檢出率，濃度為0～42.98 ng/mL，年輕人體內(nèi)的濃度低于年長(zhǎng)者體內(nèi)的濃度[31]。

關(guān)于其他幾種PAEs的ELISA報(bào)道主要有DPrP、DEP、DEHP。Zhang等將DPrP包被抗原和HRP偶聯(lián)作為標(biāo)記物，建立直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光ELISA（CL-ELISA）用于水樣、牛奶樣品中DPrP的檢測(cè)，IC50為0.19 ng/mL，LOD為0.03 ng/mL，交叉反應(yīng)率低于9%，樣品未經(jīng)凈化處理和濃縮，表現(xiàn)出很小的基質(zhì)影響，很好地展示出該免疫分析方法的簡(jiǎn)便性[24]。Zhang等建立DEP的ic-ELISA，檢 測(cè) 范 圍為0.005～18.6 ng/mL，檢測(cè)限為0.004 9 ng/mL，與其他結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率很低（<9%），在果汁、奶茶、純奶和酸奶樣品中的添加回收率在91.1%～109.3%之間[26]。Zhang等制備獲得DEHP多克隆抗體并與HRP偶聯(lián)作為檢測(cè)探針建立了dc-ELISA方法，最低檢測(cè)限為0.004 2 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.001～1 000 ng/mL，與結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率低于1%，并且被成功應(yīng)用于嬰兒用品中DEHP的檢測(cè)[36]。

2.1.2?熒光免疫分析檢測(cè)?熒光免疫分析方法（FIA）以熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物，熒光信號(hào)賦予該分析方法更高的特異性和更高的光量子效率，使檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度獲得進(jìn)一步提高。Zhang等建立了基于多克隆抗體的DBP間接競(jìng)爭(zhēng)FIA，方法檢測(cè)限為0.02 ng/mL，IC50為10.53 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.1～300 ng/mL，與其他PAEs塑化劑的交叉率低于9.6%，并對(duì)稻田水、河水、自來(lái)水、礦泉水進(jìn)行了添加檢測(cè)[28]。Zhang等將異硫氰酸熒光素（FITC）和羊抗兔二抗偶聯(lián)制備熒光標(biāo)記二抗，結(jié)合制備的DCHP兔源多克隆抗體建立了FIA，DCHP檢測(cè)范圍為0.1～200 ng/mL，檢測(cè)限為0.05 ng/mL，特異性較高[交叉反應(yīng)率（CR）<8.7%]，在多種水樣檢測(cè)中均表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性[22]。Zhang等在用dc-ELISA檢測(cè)DMP的研究中，還將DMP多克隆抗體和FITC偶聯(lián)制備熒光標(biāo)記抗體，建立了DMP直接競(jìng)爭(zhēng)FIA（dc-FIA），線性范圍為0.05～30 ng/mL，檢測(cè)限為0.02 ng/mL，在使用同種抗原和抗體的情況下，靈敏度較dc-ELISA提高了4倍以上，并被應(yīng)用于水樣的檢測(cè)[23]。Zeng等在制備特異性DBP單克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立FIA分析方法對(duì)DBP在小鼠體內(nèi)的分布進(jìn)行了檢測(cè)，并建立了ic-ELISA檢測(cè)小鼠不同臟器內(nèi)DBP的累積情況，將免疫分析技術(shù)很好地應(yīng)用到生物活體檢測(cè)方面[37]。Cui等制備獲得DIBP多克隆抗體和羊抗兔-FITC，建立間接競(jìng)爭(zhēng)FIA方法用于食用油樣品中DIBP的檢測(cè)，方法檢測(cè)限達(dá)到5.82 ng/mL，IC50為61.2 ng/mL，檢測(cè)范圍為10.47～357.06 ng/mL，方法具有很高的特異性（CR<1.5%）[25]。

