陳圣威，馬丹怡，丁月霞

(廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

變形桿菌屬分為普通變形桿菌、奇異變形桿菌、潘納變形桿菌和產(chǎn)黏液變形桿菌共4個(gè)種，該菌屬為革蘭氏陰性菌，為醫(yī)源性感染的機(jī)會致病菌，其致病因子有鞭毛、菌毛、內(nèi)毒素、溶血素和腸毒素。變形桿菌可以導(dǎo)致雞發(fā)生急性熱性細(xì)菌性傳染病，使雞發(fā)生菌血癥、敗血癥，單側(cè)性或雙側(cè)性癱瘓或水樣腹瀉，能夠發(fā)生暴發(fā)性流行疾病，需要養(yǎng)殖業(yè)引起重視[1-2]。

許多研究發(fā)現(xiàn)中草藥具有良好的抑菌效果，不易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，并且能夠提高禽類的免疫能力，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的體質(zhì)，具有較高的研究價(jià)值，能夠?yàn)榕R床用藥提供更多選擇[3]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料，本試驗(yàn)選取了黃芩、穿心蓮及虎杖等9種具有抑菌效果的中草藥，通過水提法和醇提法制備出中藥提取液，對雞源變形桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，篩選抑菌效果較好的中草藥提取液進(jìn)行體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，測定其部分抑菌濃度(FIC指數(shù))。以期為研究中草藥抑菌效果提供參考，為臨床使用中草藥治療普通變形桿菌感染提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)菌種 雞源變形桿菌，采自廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院臨床病例，經(jīng)分離鑒定后保存。

1.2 試驗(yàn)藥材 野菊花、穿心蓮、虎杖、黃連、黃芩、香薷、金銀花、梔子、黃柏，購于湛江市大參林藥房。

1.3 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂，購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任有限公司；營養(yǎng)肉湯，購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任有限公司。

1.4 主要儀器 GZX-GF·101-2-BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，SPX-250B-II 生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，LDZF-50KB 立式壓力蒸汽滅菌器 (上海申安醫(yī)療器械廠)，TDL-5Z臺式多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，BCD-206STPA海爾牌冷藏冷凍箱 (青島海爾股份有限公司)，SY-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 (上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，DFY-500500克搖擺式高速中藥粉碎機(jī) (溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，HWS-24數(shù)星恒溫?cái)嚢杷″?(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 中草藥提取液的制備

2.1.1 水提液的制備 稱取所需中草藥50 g，加500 mL蒸餾水室溫浸泡30 min，加熱至沸騰后小火煮30 min，經(jīng)六層紗布過濾，藥渣再加400 mL蒸餾水，加熱至沸騰后小火煮30 min，經(jīng)六層紗布過濾，合并2次濾液，濾液經(jīng)恒溫沸騰濃縮至50 mL，即藥物濃度為1 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆肹4]。

2.1.2 醇提液的制備 將藥物分別粉碎20目，各稱重50 g，加入200 mL 90%乙醇溶液，浸泡1周，經(jīng)六層紗布過濾，藥渣加入100 mL 90%乙醇溶液，再次浸泡24 h，經(jīng)六層紗布過濾，合并2次濾液。將濾液經(jīng)3000 r/min離心10 min后取上清液，置沸水浴中揮盡乙醇，濃縮成膏，再用無菌生理鹽水定容至50 mL，4 ℃保存?zhèn)溆肹5]。

2.2 供試菌液的制備 挑取保存的菌株，接種于營養(yǎng)肉湯中，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)16～24 h，次日于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線培養(yǎng)16～24 h，第三天挑取單個(gè)菌落接種于2 mL營養(yǎng)肉湯中，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～24 h，吸取上述菌液0.2 mL，用營養(yǎng)肉湯按10-1進(jìn)行梯度稀釋，與0.5麥?zhǔn)媳葷峁軐Ρ?，將菌液校正至?xì)菌含量約為1.5×108CFU/mL，再稀釋為1.0×105CFU/mL的供試菌液，4 ℃冰箱保存。

