左三齡，張 博，邱銀生，葉 純，吳仲元

(武漢輕工大學動物科學與營養(yǎng)工程學院，武漢 430023)

目前國內(nèi)外豬場普遍存在蒼蠅污染問題，養(yǎng)殖場蠅蛆的控制是困擾養(yǎng)殖生產(chǎn)的一大難題?？刂撇呗灾饕鞘褂脭硵澄泛统x菊噴霧劑，但毒副作用較大[1]。除蟲脲(diflubenzuron)，化學名1-(4-氯苯基)-3-(2,6-二氟苯甲酰基)脲(圖1)。屬苯甲酰脲類殺蟲劑，作用性質(zhì)為昆蟲生長調(diào)節(jié)劑，能夠阻礙昆蟲表皮中幾丁質(zhì)的合成，使昆蟲變態(tài)受阻不能蛻皮而死亡[2-3]。獸用除蟲脲作用方式主要為胃毒和觸殺，無內(nèi)吸收特性[4]。除蟲脲的合成路線有多種[5-7]，主要合成工藝為2,6-二氟苯甲酰胺與對氯苯基異氰酸酯在二甲苯溶液中縮合生成除蟲脲。該農(nóng)藥于1976年，經(jīng)美國環(huán)保局批準投入批量生產(chǎn)[8]，2016年1月美國Central Life Sciences公司已開發(fā)出0.04%和0.67%的獸用除蟲脲預混劑Mix Clarifly?作為豬、牛和馬的殺蠅蛆劑使用，但目前國內(nèi)無相關獸藥制劑，且國內(nèi)外對其原料藥含量測定和有關物質(zhì)檢查少有相關報道。為完善獸用除蟲脲的質(zhì)量控制，本研究擬通過使用高效液相色譜(HPLC)建立獸用除蟲脲含量測定及其有關物質(zhì)檢查的方法，以期為國內(nèi)外進一步的獸用制劑質(zhì)量標準的控制研究提供參考。

圖1 除蟲脲結構式

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(ACQUITY Arc HPLC)配備二極管陣列(PDA)檢測器，購自美國Waters公司；精密分析天平(BS 110S)，購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超純水儀購自德國 Merck-Millipore公司；渦旋混合儀(FW80微型)購自上海滬西分析儀器廠有限公司；pH計(STARTER 2100)購自奧豪斯儀器上海有限公司；超聲儀(KQ5200)購自昆山市超聲儀器有限公司；藥物穩(wěn)定性檢查儀(WD-A)購自天津天光光學儀器有限公司。

除蟲脲對照品(批號G139525，含量≥99.2%)購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；3批獸用除蟲脲原料藥(自制，批號2018090201、2018090202、2018090203)；除蟲脲可能的雜質(zhì)(表1)：A、B、C、D(含量均大于98.0%)購自MACKLIN公司；甲醇、乙腈(色譜純)購自Fisher Cheical公司；乙酸銨、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司。

表1 除蟲脲可能的雜質(zhì)

2 方法與結果

2.1 含量測定方法與結果

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)，檢測波長為254 nm，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL，以甲醇為流動相A，0.01 mol/L乙酸銨溶液為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫順序為0 min，40% A；0～5 min，40% A；5～20 min，40%～80% A；20～30 min，80% A；30～35 min，80%～40% A；35～40 min，40% A。

2.1.2 溶液配制 除蟲脲儲備液的制備：分別精密稱量除蟲脲對照品和原料藥100 mg，加甲醇溶解，制成濃度為1000 μg/mL的除蟲脲對照品和原料藥儲備溶液，4 ℃冷藏備用。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗 將2.1.2項除蟲脲對照品和原料藥的儲備液，分別用甲醇稀釋為100 μg/mL，分別進樣，記錄色譜圖，結果見圖2。計算得到的主峰理論塔板數(shù)均大于25000，各組分的分離度均大于1.5，符合規(guī)定。

圖2 除蟲脲對照品(A)和原料藥(B)的HPLC圖譜

2.1.4 線性關系考察 將2.1.2項除蟲脲對照品溶液，用甲醇分別稀釋為10、20、50、100、200、500 μg/mL，以質(zhì)量濃度(C，μg/mL)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標作線性回歸，得線性回歸方程為y=28 812C-1 957.7，R2=0.999。表明除蟲脲質(zhì)量濃度在10～500 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.5 重復性、精密度和穩(wěn)定性試驗 根據(jù)《中華人民共和國獸藥典(2015版)》一部的藥品質(zhì)量標準分析方法指導原則，精密稱取6份10 mg的除蟲脲對照品，用甲醇溶解定容至100 mL，連續(xù)進樣6次，RSD=0.45%，表明本方法重復性良好；將質(zhì)量濃度為100 μg/mL的除蟲脲對照品溶液重復進樣9次，計算可得其RSD=0.13%，表明本方法精密度良好；又分別于0、2、4、8、12、24 h進樣記錄峰面積，用外標法計算不同時間點相對于0 h時的除蟲脲的降解率為0.51%，RSD=0.20%，表明在常溫條件下，24 h內(nèi)除蟲脲原料藥溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.6 回收率試驗 加入除蟲脲標準品，用甲醇分別配制80%、100%、120%的供試溶液，每個3份，用外標法計算平均回收率及RSD?；厥章蕿?7.01%～100.83%，RSD<1.0%(n=3)，符合回收率要求。

