盧秀嫻，張思遠*， 梁昭平， 林舉攀，云驁，葉賀佳

(1.廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司，廣州，510300 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州，510642)

鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員之一，是一類無囊膜、二十面體對稱的單鏈環(huán)狀最小的DNA病毒[1]，該病毒目前還不能直接進行體外分離培養(yǎng)，主要侵害動物免疫系統(tǒng)并造成免疫抑制，各日齡、品種的鴨均易感[2]，臨床癥狀表現(xiàn)為羽毛紊亂、生長遲緩、體況消瘦等[3]，該病毒感染后容易導(dǎo)致其他禽類疾病的并發(fā)或繼發(fā)感染，從而給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。

DuCV是近年來新發(fā)現(xiàn)畜禽病毒之一，最早于2003年由德國學(xué)者Hatterman[4]從番鴨的法氏囊組織中研究發(fā)現(xiàn)；2008年傅光華等首次在我國大陸地區(qū)成功克隆了鴨圓環(huán)病毒的全基因序列[5]，此后，在國內(nèi)各地區(qū)鴨群中陸續(xù)檢測到DuCV的感染[6]，混合感染病例增多，近年來已經(jīng)在我國大部分地區(qū)廣泛流行。

為進一步了解鴨圓環(huán)病毒在我國部分地區(qū)的感染與流行情況，了解其分子生物學(xué)特性，通過對山東、河南、江蘇、安徽等地區(qū)30份鴨圓環(huán)病毒感染的陽性病料進行鴨圓環(huán)病毒的全基因組的克隆和序列測定，對毒株的核苷酸分子特點進行分析，以期了解國內(nèi)部分地區(qū) DuCV 的流行毒株的基因型及遺傳變異情況，為鴨圓環(huán)病毒感染的防控和診斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2019年1月至6月，從山東、河南、江蘇等省份發(fā)病鴨場采集疑似鴨圓環(huán)病毒感染的病料30份，其發(fā)病鴨出現(xiàn)羽毛脫落，生長遲緩等癥狀，剖檢可見肝臟腫大，脾腫大充血、有壞死灶等。采集肝、脾、等內(nèi)臟組織，-20℃保存，經(jīng)華南生物動物疫病診斷中心PCR檢測均為DuCV陽性樣品。

1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒(9781)、pMD19-T載體(6013)、DL2000 DNA Marker(3427A)購自TaKaRa公司、TransStart KD Plus DNA Poiymerase(AP301-11)、購自北京全式金公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP103)、核酸染料(KP103)為天根公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理及DNA的提取 將病料組織剪碎，在研缽研磨成糊狀，按1∶5-10的比例加入滅菌PBS，反復(fù)凍融三次，7000～8000 rpm/min離心10～15 min，取上清液用TaKaRa核酸抽提試劑盒抽提基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 參照 Genbank中登錄的鴨圓環(huán)病毒基因組序列，設(shè)計合成了2對擴增產(chǎn)物首尾相連且相互重疊的引物，用于鴨圓環(huán)病毒全基因組核苷酸的擴增，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成見表1。

表1 DuCV全基因組擴增引物序列

1.2.3 鴨圓環(huán)病毒基因組全長的PCR擴增與序列測定 以上提取的DNA為模板，用以上2對引物分別進行PCR 擴增，PCR程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共34個循環(huán)。擴增完成后，兩者PCR 產(chǎn)物取5 μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收，連接到 pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)培養(yǎng)篩選，挑取單個轉(zhuǎn)化菌落于LB培養(yǎng)液 (Amp+)過夜培養(yǎng)，PCR鑒定陽性克隆菌送至上海金唯智股份有限公司進行測序。測序結(jié)果用DNAStar，進行拼接分析。

1.2.4 DuCV全基因組序列分析 運用DNAStar和MEGA7.0將獲得的DuCV全基因序列，與GenBank參考株基因組序列比對，進行同源性比較和基因進化樹分析。本研究用于核酸序列分析參考的毒株(表2)。

表2 用于序列分析和比較的參考毒株信息

1.2.5 鴨圓環(huán)病毒Cap和Rep蛋白氨基酸序列分析 采用DNAMEND軟件預(yù)測和分析30株DuCV 的Cap蛋白抗原位點的分布情況，采用NetNG-Lyc1.0在線軟件和NetPhos 2.0軟件預(yù)測和分析Cap蛋白N-糖基化位點。