2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定 中草藥的水提液與醇提液均采用試管二倍稀釋法進(jìn)行最小抑菌濃度的測定：取滅菌后的試管，排序1～12號，將1～10號試管的藥物濃度依次稀釋為500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.97、1.98和0.99 mg/mL。11號試管不加藥物作為陽性對照，12號試管不接種細(xì)菌作為陰性對照。重復(fù)2次。將各管置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)16～24 h，觀察結(jié)果。在陽性對照管渾濁，陰性對照管透明不渾濁的條件下，1～10號試管內(nèi)，液體澄清透明的最低濃度為最小抑菌濃度。

2.4 體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 選取最小抑菌濃度≤125 mg/mL的中草藥水提液和醇提液，分別進(jìn)行體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。采用微量肉湯稀釋棋盤法，將測定的中草藥提取液單獨(dú)對受試菌的最小抑菌濃度(MIC)作為中心濃度，選擇AB兩種藥，將兩藥MIC的2倍、1倍、1/2倍、1/4倍以及MIC的1/8、1/16和1/32濃度在96孔反應(yīng)板上進(jìn)行聯(lián)合，接菌量為1.0×105CFU/mL。置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)16 h，觀察結(jié)果并計(jì)算FIC指數(shù)。

FIC指數(shù)≤0.5表示兩藥聯(lián)合結(jié)果為協(xié)同作用；FIC指數(shù)>0.5～1表示兩藥聯(lián)合結(jié)果為相加作用；FIC指數(shù)>1～2表示兩藥聯(lián)合結(jié)果為無關(guān)作用；FIC指數(shù)>2表示兩藥聯(lián)合結(jié)果為無關(guān)作用。

3 結(jié)果與分析

3.1 最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果 不同中草藥提取液對雞源變形桿菌的MIC結(jié)果見表1。由表可知，黃芩水提液對雞源變形桿菌抑菌效果最顯著，其MIC值為62.5 mg/mL，黃連、香薷、虎杖、穿心蓮的抑菌效果次之，MIC值為125 mg/mL，黃柏抑菌效果一般，MIC值為250 mg/mL，野菊花、梔子的抑菌效果較差，MIC值為500 mg/mL，金銀花抑菌效果最差，MIC值大于500 mg/mL。

在醇提液中，香薷、虎杖、穿心蓮對雞源變形桿菌抑菌效果較好，MIC值為125 mg/mL，其次為黃芩、黃連、野菊花、梔子，MIC值為250 mg/mL，黃柏抑菌效果較差，MIC值為500 mg/mL，金銀花抑菌效果最差，MIC值大于500 mg/mL。

表1 最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果

3.2 體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果 中草藥提取液聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。由表2可知，在水提液聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中，黃連和虎杖聯(lián)合為拮抗作用(FIC>2)，黃芩和穿心蓮、黃芩和香薷、黃芩和虎杖、黃連和穿心蓮、黃連和香薷、穿心蓮和香薷、穿心蓮和虎杖、香薷和虎杖聯(lián)合均為無關(guān)作用(FIC>1～2)，黃芩和黃連聯(lián)合無法計(jì)算試驗(yàn)結(jié)果，無FIC指數(shù)。由表3可知，醇提液聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中，穿心蓮和香薷聯(lián)合為拮抗作用(FIC指數(shù)>2)，虎杖和香薷、穿心蓮和香薷聯(lián)合呈現(xiàn)為無關(guān)作用(FIC指數(shù)>1～2)。

表2 水提液體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：“-”表示結(jié)果無法計(jì)算。

表3 醇提液體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論與結(jié)論

4.1 不同中草藥的抑菌效果 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同的中草藥對雞源變形桿菌的抑菌效果不同。其中黃芩的水提液對雞源變形桿菌的最小抑菌濃度(MIC)值為62.5 mg/mL，抑菌效果最顯著，黃芩醇提液MIC值為250 mg/mL，抑菌效果一般，有研究表明，黃芩有廣泛的藥理作用，如抗真菌、抗病毒和抗菌等，其主要有效成分為黃芩苷和黃芩素[6]。而金銀花抑菌效果最差。金銀花的水提液與醇提液的MIC值均大于500 mg/mL，崔艷[7]等人研究發(fā)現(xiàn)金銀花具有抗菌、消炎、抗氧化等作用，主要有效成分為機(jī)酸類、黃酮類、揮發(fā)油和環(huán)烯醚萜類化合物等。本試驗(yàn)中金銀花對雞源變形桿菌不具有體外抑菌作用，但其在體內(nèi)是否能對雞源變形桿菌產(chǎn)生抑制作用，仍需要進(jìn)一步的研究。