2.1.3?均相免疫分析檢測(cè)?免疫分析檢測(cè)從非均相模式轉(zhuǎn)變?yōu)榫嗄Ｊ綄⑹狗治鰴z測(cè)步驟更加簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間明顯縮短，偏振檢測(cè)技術(shù)、磁分離技術(shù)的應(yīng)用可以實(shí)現(xiàn)均相模式的檢測(cè)，進(jìn)而簡(jiǎn)化檢測(cè)程序和提高檢測(cè)效率。Tian等用FITC標(biāo)記DEP抗體，開(kāi)發(fā)了DEP的熒光偏振免疫分析方法（FPIA），檢測(cè)限為6.0 ng/mL，IC50為40.4 ng/mL，線性范圍為10～200 ng/mL，瓶裝水樣品的檢測(cè)限為1.46 ng/mL，果汁樣品的檢測(cè)限為340 ng/mL，藥物膠囊樣品的檢測(cè)限為50 000 ng/g，3種樣品的回收率為85.9%～114.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%～17.0%[38]。筆者所在研究室的Zhu等將DEP多克隆抗體通過(guò)羊抗兔二抗定向負(fù)載在磁珠表面，包被抗原與銪離子螯合劑偶聯(lián)作為標(biāo)記物，建立了1種磁珠均相直接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析方法（TRFIA），方法的檢測(cè)限達(dá)到5.92 pg/mL，并且被應(yīng)用于鎮(zhèn)江市水環(huán)境中的DEP分布檢測(cè)，實(shí)際檢測(cè)到的DEP濃度為2.98～306.19 ng/mL[39]。這2種PAEs免疫分析技術(shù)將均相模式、磁分離的高效性和熒光信號(hào)的高靈敏度結(jié)合，使檢測(cè)能力顯著提升，可為其他物質(zhì)高靈敏、均相、高效痕量檢測(cè)提供參考。

2.2?超靈敏PCR免疫分析檢測(cè)

隨著人類(lèi)對(duì)環(huán)境和食品安全意識(shí)的提高，對(duì)有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)也提出了更高要求。在此情形下，能夠準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)樣品中超低含量有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)被極大地需求和歡迎。Sun等報(bào)道了基于金納米顆粒的實(shí)時(shí)定量-免疫PCR分析技術(shù)用于DEP的超高靈敏度檢測(cè)，檢測(cè)范圍為4 fg/mL～40 pg/mL，檢測(cè)限為1.06 fg/mL，特異性很高（CR<5%），進(jìn)而被用于食品中DEP的痕量檢測(cè)[27]。該報(bào)道將免疫分析和超靈敏PCR技術(shù)結(jié)合，使得DEP的檢測(cè)靈敏度得到極大提高（理論提高3個(gè)數(shù)量級(jí)以上），是當(dāng)前靈敏度最高的標(biāo)記檢測(cè)策略，對(duì)于其他有毒有害物質(zhì)的超痕量檢測(cè)發(fā)展具有重要指導(dǎo)價(jià)值。

2.3?多組分免疫分析檢測(cè)