2 結(jié) 果

2.1 鴨圓環(huán)病毒全長基因組測序結(jié)果 測序結(jié)果通過應(yīng)用DNAStar軟件中的SeqMan對序列進行拼接，獲得30株DuCV的全基因序列。鴨病毒基因組為環(huán)形，基因組包含4個200 bp以上的ORF，即V1(49～927 bp)、C1(1157～1930 bp)、C2(1377～1739 bp)、C3(164～400 bp)，但大多數(shù)DuCV只有2個主要的閱讀框ORF V1和ORF C1，分別編碼與病毒復(fù)制有關(guān)的Rep蛋白和核衣殼蛋白Cap 蛋白，ORF C3為新發(fā)現(xiàn)的可編碼引起機體的淋己損傷及細胞潤亡的閱讀框。26株DuCV的全基因序列長為1993～1995 bp，4株DuCV的全基因序列僅有1988 bp，缺失了ORF C2、ORF C3。全基因組序列存在2個與滾環(huán)復(fù)制相關(guān)的保守區(qū)域，還存在可啟動滾環(huán)復(fù)制過程中酶促反應(yīng)的dNTP結(jié)合域。

2.2 鴨圓環(huán)病毒基因同源性分析 使用DNAStar軟件MegAlign對30株DuCV 基因核苷酸和氨基酸序列進行分析，毒株之間的核苷酸和氨基酸序列同源性為85.8%～99.9%，30株與其他國內(nèi)外不同時間的DuCV參考毒株的全基因組序列的同源性為 83%～99.3%，與2010年之后的DuCV參考毒株同源性較高，達90%以上；26株DuCV與MH25株和YS07株等中國大陸毒株的同源性最高，核苷酸序列同源性大于96%；4株DuCV與WF0802和TC1/2002等毒株的同源性較高，核苷酸同源性為90%～97.3%左右。將30株DuCV 全基因序列與圓環(huán)病毒科中其他動物圓環(huán)病毒基因組序列進行比對發(fā)現(xiàn)，從不同動物中分離得到的圓環(huán)病毒, 其同源性差異比較很大。與雞圓環(huán)病毒(雞貧血病病毒CIAV)同源性最低，僅為2.4 %，與鵝圓環(huán)病毒的同源性在65%左右，與鴿子、豬等圓環(huán)病毒的同源性則為22.5 %～ 28.2 %。

2.3 鴨圓環(huán)病毒基因組的遺傳進化樹分析 采用MEGA7.0軟件對獲得的30株DuCV 全基因序列與參考毒株序列繪制基因遺傳進化樹，按現(xiàn)行的DuCV分型方法，根據(jù)DuCV的Cap蛋白基因在某些區(qū)域氨基酸差異較大，并以1988bp作為分界點，DuCV分為1型、2型兩個基因型[7]，分別是以德國株為代表的 DuCV-1型和以臺灣株為代表的DuCV-2型。本試驗獲得的30株DuCV序列，其中26株屬于DuCV-1型，與YS07株等中國大陸DuCV毒株的遺傳距離最近；4株為屬于DuCV-2型，則與我國大陸毒株WF080株關(guān)系較近；與其他動物圓環(huán)病毒處在不同的進化分支上，與鵝圓環(huán)病毒的親緣關(guān)系較近，其次是鴿圓環(huán)病毒(COCV)，豬圓環(huán)病毒(PCV1和PCV2)，而與雞圓環(huán)病毒(雞貧血病病毒CIAV)遺傳距離較遠。

2.4 鴨圓環(huán)病毒Cap和Rep蛋白氨基酸序列分析 對采用DNAMEND對30株DuCV 各自編碼Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列進行分析，與不同時間的DuCV參考毒株比較，Cap蛋白的氨基酸的變化區(qū)域集中在：30～64，104～124，233～238，與DuCV基因組劃分基因型序列的變異是相同的；Rep蛋白的氨基酸的變化區(qū)域則集中在：105～133，200～230，275～285。Cap蛋白構(gòu)成DuCV的核衣殼，是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，存在有抗原位點及糖基化位點，通過對Cap蛋白抗原位點析，發(fā)現(xiàn)DuCV-1型的26株DuCV均有8個抗原表位區(qū)域，分別位于35～42、64～70、108～116、118～132、139～145、173～189、208～220和243～251；而DuCV2型的的4株DuCV則存在5個抗原表位區(qū)域，分別位于31～35、108～134、177～187、208～220、243～251；預(yù)測Cap蛋白的糖基化位點的結(jié)果與相關(guān)研究一致[8]，不同地區(qū)與基因型的DuCV分別在第206、211和231位氨基酸處存在N2糖基化位點，大部分DuCV毒株的Cap蛋白氨基酸糖基化位點在第211出現(xiàn)NCT→NCS和231出現(xiàn)NTT→NAT變動。相關(guān)研究表明，由于Cap衣殼蛋白存在可變區(qū)，即氨基酸序列的差異，用以區(qū)分基因組分型，當(dāng)DuCV-1型和DuCV-2型的抗原表位及糖基化位點的氨基酸序列出現(xiàn)變化時，可能會造成DuCV-1型的抗原性稍強于DuCV-2型的抗原化[9]，其所受到的免疫壓力可能更大，其致病性也可能出現(xiàn)差異[10]。

