利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建GLUT4基因敲減的A549細胞系

趙平, 劉佳, 張穎

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物研究所,武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室&湖北省醫(yī)學(xué)生物國際科技合作基地，武漢430074)

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白是一類跨膜蛋白，每個葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白都有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，螺旋2、5、7和10與D-葡萄糖穿過GLUT蛋白中的空隙有關(guān)，螺旋7的殘基Gln-Leu-Ser被稱為QLS位點，廣泛存在于GLUT蛋白家族中[1].肌肉及脂肪組織中的葡萄糖攝取主要依賴于葡萄糖轉(zhuǎn)運體4 (GLUT4)轉(zhuǎn)運細胞外的葡萄糖通過細胞膜進入細胞.GLUT4對維持體內(nèi)糖平衡及穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，GLUT4在肌肉或脂肪組織中表達的選擇性中斷會誘導(dǎo)全身的胰島素抵抗.

A549細胞是一種人肺腺癌上皮細胞系.它在形態(tài)、結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物組成上與II型肺泡細胞極為相似，后者是一類直徑約9 μm的球形肺泡細胞，主要合成和分泌脂蛋白類物質(zhì)，穩(wěn)定肺泡體積變化，降低其表面張力，其功能異常可能會引起水腫的發(fā)生.因此，A549細胞已被用作研究II型肺泡細胞反應(yīng)的模型[2].另一方面，它作為非小細胞肺癌中的一種，在肺癌研究中具有一定的意義.癌細胞具有不受控的無限增殖及持續(xù)的侵襲與遷移的能力，發(fā)生比正常細胞更多的能量代謝及糖代謝，GLUT4作為葡萄糖傳感器和治療糖尿病的重要靶點，在癌細胞中的作用機制鮮有報道，因此構(gòu)建GLUT4基因敲減的A549細胞系，探討GLUT4基因表達缺失是否會對A549細胞葡糖糖攝取及細胞功能上產(chǎn)生影響很有意義.

CRISPR/Cas9是近年來在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種免疫系統(tǒng)，原本是一種存在于古細菌和細菌中的規(guī)律、成簇的間隔短回文重復(fù)序列，為自身提供特異性保護機制[3].它在各種模式生物以及人類細胞[4]中均表現(xiàn)出較強的基因編輯活性.后對真核細胞中的這種新型CRISPR/Cas系統(tǒng)進行改造，如對Cas9內(nèi)切酶進行了優(yōu)化，使其包括人類細胞的核定位信號，并可合成單個引導(dǎo)RNA(sgRNA)，以針對任何20 bp的DNA序列[5]，從而達到定點基因編輯的目的.

我在新西蘭做獲獎演說時，我講過“文學(xué)是另一種造屋”。寫作就是造屋，第一個層面的造屋是使人們有個安居的地方，讓心靈有一個安頓的地方，作品就是心靈的屋子；第二個層面的造屋是指每個人都向往自由，自由在哪里能實現(xiàn)？是在文學(xué)的這個屋子里實現(xiàn)，因為這個屋子是我的，我可以在這個地方自由地放飛我的思想。從這個意義上講，你想得到的自由，寫作可以滿足你。

基于CRISPR/Cas9技術(shù)，本文擬構(gòu)建GLUT4敲減細胞系，從而對該基因在肺癌細胞中的功能進一步研究.

在NCBI網(wǎng)站上查找并設(shè)計人源GLUT4基因的Real-time PCR引物，找出一組評分最高的引物進行合成.引物序列見表2.利用Trizol提取總RNA，而后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用普通PCR檢測GLUT4基因的Real-time PCR引物是否可用，若GLUT4和β-actin均有條帶，則此GLUT4引物設(shè)計成功，可供后續(xù)使用，反之，則需重新設(shè)計引物.