隨著PAEs塑化劑在環(huán)境中長(zhǎng)期暴露，環(huán)境樣品中同時(shí)存在多種PAEs的可能性大大增強(qiáng)，當(dāng)前主要是針對(duì)單一組分的檢測(cè)方法難以滿足多組分同時(shí)檢測(cè)的需求。為了擴(kuò)大免疫分析的檢測(cè)范圍，研究人員將研究目標(biāo)投向多種分析物分析，也叫作寬譜特異性分析、多組分分析或?qū)掃x擇性分析[40]。區(qū)別于單組分分析的是，多組分分析可以對(duì)多種分析物進(jìn)行總量的檢測(cè)或分別進(jìn)行定量檢測(cè)，在初篩或初檢中是一種很好的方法[41]。Ius等將多克隆抗體生物素化，將鏈霉親和素與鑭系絡(luò)合物的雙向螯合劑（BCPDA）偶聯(lián)作為標(biāo)記物，建立了廣譜PAEs的TRFIA，與DMP、DEP、DBP、BBP、DNOP的交叉率分別為100%、110%、106%、104%、97%，與其他類(lèi)似物的交叉率低于3.5%，可用于這5種PAEs塑化劑的同時(shí)分析檢測(cè)，且交叉率相近，檢測(cè)范圍為0.5 pmol/mL～2 nmol/mL[19]。Tang等通過(guò)合成PAEs通用半抗原，免疫制備獲得多克隆抗體，能夠識(shí)別多種PAEs（包括DMP、DEP、DBP、DNOP、BBP、DEHP、DCHP），交叉反應(yīng)率在63.9%～103.6%之間，IC50在17.12～102.57 ng/mL之間，最低檢測(cè)限在0.012～0.042 ng/mL之間，檢測(cè)到溫室土壤樣品中的PAEs濃度為1 260～3 580 ng/g，且使用10年的溫室土壤比使用5年的能夠檢測(cè)出更高PAEs濃度[21]。PAEs多組分免疫分析檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)，為樣品中多種PAEs同時(shí)存在提供了便捷的篩選手段，對(duì)于簡(jiǎn)化初篩程序、提高檢測(cè)效率具有重要價(jià)值。

2.4?免疫親和層析分析檢測(cè)

免疫親和層析分析技術(shù)是通過(guò)層析技術(shù)將免疫分析技術(shù)展示出來(lái)，便于更直觀、更便捷地分析待測(cè)物質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)定性和半定量檢測(cè)。關(guān)于PAEs免疫分析主要是前文提到的方法，沒(méi)有采用免疫親和層析技術(shù)對(duì)其進(jìn)行研究的報(bào)道，但在實(shí)際應(yīng)用中，研究人員采用免疫親和層析技術(shù)開(kāi)發(fā)PAEs檢測(cè)卡，也有多家生化試劑公司生產(chǎn)和銷(xiāo)售PAEs類(lèi)塑化劑檢測(cè)卡。

3?PAEs免疫檢測(cè)裝置及應(yīng)用

PAEs免疫檢測(cè)裝置主要是免疫檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)卡，這2種裝置分別以ELISA、膠體金免疫親和層析為核心技術(shù)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行產(chǎn)品化，形成可用于生產(chǎn)實(shí)際中PAEs污染檢測(cè)的產(chǎn)品。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外已有多個(gè)生化試劑公司生產(chǎn)和銷(xiāo)售PAEs類(lèi)試劑盒和檢測(cè)卡。如國(guó)內(nèi)的北京勤邦生物技術(shù)有限公司可以提供用于白酒樣本中DBP、DIBP檢測(cè)的ELISA試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒和檢測(cè)卡，其中ELISA試劑盒的靈敏度為10 ng/mL，樣品檢測(cè)限為100 ng/mL，檢測(cè)回收率穩(wěn)定，變異系數(shù)小于10%。北京普贊生物技術(shù)有限公司的DBP檢測(cè)試劑盒的靈敏度達(dá)30 ng/mL，樣品回收率為（95±20）%，變異系數(shù)、交叉率均低于10%，可用于定性、定量檢測(cè)飲用水、飲料、酒等樣品中的DBP。美國(guó)REAGEN公司的DBP試劑盒檢測(cè)靈敏度為50 ng/mL，回收率為70%～130%。美國(guó)GTX公司的DEHP試劑盒檢測(cè)限達(dá)100 ng/mL，適用于肌肉和肝臟組織、尿樣、血清、飼料中DEHP的檢測(cè)。在檢測(cè)裝置的應(yīng)用方面，也有相關(guān)報(bào)道，曹必溥等將北京普贊生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的塑化劑ELISA檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于紅酒中DBP的快速檢測(cè)，并用GC-MS法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明，試劑盒能夠滿足對(duì)DBP的初篩要求，且樣品前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、特異性高[42]。PAEs檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)卡的生產(chǎn)和供應(yīng)，可為環(huán)境和食品安全檢測(cè)提供便捷快速的保障。

