高效液相色譜法測定卡巴匹林鈣產(chǎn)品與反應(yīng)液中尿素的含量

王瑞菲，徐婷，魏鳳，王艷，馮維春*

(1.青島科技大學(xué)山東化工研究院，濟(jì)南 250014；2.山東省化工研究院,山東省水相有機(jī)合成及高效清潔分離工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250014)

卡巴匹林鈣，是“阿司匹林”(乙酰水楊酸)衍生物，是乙酰水楊酸鈣與尿素的絡(luò)合物，能夠在水中分解為乙酰水楊酸進(jìn)而發(fā)揮解熱、陣痛、抗炎及抑制血小板聚集作用[1]，還可在畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域中用于豬、雞、牛等各種動物的發(fā)熱和緩釋疼痛[2-3]。尿素的含量作為卡巴匹林鈣的一個重要檢測指標(biāo)，其測定結(jié)果決定了產(chǎn)品的質(zhì)量，而且在卡巴匹林鈣生產(chǎn)過程中，卡巴匹林鈣與卡巴匹林鈣反應(yīng)液中尿素含量的測定，對于工藝和中控分析尤為重要，因此建立快速、準(zhǔn)確的尿素含量測定方法具有重要的實際意義?？ò推チ肘}質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2017年獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)目錄中(農(nóng)業(yè)部公告第1433號)[4]，主要采用紫外-可見分光光度法測定尿素的含量，但是在測定過程中，受衍生試劑(對二甲氨基苯甲醛)來源、衍生的溫度等因素影響，該分析方法的重復(fù)性比較差。傳統(tǒng)尿素測定方法主要有高效液相色譜-熒光法[5-7]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[8-9]、分光光度法[10-11]、折光率法[12]、比色法、脲酶法[13]等分析法，檢測樣品大多為白酒、環(huán)境、罐頭食品等，存在檢測成本高、操作繁瑣、耗時長等弊端，不適用于卡巴匹林鈣反應(yīng)液中尿素含量測定。高效液相色譜法快速，應(yīng)用廣泛。高效液相色譜法直接測定卡巴匹林鈣中尿素含量的方法未見報道。因此，本研究利用建立的方法進(jìn)行實際樣品檢測，以期測定卡巴匹林鈣以及卡巴匹林鈣反應(yīng)液中尿素的含量，為優(yōu)化卡巴匹林鈣的工藝路線提供技術(shù)支持以及完善卡巴匹林鈣的質(zhì)量控制提供參考數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 高效液相色譜儀：Thermo Ultimate 3000以及配套紫外檢測器和工作站；SQP電子天平(感量0.1 mg)，德國賽多利斯天平公司；UV-2700紫外-可見分光光度儀，島津公司。

1.2 材料 甲醇、乙腈為色譜純，Thermo Fisher Scientific；其他試劑均為分析純。尿素對照品，購于中國食品藥品檢定研究院，含量為100%，批號為100288-201302。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇 取尿素對照品適量，加水溶解并稀釋成約含75 μg/mL溶液，在190～240 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。綜合考慮，本研究選擇195 nm作為檢測波長(圖1)。

圖1 尿素吸收波長光譜圖

2.2 分析方法的選擇 目前尿素的測定多采用乙腈-水體系作為流動相，由于尿素為強(qiáng)極性物質(zhì)，在普通C18色譜柱上較難保留；在乙腈-水體系下，使用適用于強(qiáng)極性化合物測定的Waters Xselect HSS T3 C18色譜柱，卡巴匹林鈣中尿素色譜峰與相鄰色譜峰分離度<1.5，不符合色譜分離要求。選擇甲醇-水作為流動相體系，能夠增強(qiáng)尿素的保留能力。通過對不同甲醇-水比例與不同流速進(jìn)行考察，選擇甲醇-水最佳比例為5∶95(V/V)且流速為0.5 mL/min，尿素峰形對稱，保留時間比較合適，分離較好。