注:▲為本試驗分離株

3 討論與結(jié)論

DuCV與其他圓環(huán)病毒屬成員一樣，常常以隱性潛伏感染存在[11]，具有免疫抑制特性和感染的持續(xù)性。當(dāng)病毒入侵機體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫功能下降，影響機體對其他疫苗的免疫效果，抵抗病原體的能力下降，從而繼發(fā)感染其他疾病，而一旦發(fā)生混合感染，感染鴨的死亡率就會增加，特別是不同地區(qū)的DuCV的廣泛流行使我國的鴨圓環(huán)病毒疫情變得更加復(fù)雜，防控難度增大。

30株DuCV全基因序列分析結(jié)果顯示，26株DuCV的全基因序列長為1993～1995 bp，4株DuCV的全基因序列僅有1988 bp；全基因組序列的5′端均存在DuCV基因結(jié)構(gòu)的特征[12]，9個保守堿基組成頂端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，下游存在與病毒基因組滾環(huán)復(fù)制有關(guān)的2個正向的6個堿基序列。同源性比較顯示，獲得的30株DuCV全基因序列之間的同源性為83.7%～99.9%，同一基因型全基因組序列差異較小，而DuCV-1與DuCV-2兩個基因型全基因組序列之間差異較大，可達13%～16.3%；與其他國內(nèi)外不同時間的DuCV參考毒株的全基因組序列的同源性比較，與2010年之后的DuCV參考毒株同源性較高；與圓環(huán)病毒科中其他動物圓環(huán)病毒基因組同源性差異比較很大。對DuCV流行毒株分子遺傳變異情況分析顯示，且兩個基因型之間差異較顯著，在遺傳進化上分為兩個明顯的分支，表明近幾年來同時流行了兩種基因型的DuCV，在全國各地均有分布，DuCV在同一年代同一區(qū)域的分離株之間的相似性比較高，有非常近的遺傳距離并聚集成簇，具有趨同進化的傾向；DuCV-1型的流行毒株與不同時間的DuCV參考毒株在遺傳進化總體上沒有明顯的分布地區(qū)和流行時間；DuCV-2型流行毒株與參考毒株在系統(tǒng)發(fā)育上關(guān)系接近卻又獨立分支，說明DuCV可能存在一定的變異；所有流行毒株與其他動物圓環(huán)病毒處在不同的進化分支上，親緣關(guān)系較遠。對Cap蛋白和Rep蛋白的氨基酸序列的變異分析表明Cap蛋白的變異程度要顯著高于Rep蛋白，這可能是由于Cap蛋白為病毒最主要的致病性蛋白，需要快速大量的產(chǎn)生變異來保證生存[13]。另外，在長期進化過程中與選擇壓力下，鴨圓環(huán)病毒的分子進化中也容易發(fā)生突變。

現(xiàn)有的病毒增殖體系難以增殖DuCV，對于DuCV的研究主要局限在檢測和基因組序列分析等方面[14]。對于鴨圓環(huán)病毒病在實際工作中主要以預(yù)防為主，藥物治療方法效果較差，因此需要從加強鴨群飼養(yǎng)管理和生物安全措施，改善養(yǎng)殖環(huán)境，提高鴨群對DuCV的抗病能力，防止繼發(fā)感染其他疾病。該研究對2019年上半年的DuCV流行毒株進行了遺傳變異分析，旨在為研究鴨圓環(huán)病毒分子流行病學(xué)的流行株和分布情況提供參考依據(jù)，為更好地調(diào)查和防控該病提供了科學(xué)依據(jù)。