1.2.6 培訓(xùn)設(shè)施 Laerdal211—00050SinMan高級全功能綜合模擬人心肺復(fù)蘇聽診與腹部觸診仿真電子標(biāo)準(zhǔn)化病人TV8021M3BW44llg心肺音聽診模型、高級綜合穿刺術(shù)與叩診檢查技能訓(xùn)練模擬人MWA496028、3BW44008外科縫合包扎展示模型、高級外科縫合腿肢模型RLDO76O02、無菌技術(shù)操作包、換藥操作包、小型綜合手術(shù)技巧訓(xùn)練模塊、針灸針、火罐、針包、電針、聽診器、叩診錘、直尺、皮尺等。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

A549肺癌細胞(Procell)；Fast DigestBpiI、Fast AP、10X Fast Digest Buffer(Thermo Scientific)；Stbl3感受態(tài)大腸桿菌、10X T4 Ligation Buffer、T4 DNA ligase(武漢淼靈生物)；T4 PNK、10XTaq Buffer、dNTP、rTaq(TaKaRa)；PX458質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific)；Protein Ladder(Thermo)；DTT(Biosharp)；PMSF、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、膠回收試劑盒(AxyGen)；BeyoECL Plus、Tween-20、上樣緩沖液(碧云天)；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；Lipofectamine 3000 (Invitrogen)；甲醇(分析醇)；氯化鈉、甘氨酸、磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈣(國藥集團)；Anti-β-actin、HRP-goat anti mouse IgG(康為世紀(jì))；引物合成、引物合成及基因測序(武漢擎科生物)；Anti-GLUT4(Cell Signaling Technology).

核酸凝膠成像系統(tǒng)、蛋白凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD, USA)；細胞培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股集團)；流式細胞儀(BD公司)；DYY-6C 型電泳儀(北京六一儀器)；冷凍離心機(Eppendorf)；酶標(biāo)儀(Infinite200型，TECAN) ; Real-Time PCR System(7500fast型，Applied Biosystems).

1.2 sgRNA序列的設(shè)計

在NCBI上檢索出人源GLUT4基因的mRNA序列，將位于CDS區(qū)的靠前的幾個外顯子序列依次粘貼至CRISPR在線設(shè)計工具網(wǎng)站http://crispr.mit.edu/，選擇評分最高的sgRNA，根據(jù)PX458載體上BpiI限制酶的酶切位點，在選定的sgRNA序列5′端添加CACCG，對應(yīng)互補鏈的3′端加上C，5′端加上AAAC，設(shè)計出的四個成對的sgRNA序列見表1，PX458質(zhì)粒圖譜見網(wǎng)站http://www.addgene.org/48138/.

表1 GLUT4 sgRNA引物名稱及序列Tab.1 Primename and sequences of GLUT4 sgRNA

1.3 重組表達載體的構(gòu)建與檢測

利用快切酶BpiI對PX458質(zhì)粒的Bbsi位點進行特異性切割，跑膠鑒定后得到線性質(zhì)粒，同時將成對的sgRNA退火成雙鏈，切膠回收后的線性質(zhì)粒及稀釋后的sgRNA雙鏈在T4 DNA ligase 的作用下進行連接[6]，而后通過45 s熱擊轉(zhuǎn)化至stbl3感受態(tài)中，37 ℃過夜培養(yǎng)，將長出來的菌落挑選出一部分，150 r·min-1搖菌，部分保種，而后送測序以鑒定是否構(gòu)載成功.

1.4 細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)約兩周后將細胞轉(zhuǎn)至24孔板里，等到細胞密度長到80%再將細胞轉(zhuǎn)入12孔板中.待到12孔板里細胞長滿，抽提各孔細胞基因組，做好標(biāo)記送測，而后與原始序列進行比對，從而挑選出被編輯的細胞株，擴培后一部分凍存，一部分開展后續(xù)實驗.

1.5 流式細胞儀分選

采用Origin 9.0和 CorelDRAW X4 SP2繪圖，采用t-test 統(tǒng)計數(shù)據(jù).