2.3 高效液相色譜條件 色譜柱為Waters Xselect HSS T3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(5∶95，V/V)，檢測波長為195 nm，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30 ℃。

2.4 尿素對照品溶液的制備 精密稱取尿素對照品80 mg，用流動相溶解并稀釋至100 mL，配制成0.8 mg/mL尿素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。精密量取10 mL，加流動相稀釋至100 mL， 配制成0.08 mg/mL的尿素對照品溶液。

2.5 樣品溶液的制備 精密稱取卡巴匹林鈣0.5 g，加流動相溶解并稀釋至100 mL；精密量取10 mL，加流動相稀釋至刻度100 mL，配制成卡巴匹林鈣供試品溶液。

精密稱取卡巴匹林鈣反應(yīng)液0.5 g，加流動相溶解并稀釋至100 mL，配制成卡巴匹林鈣反應(yīng)液供試品溶液。

2.6 專屬性試驗 分別量取空白溶劑(流動相)、尿素對照品溶液、卡巴匹林鈣供試品溶液和卡巴匹林鈣反應(yīng)液供試品溶液各10 μL，按照2.3項確定的色譜條件進(jìn)行測定，試驗結(jié)果見圖2。尿素色譜峰的保留時間均約為5.59 min，尿素色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，達(dá)到基線分離，尿素的理論塔板數(shù)大于3000，表明其他組分對尿素測定無干擾。

(1為空白溶劑-流動相；2為尿素對照品溶液；3為卡巴匹林鈣供試品溶液；4為卡巴匹林鈣反應(yīng)液供試品溶液)

2.7 靈敏度考察 取0.8 mg/mL尿素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動相稀釋，平行制備5份0.1 μg/mL尿素對照品溶液，供HPLC檢測，取信噪比S/N≥3時的樣品濃度為檢出限(LOD)，信噪比S/N≥10的樣品濃度為定量限(LOQ)。

添加濃度為0.1μg/mL時，信噪比S/N均大于10，信噪比滿足定量限的要求，確定本方法的定量限。添加濃度為0.05 μg/mL時，信噪比S/N均大于3，信噪比滿足檢出限的要求，確定為本方法的檢出限。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察 分別量取0.8 mg/mL尿素標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，加流動相稀釋，配制成含尿素濃度約為0.12、16、32、48、64、80、96、120 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。依照濃度由小到大的順序，按照上述確定的色譜條件，以質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=3823X-286.7，相關(guān)系數(shù)r為0.99985(圖3)。

圖3 尿素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.9 儀器精密度考察 取尿素對照品溶液(80 μg/mL)，按上述色譜條件重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%。表明此方法的儀器精密度良好(表1)。

表1 儀器精密度試驗數(shù)據(jù)

2.10 重復(fù)性考察 取卡巴匹林鈣(20181121批)與卡巴匹林鈣反應(yīng)液(20181121批)，分別平行制備6份卡巴匹林鈣供試品溶液與卡巴匹林鈣反應(yīng)液供試品溶液，按上述色譜條件測定尿素含量，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(表2～表3)。結(jié)果顯示，卡巴匹林鈣重復(fù)性的RSD為0.70%，卡巴匹林鈣反應(yīng)液重復(fù)性的RSD為0.92%，表明此方法的重復(fù)性符合要求。

表2 卡巴匹林鈣中尿素重復(fù)性試驗數(shù)據(jù)

表3 卡巴匹林鈣反應(yīng)液中尿素重復(fù)性試驗數(shù)據(jù)

2.11 準(zhǔn)確度考察

2.11.1 卡巴匹林鈣準(zhǔn)確度考察 取卡巴匹林鈣(20181121批，尿素含量為重復(fù)性數(shù)據(jù))0.25 g，分別加入尿素對照品適量，加流動相溶解，配制含尿素對照品濃度為24、32、40、48 μg/mL的供試品溶液。每個濃度水平制備5份平行供試品溶液，分別測定回收率、每個水平濃度下(組內(nèi))的RSD和所有濃度下的RSD。結(jié)果顯示，卡巴匹林鈣中尿素回收率范圍為98.10%～100.46%，組內(nèi)RSD范圍為0.71%～0.93%，平均回收率為99.20%，RSD為0.75%(表4)。

