許藝凡，周冰，張聰，姚路路，楊會(huì)鮮，周德剛，張曉會(huì)

(國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/洛陽惠中獸藥有限公司，河南洛陽 471000)

芩黃顆粒是由黃芩、板藍(lán)根、麻黃、山豆根、甘草、桔梗等六味中藥組成的中獸藥制劑，該方由《傷寒論》“麻杏甘石湯”藥味加減而來，目前收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版。方中黃芩性寒、味苦，有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血除熱的作用，可治療肺熱咳嗽、濕熱瀉?。桓什菪云?、味甘，有和中緩急、潤(rùn)肺解毒的功效，可治療咽喉腫痛、肺痿咳嗽等癥。該藥在臨床上主要用于雞傳染性支氣管炎的預(yù)防與輔助性治療[1]。目前，芩黃顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)分別對(duì)黃芩苷與甘草酸進(jìn)行測(cè)定，也有學(xué)者單獨(dú)研究了芩黃顆粒中甘草酸或黃芩苷的含量測(cè)定方法[2-3]，但未見有同時(shí)測(cè)定黃芩苷與甘草酸含量的相關(guān)報(bào)道。本研究首次建立了同時(shí)測(cè)定芩黃顆粒中黃芩苷和甘草酸含量的高效液相色譜方法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可以提高該制劑在實(shí)際生產(chǎn)中的檢驗(yàn)效率，為該制劑的質(zhì)量控制提供了參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，配備2489型紫外檢測(cè)器；AB265-S電子分析天平，METTLER TOLEDO 公司；KQ-500DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)110715-201720，含量：93.52%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；甘草酸銨對(duì)照品(批號(hào)110731-201720，含量：94.3%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；芩黃顆粒(洛陽惠中獸藥有限公司，批號(hào)：20190704、20190705、20190706，規(guī)格：500 g /袋)；乙腈、甲醇均為色譜純，Thermo Fisher Scientific公司；磷酸為分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，0.05 %磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：252 nm；柱溫30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取黃芩苷對(duì)照品、甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，置于同一量瓶中，用適量甲醇使溶解，再加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照溶液(黃芩苷濃度為0.3092 mg/mL、甘草酸銨濃度為0.0413 mg/mL)(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方中去除甘草、黃芩的其他藥材，按芩黃顆粒處方比例和工藝制備陰性對(duì)照樣品，按2.2.2項(xiàng)方法，制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1～圖3)。結(jié)果表明：供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，且陰性無干擾，表明本方法專屬性良好。

圖1 對(duì)照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

圖3 陰性色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 分別稱取黃芩苷對(duì)照品、甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，置于同一量瓶中，用適量甲醇使溶解，再加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液(黃芩苷濃度0.6184 mg/mL、甘草酸銨濃度0.08256 mg/mL)。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3、5、8 mL于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成線性對(duì)照溶液。分別精密吸取上述不同濃度的混合對(duì)照品溶液和對(duì)照品儲(chǔ)備液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷的回歸方程為：Y=12148X+2018.7，R2=0.9999；甘草酸的回歸方程為：Y=8209.8X+463.92，R2=0.9999。表明黃芩苷的進(jìn)樣濃度在61.84～618.4 μg/mL的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；甘草酸的進(jìn)樣濃度在8.256～82.56 μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)的混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測(cè)得黃芩苷、甘草酸峰面積的RSD分別為0.5%、0.5%(n=6)。表明儀器精密度較好(表2)。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)20190706本品6份，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，依法測(cè)定，結(jié)果黃芩苷、甘草酸的平均含量分別為31.2、4.8 mg/g，RSD分別為0.9%、1.0%(n=6)，結(jié)果表明，本法具有較好的重復(fù)性。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)制備供試品溶液，分別于第0、2、4、6、8、10、12 h各精密吸取10 μL注入液相色譜儀，依法測(cè)定，結(jié)果黃芩苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.3%、0.4%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(表3)。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量樣品(批號(hào)：20190706)6份，每份約0.25 g，精密稱定，按樣品含量的100%分別加入黃芩苷和甘草酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，依法測(cè)定，結(jié)果黃芩苷、甘草酸的平均加樣回收率分別為100.0%、99.2%，RSD分別為1.0 %、0.6%(n=6)，表明方法準(zhǔn)確度良好(表4、表5)。

表4 黃芩苷加樣回收率

表5 甘草酸加樣回收率

2.9 樣品測(cè)定 取芩黃顆粒3批(批號(hào)：20190704、20190705、20190706)，按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件分別測(cè)定樣品中黃芩苷和甘草酸的含量，三批樣品的含量測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別取黃芩苷與甘草酸對(duì)照品溶液，采用紫外光分光光度法進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)為277 nm、甘草酸的最大吸收波長(zhǎng)為252 nm。且兩個(gè)成分在波長(zhǎng)為263 nm處均具有較大的吸收。取供試品溶液，分別在263 nm和252 nm波長(zhǎng)下依法測(cè)定，結(jié)果，在252 nm波長(zhǎng)下，甘草酸峰的響應(yīng)較263 nm下更高，因芩黃顆粒中黃芩苷的含量遠(yuǎn)高于甘草酸的含量，為使兩種成分同時(shí)有較好的檢出靈敏度，綜合考慮，最終選擇252 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)(圖4)。

圖4 紫外全波長(zhǎng)掃描圖

3.2 流動(dòng)相的選擇 參考《中國(guó)獸藥典》2015年版二部甘草含量測(cè)定項(xiàng)下條件，采用乙腈-0.05%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)[4]，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，分別考察了乙腈-0.05%磷酸溶液[5-6]、甲醇-0.1%磷酸溶液[7]、乙腈-0.1%磷酸溶液[8]、甲醇-0.05%磷酸溶液等流動(dòng)相體系。最終選擇乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，主峰的分離效果較好，且基線較平穩(wěn)，適用于黃芩苷與甘草酸的同時(shí)測(cè)定。

本文采用高效液相法同時(shí)測(cè)定了芩黃顆粒中黃芩苷與甘草酸的含量，該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確、重復(fù)性好，對(duì)提高實(shí)際生產(chǎn)檢驗(yàn)效率及本產(chǎn)品質(zhì)量控制具有重要意義。