4?PAEs免疫快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)

PAEs免疫快速檢測(cè)技術(shù)作為一種簡(jiǎn)便快速的技術(shù)手段，在前期抗原抗體制備和免疫分析方法開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)上形成常見(jiàn)PAEs塑化劑檢測(cè)的技術(shù)儲(chǔ)備，并且重點(diǎn)部分種類(lèi)已經(jīng)有檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)卡產(chǎn)品儲(chǔ)備和商品化。這一系列PAEs免疫分析技術(shù)的開(kāi)發(fā)可以為儀器分析檢測(cè)提供替代和補(bǔ)充方法。由于這些免疫分析技術(shù)本身性能的差異和獨(dú)特優(yōu)勢(shì)能夠滿足不同檢測(cè)場(chǎng)所和檢測(cè)需求，消費(fèi)者在實(shí)際應(yīng)用時(shí)可以靈活選擇。然而，目前尚未有關(guān)于多種PAEs免疫快速分析方面的研究報(bào)道，有必要將此不足補(bǔ)充完善作為重要技術(shù)儲(chǔ)備。此外，鑒于環(huán)境和食品中PAEs廣泛存在、暴露風(fēng)險(xiǎn)大、超痕量水平樣品難以準(zhǔn)確檢測(cè)，對(duì)免疫分析檢測(cè)的質(zhì)量要求也更加嚴(yán)格。免疫分析檢測(cè)能否獲得更高的靈敏度和特異性，以及更加簡(jiǎn)便快捷的操作，作為核心試劑的抗體起著關(guān)鍵作用。然而，用傳統(tǒng)經(jīng)典方法從動(dòng)物體內(nèi)獲得的抗體，其質(zhì)量和性狀難以改變和提高。因此，加強(qiáng)PAEs抗體和免疫分析方法的研究，特別是應(yīng)用新技術(shù)新方法制備高靈敏度、高特異性、多功能的抗體，對(duì)于推動(dòng)免疫快速分析技術(shù)更多更廣地應(yīng)用于PAEs分析檢測(cè)中具有重要意義。當(dāng)前的免疫快速檢測(cè)裝置主要是試劑盒和檢測(cè)卡，前期研究中靈敏度更為顯著的熒光免疫分析和PCR免疫分析技術(shù)，以及更加便捷高效的均相免疫分析技術(shù)應(yīng)該更好地將其產(chǎn)品化并加以推廣應(yīng)用，以便進(jìn)一步完善免疫快速檢測(cè)體系，更好地保護(hù)環(huán)境和食品安全，保障消費(fèi)者健康。

參考文獻(xiàn)：

[1]曹九超，金青哲. 食用油中塑化劑的污染途徑及分析方法的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)油脂，2013，38（5）：1-5.

[2]褚?玥，梁德沛，孫遠(yuǎn)明，等. 食品中16種鄰苯二甲酸酯類(lèi)塑化劑的GC-MS檢測(cè)方法研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2014，29（2）：94-99.

[3]Sedha S，Gautam A K，Verma Y，et al. Determination of in vivo estrogenic potential of di-isobutyl phthalate （DIBP） and di-isononyl phthalate （DINP） in rats[J]. Environmental Science and Pollution Research，2015，22（22）：18197-18202.

[4]李曉貝，張?騰，周昌艷，等. 四種蔬菜對(duì)DBP和DEHP及其代謝物的吸收累積研究[J]. 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2018，35（1）：87-94.

[5]Heudorf U，Mersch-Sundermann V，Angerer J. Phthalates：toxicology and exposure[J]. International Journal of Hygiene and Environmental Health，2007，210（5）：623-634.