1.6 基因組提取及測序

A549細胞用含1%雙抗、10%胎牛血清和89% RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)液培養(yǎng)在含5%的CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中.待細胞狀態(tài)生長良好，使用Lip 3000進行轉(zhuǎn)染，按說明書進行操作.將細胞傳代至六孔板中，待細胞生長達到80%的匯合率進行實驗.先使用opti-MEM培養(yǎng)基饑餓細胞，再配制125 μL opti-MEM、2.5 μg質(zhì)粒和5 μL P3000的混合液，以及125 μL opti-MEM、3.75 μL Lipo-3000的混合液，分別靜置5 min后，輕輕混勻.再靜置5 min后，加入細胞中，3 h后換RPMI培養(yǎng)基，24 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞發(fā)出熒光的狀態(tài).

1.7 Real-time PCR檢測mRNA水平敲減效率

第一，把好選苗關(guān)。種龜試蛋產(chǎn)出的苗和病龜產(chǎn)蛋孵化出的龜苗都會出現(xiàn)體質(zhì)較弱的特點，在飼養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)問題；年輕種龜苗抗病能力低，老種龜苗為上選；最傻瓜的方法：買大不買小，還要搞清楚是自然孵化出的還是加溫孵化出的，前者抗病能力強。

取八連排離心管，按照如下體系配好(5×Real-time PCR mix 10 μL，Primer-R 1 μL，Primer-F 1 μL，Template 7 μL，H2O 20 μL)，放入Real-time PCR儀中，得到所測量的數(shù)據(jù)，實驗重復(fù)3次.

表2 Real-time PCR引物列表Tab.2 Real-time PCR primer list

1.8 Western Blot檢測蛋白水平敲減效率

待野生型A549細胞株與GLUT4基因敲減細胞株生長達到90%的匯合率時，提取細胞總蛋白，用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配完膠后，點樣，濃縮膠80 V/40 min，分離膠100 V /1.5 h，后在100 V電壓下轉(zhuǎn)膜1 h，置于5% BSA溶液中封閉1 h，敷一抗過夜，每10 min 用PBST洗膜，3次后敷二抗1 h，最后再3次PBST及2次PBS清洗后，通過ECL顯影觀察條帶，實驗重復(fù)3次.

1.9 激光共聚焦顯微鏡檢測葡萄糖攝取水平變化

待野生株與突變株細胞長滿后，用胰酶消化下來，用1 mL培養(yǎng)液富集消化的細胞，棄850 mL的細胞懸液，留150 mL的細胞懸液備用.在剩余的150 mL溶液中加入3 mL的培養(yǎng)液進行稀釋.用鑷子將浸泡在酒精中備用的載玻片取出，放在酒精燈上烘干，放置在玻璃培養(yǎng)皿的中央，取1 mL的稀釋過后的培養(yǎng)液，在載玻片的中央緩慢的將培養(yǎng)液加入到載玻片上，每一株細胞做3組平行.待細胞生長至16 h時，用5 mL PBS沖洗載玻片， 10 mL PSS溶液饑餓細胞2 h，再將載玻片安置于載物臺上，加入200 μL 濃度為100 mM的2-NBDG熒光染料，暗處孵育1 h.使用Confocal顯微鏡觀察并圈取60株細胞記錄細胞,熒光量并進行數(shù)據(jù)分析.

《村民委員會組織法》中沒有規(guī)定具體的監(jiān)督操作流程。由于集體經(jīng)濟組織資源，尤其是土地資源非常稀缺，如果仿照公司結(jié)構(gòu)模式運行，那么必須設(shè)置監(jiān)督委員會，否則村民利益會經(jīng)常受到侵害。

1.10 統(tǒng)計分析

細胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后，用胰酶將其消化下來，用含1% FBS的PBS重懸細胞，再將其濾過300目流式膜并收集于已滅菌的流式管中，以轉(zhuǎn)入空載的細胞作為對照調(diào)節(jié)電壓等參數(shù)，激發(fā)波長488 nm，而后將單個的轉(zhuǎn)染后發(fā)綠色熒光的細胞分別打到每個孔事先加入了200 μL的含20%的血清和2%雙抗的培養(yǎng)基的96孔板中.