2.11.2 卡巴匹林鈣反應(yīng)液準(zhǔn)確度考察 取卡巴匹林鈣反應(yīng)液(20181121批，尿素含量為重復(fù)性數(shù)據(jù))0.25 g，分別加入0.8 mg/mL尿素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量，配制含尿素對照品濃度為4、20、40、64 μg/mL的供試品溶液。每個濃度水平制備5份平行供試品溶液，分別測定回收率、每個水平濃度下(組內(nèi))的RSD和所有濃度下的RSD。結(jié)果顯示，卡巴匹林鈣反應(yīng)液中尿素回收率范圍為95.32%～101.20%，組內(nèi)RSD范圍為0.97%～1.97%，平均回收率為98.75%，RSD為1.44%(表5)。

表4 卡巴匹林鈣中尿素回收率試驗數(shù)據(jù)

表5 卡巴匹林鈣反應(yīng)液中尿素回收率試驗數(shù)據(jù)

2.12 穩(wěn)定性考察 取20181201批卡巴匹林鈣與卡巴匹林鈣反應(yīng)液供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、16、24 h進(jìn)行測定，測得卡巴匹林鈣中尿素峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%，卡巴匹林鈣反應(yīng)液中尿素峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.13 實際樣品測定 對實驗室尿素規(guī)格13.10%的三批卡巴匹林鈣樣品分別采用本研究建立的檢測方法和紫外-可見分光光度法進(jìn)行檢測，結(jié)果對比如表6所示。

表6 HPLC法與紫外可見分光光度法測定尿素含量結(jié)果比較(n=3)

通過上表數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，紫外-可見分光光度法測定的結(jié)果與本研究的高效液相色譜法相比，偏低且精度較差。

3 討論與結(jié)論

《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》(2017年)中尿素測定方法中衍生試劑為對二甲氨基苯甲醛，其來源不同造成的品質(zhì)差異、存儲過程中易變質(zhì)等問題而且衍生溫度與衍生放置時間等因素易引起數(shù)據(jù)波動，均可能對尿素分析方法的重現(xiàn)性和數(shù)據(jù)的精密度造成影響。另一方面，由于卡巴匹林鈣反應(yīng)液中尿素濃度范圍廣，《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》(2017年)中尿素測定方法并不適用。

卡巴匹林反應(yīng)液供試品溶液中成分復(fù)雜，且甲醇能夠加強(qiáng)其他有機(jī)組分的洗脫，使尿素與相鄰色譜峰分離達(dá)到色譜要求，提高分析方法的重復(fù)性。同時，流動相中含有的適量有機(jī)溶劑能夠延長色譜柱使用壽命。相比于文獻(xiàn)[5,14]中記載的尿素分析方法，本方法采用甲醇-水(5∶95，V/V)為流動相。與文獻(xiàn)[6-7]所采用的熒光檢測器與衍生測定尿素方法不同，采用紫外檢測器進(jìn)行尿素含量的測定，操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬，適合卡巴匹林鈣反應(yīng)液中的尿素檢測。

本研究建立了一種用于檢測卡巴匹林鈣產(chǎn)品及反應(yīng)液中尿素含量的高效液相色譜方法；分離度R≥1.5；線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.999以上；重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.0%；卡巴匹林鈣產(chǎn)品中尿素的回收率范圍為98.10%～100.46%，反應(yīng)液中尿素的回收率范圍為95.32%～101.20%；檢出限為0.05 μg/mL。本方法具有分析時間短、靈敏度高、精確度好等優(yōu)點，填補(bǔ)了國內(nèi)空白；檢測卡巴匹林鈣產(chǎn)品與反應(yīng)液中尿素含量，對產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、中控分析及推廣應(yīng)用均具有重要的指導(dǎo)意義。