[6]劉?慶，楊紅軍，史衍璽，等. 環(huán)境中鄰苯二甲酸酯類(lèi)（PAEs）污染物研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，20（8）：968-975.

[7]左?蓓，鄒柯婷，李永波，等. 食用油中鄰苯二甲酸酯類(lèi)塑化劑檢測(cè)及遷移研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代食品，2018，4（7）：7-13.

[8]嚴(yán)煌倩，李?勇，翟麗菲，等. 氣相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS法快速檢測(cè)青椒中15種鄰苯二甲酸酯[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，34（2）：459-465.

[9]Rudel R，Camann D E，Spengler J D，et al. Phthalates，alkylphenols，pesticides，polybrominated diphenyl ethers，and other endocrine-disrupting compounds in indoor air and dust[J]. Environmental Science & Technology，2003，37（20）：4543-4553.

[10]Yao J R，Xu H，Lv L L，et al. A novel liquid-phase microextraction method combined with high performance liquid chromatography for analysis of phthalate esters in landfill leachates[J]. Analytica Chimica Acta，2008，616（1）：42-48.

[11]Komesli O T，Bakirdere S，Bayren C，et al. Simultaneous determination of selected endocrine disrupter compounds in wastewater samples in ultra trace levels using HPLC-ES-MS/MS[J]. Environmental Monitoring and Assessment，2012，184（8）：5215-5224.

[12]Feng J J，Sun M，Bu Y N，et al. Nanostructured copper-coated solid-phase microextraction fiber for gas chromatographic analysis of dibutyl phthalate and diethylhexyl phthalate environmental estrogens[J]. Journal of Separation Science，2015，38（1）：128-133.

[13]陳滿英，鄒旭鳳，劉杏宜，等. 食品及食品包裝材料中塑化劑的檢測(cè)研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017，8（4）：1305-1311.

[14]徐敦明，鄭向華，楊黎忠，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飲料中鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯和鄰苯二甲酸二異壬酯[J]. 分析化學(xué)，2012，40（2）：304-308.

[15]陳山丹，費(fèi)桂琴. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定玩具產(chǎn)品中23種增塑劑[J]. 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化，2017，9（18）：22-24.

[16]李曉敏，王?景，張慶合，等. 食品中鄰苯二甲酸酯類(lèi)化合物的分析方法研究進(jìn)展[J]. 色譜，2015，33（11）：1147-1154.

[17]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). 生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：GB 5749—2006[S]. 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2006.

[18]宋?娟，王榕妹，王悅秋，等. 半抗原的設(shè)計(jì)、修飾及人工抗原的制備[J]. 分析化學(xué)，2010，38（8）：1211-1218.

[19]Ius A，Bacigalupo M A，Meroni G，et al. Development of a timeresolved fluoroimmunoassay for phthalate esters in water[J]. Fresenius Journal of Analytical Chemistry，1993，345（8）：589-591.

[20]Yanaihara N，Kato I，Nagasawa S，et al. Immunoassay for phthalic acid esters：6399318[P]. 2002-10-15.

[21]Tang M，Wei J Y，Du H H，et al. Synthesis of an artificial antigen and preparation of a polyclonal antibody for the sensitive determination of phthalate esters by enzyme-linked immunoassay[J]. Analytical Methods，2015，7（8）：3402-3410.

[22]Zhang M C，Sheng Y L. An indirect competitive fluorescence immunoassay for determination of dicyclohexyl phthalate in water samples[J]. Journal of Fluorescence，2010，20（6）：1167-1173.

[23]Zhang M C，Liu B L，Cong Y，et al. Development of highly specific fluorescence immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay for detection of dimethyl phthalate in water samples[J]. Food and Agricultural Immunology，2011，22（4）：297-309.

[24]Zhang M C，Hu Y R，Liu S H，et al. Rapid monitoring of dipropyl phthalate in food samples using a chemiluminescent enzyme immunoassay[J]. Food Analytical Methods，2012，5（5）：1105-1113.