高度集成化的E-HOUSE功能，使其優(yōu)于傳統(tǒng)的土建式電氣室，既降低了成套設(shè)備對現(xiàn)場環(huán)境、對土建施工與設(shè)備配套的要求，又縮短了現(xiàn)場設(shè)備集成和調(diào)試的工期。同時，其靈活的拆裝性能更方便于日后的站內(nèi)改造工程，可以根據(jù)需要改變其位置，僅需重新施工基礎(chǔ)即可。

2 結(jié)果

2.1 細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

將標(biāo)記好的各株單克隆細胞抽提基因組測序后，與GLUT4基因原始序列進行比對，結(jié)果如圖2顯示，只有3-6對細胞產(chǎn)生了明顯的編輯，峰圖也可見明顯的套峰.

a,c)明場下視野(10×)；b,d)熒光下視野(10×)圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549細胞Fig.1 A549 cells transfected by plasmid

2.2 構(gòu)建敲減GLUT4基因的A549細胞株

利用lipo3000將測序比對后構(gòu)建成功的重組載體PX458-sgRNAS1、S2、S3、S4分別轉(zhuǎn)進A549細胞里，24 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染效率，如圖1所示，由綠色熒光細胞分布密度可反映空載及重組載體均以較高效率成功轉(zhuǎn)入到A549細胞中.

圖2 PX458-sgRNA-S1的序列比對及峰圖Fig.2 Sequence alignment and peak map of PX458-sgRNA-S1

2.3 Real-time PCR檢測表明突變株GLUT4基因mRNA表達量顯著降低

首先，我們根據(jù)他電話中提供的個人信息，核實了他是本單位在冊在崗員工，查詢到了他所在的作業(yè)單元。緊接著，我們聯(lián)系了具體負責(zé)該項事務(wù)的勞資員，說明了有關(guān)情況。負責(zé)他所在作業(yè)單元勞資工作的員工雖顯緊張，但積極且迅速地配合了我們的工作。她先查詢了她負責(zé)的工資表情況，核實無誤，又致電了對接其工作的財務(wù)人員，確認工資已上賬，便立馬將情況反饋給我們。

對野生株和突變株這兩株細胞中的GLUT4基因的mRNA的表達含量進行了檢測(圖3)，這是對基因敲減效果的初步鑒定，由mRNA表達含量的減少可知基因敲減作用十分明顯，圖3中與野生株相比，3-6的GLUT4基因的mRNA表達量減少了約75%，結(jié)果由3次獨立重復(fù)實驗獲得，可進一步進行蛋白質(zhì)含量的鑒定.

狗子還不肯離開。雪螢想了想，掏出50元錢遞給他，“去，買糖吃，錢沒花完不準(zhǔn)回來找阿姨。”狗子高興得跳了起來，抓過錢跑下了樓。

圖3 Real-time PCR檢測突變株GLUT4基因的mRNA表達量Fig.3 Detection of GLUT4 gene mRNA expression by Real-time PCR

2.4 Western blot檢測表明突變株細胞GLUT4蛋白表達水平降低

將篩選出來的被編輯的突變株細胞提蛋白后，與野生型A549細胞做對比，檢測其蛋白水平表達的變化，結(jié)果如圖4，統(tǒng)計圖由3次重復(fù)獨立實驗獲得.由圖4可知：3-6細胞GLUT4蛋白的表達減少了85%，證明已經(jīng)成功的獲得了GLUT4基因敲減的A549細胞株.