4.1.2 不同提取方法對體外抑菌效果的影響 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，同種中草藥提取方法不同所得的中草藥提取液對雞源變形桿菌抑菌效果不同。本試驗(yàn)中黃芩、黃連、黃柏的醇提液抑菌效果較水提液差，而金銀花、香薷、虎杖、穿心蓮的醇提液抑菌效果與水提液相同，野菊花和梔子的醇提液抑菌效果優(yōu)于水提液。其中醇提液與水提液抑菌效果相差最大的為黃芩，邢逞[8]等人的研究顯示黃芩水提液中的黃芩素成分含量高于黃芩醇提液，而在本試驗(yàn)中發(fā)揮抑菌效果的有效成分是否確定為黃芩素則需要進(jìn)一步研究。謝新芳[9]等人的研究顯示金銀花的醇提液抑菌效果優(yōu)于水提液，與本試驗(yàn)結(jié)果不一致，但其菌種為奇異變形桿菌，與本試驗(yàn)所用菌種存在差異。本試驗(yàn)說明不同的提取方法，可能會影響提取液中對特定病原菌具有抑制作用的有效成分的含量，進(jìn)而影響體外的抑菌效果。其中影響最大的因素可能是有效成分在溶劑中的溶解度。

學(xué)者們一直在研究中草藥的有效成分，但關(guān)于中草藥的提取方法和作用機(jī)理等都需要進(jìn)一步研究，根據(jù)提取的方法、溫度、時(shí)間、試劑等的不同中草藥的抑菌效果都會有差別，例如水提法雖然操作條件簡便，但其煎煮條件等缺少標(biāo)準(zhǔn)，有些中草藥受到煎煮溫度、時(shí)間等的影響，其中熱穩(wěn)定性較差的有效成分容易被破壞，影響中草藥的抑菌效果，并且某些藥物的有效成分不易溶于水，則水提法就不能較好地發(fā)揮出中草藥的藥效；而醇提法受到乙醇濃度、用量等的影響，會有不同的效果，若乙醇濃度過高，用量過大，則可能失去較多不溶于乙醇的有效成分，若濃度過低，用量過少，就不能達(dá)到較好的除雜效果[10]。

本試驗(yàn)為同種藥物的不同提取方法以及不同藥物的同種提取方法的抑菌效果進(jìn)行了研究，為該幾種中草藥的臨床用藥和試驗(yàn)研究提供參考。關(guān)于中草藥不同的提取方法對中草藥抑菌效果的影響還需要進(jìn)一步研究，以達(dá)到中草藥最優(yōu)的抑菌效果，為臨床用藥提供參考。

4.2 體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析 本試驗(yàn)中，黃連和虎杖水提液以及穿心蓮和香薷醇提液的體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果為拮抗作用，可能是由于藥物在進(jìn)行配伍時(shí)，有效成分之間相互反應(yīng)，發(fā)生結(jié)合、吸附等作用，使藥物的有效抑菌成分溶出減少，或相互發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而使藥物的抑菌活性下降[11]。還可能是藥物之間的作用位點(diǎn)相同，導(dǎo)致相互之間產(chǎn)生競爭作用，從而出現(xiàn)拮抗。其余組合的體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果均為無關(guān)作用。這些藥物的配伍在體內(nèi)試驗(yàn)中是否仍為拮抗或無關(guān)作用，還需要進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果能為該幾種中草藥的在臨床上的配伍使用提供參考，而中草藥在聯(lián)用時(shí)，其配伍方式和比例對抑菌效果的影響、配伍后有效成分的變化等都需要進(jìn)一步的研究探討。