[25]Cui X P，Wu P P，Lai D，et al. Development of a highly specific fluorescence immunoassay for detection of diisobutyl phthalate in edible oil samples[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2015，63（42）：9372-9378.

[26]Zhang M C，Yu X N，Wang Y，et al. A highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay （ic-ELISA） by antigen coating for diethyl phthalate analysis in foods[J]. Food Analytical Methods，2013，6（4）：1223-1228.

[27]Sun R Y，Zhuang H S. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples[J]. Analytical Bioanalytical，2015，480：49-57.

[28]Zhang M C，Wang Q E，Zhuang H S. A novel competitive fluorescence immunoassay for the determination of dibutyl phthalate[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2006，386（5）：1401-1406.

[29]Wei C X，Ding S M，You H H，et al. An immunoassay for dibutyl phthalate based on direct hapten linkage to the polystyrene surface of microtiter plates[J]. PLoS ONE，2011，6（12）：e29196.

[30]Xu F，Wang W J，Jiang H Y，et al. Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of dibutyl phthalate in white wine，compared with GC-MS[J]. Food Analytical Methods，2014，7（8）：1619-1626.

[31]Zhou L F，Lei Y J，Zhang D，et al. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary[J]. Science of the Total Environment，2016，541：570-578.

[32]Sun R Y，Zhuang H S. An indirect competitive biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of dimethyl phthalate （DMP） in milk and milk products[J]. Journal of Environmental Science and Health（Part B，Pesticides，F(xiàn)ood Contaminants，and Agricultural Wastes），2015，50（4）：275-284.

[33]莊惠生，郎?慶，張明翠，等. 抗體包被熒光免疫法測(cè)定水中的鄰苯二甲酸二環(huán)己酯[J]. 分析化學(xué)，2006，34（特刊）：211-213.

[34]萬(wàn)宇平，陶光燦，李?勇，等. 鄰苯二甲酸二丁酯（塑化劑）ELISA檢測(cè)方法的研究[J]. 食品工業(yè)，2013，34（9）：194-196.

[35]Sun R Y，Zhuang H S. Biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of dibutyl phthalate in beverages and drinking water using a specific polyclonal antibody[J]. Food Analytical Methods，2015，8（8）：1990-1999.

[36]Zhang M C，Hong W T，Wu X Y，et al. A highly sensitive and direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of di-（2-ethylhexyl） phthalate （DEHP） in infant supplies[J]. Analytical Methods，2015，7：5441-5446.

[37]Zeng Q，Wei C X，Wu Y，et al. Approach to distribution and accumulation of dibutyl phthalate in ratsby immunoassay[J]. Food and Chemical Toxicology，2013，56：18-27.

[38]Tian X，Dong Y Q，Wang Y F，et al. Quantification of diethyl phthalate by a rapid and homogenous fluorescence polarization immunoassay[J]. Analytical Letters，2015，48（18）：2843-2855.

[39]Zhu F，Mao C M，Du D L. Time-resolved immunoassay based on magnetic particles for the detection of diethyl phthalate in environmental water samples[J]. Science of the Total Environment，2017，601/602：723-731.

[40]Xu Z L，Xie G M，Li Y X，et al. Production and characterization of abroad-specicity polyclonal antibody forO，O-diethyl organophosphorus pesticides and a quantitative structure-activity relationship study of antibody recognition[J]. Analytica Chimica Acta，2009，647（1）：90-96.

[41]Piao Y Z，Kim Y J，Kim Y A，et al. Development of ELISAs for the class-specific determination of organophosphorus pesticides[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（21）：10004-10013.

[42]曹必溥，曹?庸，苗建銀，等. ELISA試劑盒法與GC-MS法檢測(cè)紅酒中塑化劑的比較研究[J]. 食品與機(jī)械，2015，31（1）：82-85.