2.1.7 含量測定 取三批除蟲脲原料藥配制供試品溶液和對照品溶液進樣測定，并記錄峰面積，用外標法計算除蟲脲的含量。三批除蟲脲原料藥的含量分別為99.73%(2018090201)、99.61%(2018090202)、99.67%(2018090203)。

2.2 有關物質(zhì)測定方法與結果

2.2.1 色譜條件 同2.1.1項色譜條件。

2.2.2 溶液配制 據(jù)文獻[9]及除蟲脲合成原料及工藝中發(fā)現(xiàn)可能的雜質(zhì)有A、B、C、D。其中C(對氯苯基異氰酸酯)需進行衍生化處理成在流動相中穩(wěn)定的物質(zhì)，再進樣檢測。根據(jù)文獻[10-12]衍生化方法，C與甲醇進行酯化反應。

供試品溶液：稱取除蟲脲及其有關物質(zhì)A、B、C、D各0.05 g，將C衍生化處理后與A、B、D混合于100 mL量瓶中，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度均為500 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 將2.2.2項混合對照品溶液，按2.1.1項色譜條件測定，色譜圖見圖3。計算得到的理論塔板數(shù)均大于25000，各組分的分離度良好，均大于1.5，符合規(guī)定。

1：2,6-二氟苯酰胺；2：對氯苯胺；3：對氯苯基異氰酸酯；4：除蟲脲；5：1,3-雙(4-氯苯基)尿素

2.2.4 專屬性與破壞性試驗 分別精密稱取5份除蟲脲原料藥0.05 g于100 mL量瓶中，處理如下：①氧化破壞：加入30%過氧化氫1 mL，超聲20 min；②酸破壞：加入1 mol/L鹽酸溶液(溶劑甲醇)70 mL，90 ℃水浴加熱100 min；③堿破壞：加入1 mol/L氫氧化鈉溶液70 mL，90 ℃水浴加熱100 min；④高溫破壞：于105 ℃放置10 h；⑤光照破壞：室溫下，5 000±500 Lux強光照放置14 h，自然光照放置10 d。將未經(jīng)降解試驗的原料藥和降解破壞樣品加甲醇，完全溶解后，酸堿破壞樣品分別中和后甲醇定容，進樣測定。專屬性和破壞試驗的結果見圖4和表2。可見未經(jīng)破壞除蟲脲原料藥的相對保留時間(Rt)為28.437 min，氧化破壞則主要產(chǎn)生了降解物R1(Rt為1.404 min)，酸堿、高溫和自然光破壞條件下產(chǎn)生了降解物R2(Rt為10.411 min)，強光和自然光條件下產(chǎn)生了降解物R3(Rt為29.624 min)，強光下主要產(chǎn)生了降解物R4(Rt為31.802 min)。根據(jù)PDA掃描光譜圖，可知除蟲脲主峰和主要降解物R1、R2、R3、R4均為單一純度峰。各降解產(chǎn)物與主峰的分離度R均大于1.5，符合要求，說明該方法良好。

A.空白溶劑；B.未經(jīng)破壞原料藥；C.氧化破壞；D.強酸破壞；E.強堿破壞 F.高溫破壞；G.強光破壞；H.自然光破壞A.Blank solvent；B.Untreated raw material drug；C.Destroyed by oxidation；D.Destroyed by acid；E.Destroyed by alkali；F.Destroyed by heat；G.Destroyed by strong light；H.Destroyed by natural light

表2 破壞試驗的有關物質(zhì)

其中對氯苯胺與強堿、強酸、高溫和自然光破壞產(chǎn)生的降解物R2的PDA掃描光譜圖見圖5，對比后發(fā)現(xiàn),R2與對氯苯胺的出峰時間和最佳波長幾乎一致，有理由懷疑R2為對氯苯胺。PDA掃描圖譜的對比分析為除蟲脲有關物質(zhì)的定性檢測提供了參考依據(jù)。

A.對氯苯胺；B. 強堿破壞；C. 強酸破壞；D. 高溫破壞；E. 自然光破壞A.4-Chlorophenyamine；B. Destroyed by alkali；C. Destroyed by acid；D. Destroyed by heat；E. Destroyed by natural light

2.2.5 雜質(zhì)檢測限與定量限 將2.2.2項混合對照溶液，用甲醇逐步稀釋后進樣測定，以信噪比S/N=3、S/N=10測定，雜質(zhì)A、B、C、D檢測限分別為0.5244、1.5261、0.4691、0.0997 μg/mL(S/N=3)，定量限分別為1.7479、5.0869、1.5638、0.3324 μg/mL(S/N=10)。