圖4 Western blot 檢測3-6與WT的蛋白表達差異Fig.4 Difference of protein expression between 3-6 and WT detected by Western blot

2.5 GLUT4敲減細胞株的葡萄糖攝取水平顯著降低

使用激光共聚焦顯微鏡對貼片培養(yǎng)并孵育1 h 熒光染料2-NBDG的野生型A549細胞和突變型細胞進行葡萄糖攝取水平測定，并分別圈取視野下的60株細胞，對其熒光強度取均值，再用t檢驗比較兩組間的差異性，對應(yīng)的顯微觀測圖以及熒光強度情況見圖5.從圖5可見：3-6細胞的熒光強度弱于野生型A549細胞，3-6細胞的平均熒光強度為5.6958，野生型A549細胞的平均熒光強度為9.55845，即3-6細胞的葡萄糖攝取量低于野生型A549細胞.

圖5 激光共聚焦顯微術(shù)檢測葡萄糖攝取量Fig.5 Glucose uptake detected by Confocal

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)是近些年快速發(fā)展起來的基因編輯技術(shù).在此之前，鋅指核酸酶(ZFN)和TALEN技術(shù)分別占據(jù)了基因編輯技術(shù)的半壁江山.這兩種基因敲除的方法主要是通過在DNA靶位點或者附近產(chǎn)生雙鏈斷裂之后，通過DNA的非同源性修復(fù)雙鏈斷裂來完成的[7,8].上述兩種基因敲除的方法雖然成熟，但是步驟復(fù)雜，且基因敲除體系太大.然而CRISPR/Cas9則是針對目的基因設(shè)計特異性的sgRNA，后利用Cas9蛋白對靶序列進行切割從而達到編輯基因的目的[9]，具有更低的成本、更簡單的操作方法和更高效的編輯效率等優(yōu)點.

GLUT4在調(diào)節(jié)全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[10].研究表明，大網(wǎng)膜脂肪組織中GLUT4的表達量可能會成為結(jié)直腸癌診斷的有利生物標(biāo)志物和預(yù)測靶點[11].結(jié)腸癌患者NK細胞中GLUT4表達量的減少是引起這些細胞功能失活的關(guān)鍵原因[12].GLUT4的缺失會損害乳腺癌細胞的增殖，并在低氧條件下嚴重影響細胞活力[13].另外，開發(fā)GLUT4選擇性抑制劑可作為抗癌治療藥物[14]，一些能夠通過抑制GLUT4蛋白來調(diào)節(jié)癌細胞葡萄糖消耗的植物化學(xué)物質(zhì)也漸漸被研究去作為新的治療癌癥的治療候選藥物.為了確定GLUT4對肺癌細胞正常代謝生理的作用，本文選擇A549肺癌細胞來開展研究.先成功構(gòu)建了pX458-sgRNA表達載體，篩選得到了一株編輯情況最好的突變株細胞3-6，對其mRNA表達量和蛋白質(zhì)表達含量的測定均檢驗到了較大程度的敲減效果，3-6細胞株mRNA表達量減少了約83%，GLUT4蛋白表達量減少約85%.GLUT4基因敲減的3-6突變細胞株所發(fā)出的熒光沒有野生型A549細胞的熒光強，說明3-6細胞的葡萄糖攝取量比正常的A549細胞低很多.實驗證明：GLUT4基因的敲減對于A549細胞中GLUT4基因mRNA及蛋白的表達量產(chǎn)生了明顯的表型影響，并且敲減后的突變細胞株在葡萄糖攝取水平上發(fā)生了明顯的降低，這對肺癌及哮喘的研究開辟了新的方向，通過抑制葡萄糖的攝取，來降低細胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)，起到保護肺部和氣管細胞的作用.

綜上所述，本文構(gòu)建了GLUT4基因敲減的細胞系，為其在肺癌細胞中基因功能研究提供了工具和方法，為后續(xù)深入研究其對肺癌細胞功能的影響奠定了基礎(chǔ).