2.2.6 樣品溶液精密度、穩(wěn)定性試驗 將2.2.2項混合對照品溶液進樣，連續(xù)進樣9次，計算得A～D雜質(zhì)峰面積的RSD分別為0.29%、0.42%、0.73%、0.45%；每天進樣，連續(xù)進樣6 d，計算得A～D雜質(zhì)峰面積的RSD分別為0.83%、1.78%、2.31%、1.88%。并分別于0、2、4、8、12 h進樣，計算得不同時間點時A～D雜質(zhì)峰面積的RSD分別為0.60%、1.07%、1.89%、1.26%。表明在常溫條件下，本方法日內(nèi)、日間精密度良好，12 h內(nèi)除蟲脲原料藥溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.7 有關物質(zhì)檢查 取三批除蟲脲原料藥，按照2.2.2項的方法配制供試品溶液濃度為500 μg/mL進樣測定并記錄峰面積。測定結果如表3所示，用外標法計算除蟲脲主成分含量均大于99%，以主成分自身對照法計算有關雜質(zhì)的量，原料藥雜質(zhì)峰面積的總和均低于0.1%的鑒定限。

表3 除蟲脲主成分含量和有關雜質(zhì)

3 討論與結論

3.1 衍生化方法的選擇 根據(jù)文獻[10-12]發(fā)現(xiàn)對氯苯基異氰酸酯在含有水相的溶液中不穩(wěn)定，易水解，進樣后在流動相中會發(fā)生水解影響檢測，需要在進樣前進行衍生化處理成在流動相中相對穩(wěn)定的物質(zhì)后，再進樣檢測。衍生化方法分別考察了兩種常見的方法：一為對氯苯基異氰酸酯用四氫呋喃溶解后用過量二正丁胺進行衍生；二為用甲醇與對氯苯基異氰酸酯進行酯化反應的衍生方法。其中衍生化方法二的處理過程簡單,易反應完全，且無溶劑峰和雜峰，不影響除蟲脲及相關雜質(zhì)的分析。因此，選擇了甲醇與對氯苯基異氰酸酯進行酯化反應的衍生方法。

3.2 色譜條件的選擇 本試驗根據(jù)文獻[13-15]，流動相分別考察了乙腈-水-二惡烷、甲醇-水、甲醇-乙酸銨水這3種流動相體系。結果顯示在乙腈-水-二惡烷的流動相條件下，對氯苯基異氰酸酯的峰型不佳,有拖尾且各峰分離不佳；在甲醇-水的流動相條件下，2,6-二氟苯甲酰胺的峰型不佳,有拖尾且各峰分離一般；甲醇-乙酸銨水的流動相條件下，除蟲脲與2,6-二氟苯甲酰胺、對氯苯基異氰酸酯、對氯苯胺及1,3-雙(4-氯苯基)尿素的峰型良好且各峰分離良好。因此,選擇甲醇-乙酸銨水作為流動相體系。試驗發(fā)現(xiàn)將流動相等度洗脫調(diào)整為梯度洗脫后，既能短時高效的檢測出獸用除蟲脲原料藥是否引入其合成工藝上的雜質(zhì)，同時能測定出主成分含量和有關物質(zhì)，且各峰分離度良好。試驗發(fā)現(xiàn)檢測波長調(diào)整為254 nm時，各峰響應值均較高。

3.3 PDA檢測色譜圖分析 通過破壞性試驗發(fā)現(xiàn)了除蟲脲的多種有關物質(zhì)，將降解產(chǎn)物R2和對氯苯胺的PDA檢測色譜圖進行對比分析，兩張圖譜最佳波長幾乎一致，光譜學上說明強酸、強堿、高溫和自然光破壞條件下的降解物R2為對氯苯胺，若完全確定,可做進一步的結構確證研究，其生成途徑也有待進一步的解析。

藥物有關物質(zhì)的檢查與鑒定在其質(zhì)量標準的制定實施中十分的重要，但目前除蟲脲未被藥典收錄且無有關物質(zhì)的控制標準。本研究對除蟲脲含量和有關物質(zhì)液相方法建立的同時，對其有關物質(zhì)進行了初步的研究。本研究發(fā)現(xiàn)3批次的除蟲脲原料藥中總雜質(zhì)最大限度為0.1%，均低于《獸用化學藥物雜質(zhì)研究技術指導原則》中獸醫(yī)專用原料藥的雜質(zhì)報告限度0.1%，鑒定限度0.2%，質(zhì)控限度0.5%的標準。因此,依據(jù)現(xiàn)行傳統(tǒng)工藝水平可暫定為如有雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)峰面積的面積和不得大于對照溶液主峰面積的0.1倍(0.1%)。本研究建立測定除蟲脲原料藥主成分含量及有關雜質(zhì)的高效液相色譜法，使除蟲脲及有關雜質(zhì)在同一色譜條件下檢測并取得良好的分離效果，PDA檢測圖譜為除蟲脲有關物質(zhì)的定性分析提供了參考依據(jù)。該方法含量測定準確靈敏，雜質(zhì)分離度好，結果準確可靠，可作獸用除蟲脲原料藥主成分含量及有關物質(zhì)的檢測與分析，為獸用除蟲脲原料藥的質(zhì)量控制和質(zhì)量標準制定提供了參考依據(jù)。