咪達(dá)唑侖對人肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制效應(yīng)及機(jī)制

焦晶華,王宇恒,孫曉峰

(沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 麻醉科,遼寧 沈陽,110024)

肺癌是世界范圍內(nèi)較為常見的癌癥，其發(fā)病率和致死率均居首位，嚴(yán)重危害人類的健康[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%,手術(shù)仍是治療NSCLC的首選方案。NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移十分常見，通常需要配合化療，但化療產(chǎn)生的副作用和效果的不確定性是影響患者生存質(zhì)量的主要原因。咪達(dá)唑侖是γ-氨基丁酸A(GABAA)受體激動(dòng)劑，廣泛用于術(shù)前鎮(zhèn)靜。既往研究[2]揭示咪達(dá)唑侖等麻醉藥物可能影響癌細(xì)胞的生物活性，具有作為潛在的癌癥治療性藥物的可能性，作者前期體外研究發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖可以顯著抑制A549細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，但咪達(dá)唑侖對肺癌細(xì)胞的體內(nèi)作用及機(jī)制尚不清楚。本研究分析咪達(dá)唑侖對人NSCLC-A549細(xì)胞的體內(nèi)研究結(jié)果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 材料

人肺腺癌A549細(xì)胞;BALB/c雄性裸鼠20只,6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g,無特定病原體(SPF)級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。RPMI 1640培養(yǎng)基等購自Hyclone公司;咪達(dá)唑侖購自江蘇恩華藥業(yè)有限公司;細(xì)胞核和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、Ki-67抗體、SDS.PAGE凝膠配制試劑盒均購自碧云天生物工程有限公司;二甲基亞砜、β-actin抗體購自Sigma公司。

1.2 動(dòng)物模型建立

將A549細(xì)胞于DMEM/Ham′s F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng),0.25%胰酶消化傳代;取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化，離心，收集底部細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×107/mL,抽取細(xì)胞懸液0.2 mL接種于BALB/c裸鼠腋部皮下，構(gòu)建裸鼠肺癌移植瘤模型。

1.3 分組及給藥

接種后密切觀察裸鼠生長情況和移植瘤變化，待移植瘤長徑大于5.0 mm時(shí)判定為成瘤。共12只裸鼠成瘤成功，按移植瘤體積隨機(jī)分為咪達(dá)唑侖組與對照組，每組6只。咪達(dá)唑侖組腹腔注射0.5 mL(0.8 mg/kg)咪達(dá)唑侖，每日同一時(shí)間給藥1次，連續(xù)20 d;對照組腹腔注射0.5 mL生理鹽水，用法同咪達(dá)唑侖組。連續(xù)記錄裸鼠體質(zhì)量，腫瘤體積。20 d后處死裸鼠，剝離移植瘤并稱濕重，石蠟包埋，切片以備免疫組化(IHC)分析用。留取部分新鮮腫瘤組織，研磨用于提取蛋白，蘇木精-伊紅染色法(HE染色)觀察腫瘤病理學(xué)變化;TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡。抑瘤率(%)=(對照組平均瘤重-咪達(dá)唑侖組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。移植瘤體積按公式V=(π/6)×(L×W2)計(jì)算，其中V指腫瘤體積，L指腫瘤長徑,W指腫瘤寬徑。

1.4 IHC檢測移植瘤組織中Ki 67的表達(dá)

采用兔兩步法進(jìn)行IHC染色，以0.01 mol/L PBS作為陰性對照;20%羊血清孵育;添加一抗，孵育2 h;PBS沖洗;添加Envision;PBS沖洗;滴加3′3-DAB,10 min后顯微鏡觀察至組織顯色;隨機(jī)采集5個(gè)不重疊視野(放大倍率100倍)，導(dǎo)入MIQAS免疫組化分析系統(tǒng)，棕黃色顆粒為Ki-67陽性表達(dá)，其定位于細(xì)胞核[3],計(jì)數(shù)Ki-67陽性細(xì)胞和總細(xì)胞[4],陽性細(xì)胞率(%)= Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 Western-blot檢測信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)的表達(dá)

磨碎移植瘤組織，加入裂解液靜置30 min,離心，收集上清，采用分光光度計(jì)測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，電泳，蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，抗STAT3抗體(1∶200)雜交，洗膜,37 ℃二抗(1∶5 000)雜交2 h。顯影，拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，雙尾檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 咪達(dá)唑侖對移植瘤生長的抑制作用

20 d時(shí)，咪達(dá)唑侖組移植瘤體積為(0.52±0.12) cm3,顯著小于對照組的(0.84±0.25) cm3(P<0.01);20 d時(shí)，咪達(dá)唑侖組移植瘤質(zhì)量為(0.51±0.21) g,顯著低于對照組的(0.79±0.31) g (P<0.05)。20 d時(shí)咪達(dá)唑侖組抑瘤率為33.3%。見圖1。

2.2 HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，對照組瘤細(xì)胞排列紊亂，核異型性明顯，染色深，核分裂像增多。咪達(dá)唑侖組可見瘤細(xì)胞核濃縮，排列松散，胞質(zhì)呈嗜酸性。見圖2。

2.3 TUNEL染色

對照組瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)為(6.87±2.35) %,咪達(dá)唑侖組瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)為(14.58±4.01) %,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 移植瘤組織Ki-67的變化

咪達(dá)唑侖組Ki-67陽性細(xì)胞率為(55.44±6.16) %,低于對照組(81.34±4.13) %,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:對照組;B:咪達(dá)唑侖組。

圖2 對照組與咪達(dá)唑侖組HE染色結(jié)果(放大倍數(shù)100倍)

A:對照組;B:咪達(dá)唑侖組。

圖3 對照組與咪達(dá)唑侖組瘤細(xì)胞凋亡情況(放大倍數(shù)400倍)

2.5 裸鼠肺癌移植瘤腫瘤組織STAT3蛋白的表達(dá)

采用Western-blot技術(shù)檢測2組腫瘤組織中STAT3蛋白的表達(dá)，與對照組相比，咪達(dá)唑侖組STAT3蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖4。

3 討 論

研究[5]提示麻醉藥物可能具有潛在的抗腫瘤效應(yīng)，作者前期的體外研究已發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖可以顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，但是其在體內(nèi)模型的效應(yīng)尚不清楚。為了評(píng)價(jià)咪達(dá)唑侖在體內(nèi)對肺癌組織的作用效果，本研究采用國際上較為常用且相對簡單的移植瘤BALB/c裸鼠模型加以證實(shí)[6],BALB/c裸鼠腋部皮下可以為肺癌的生長提供良好的介質(zhì)，將A549細(xì)胞直接接種在此處有利于肺癌組織的生長;實(shí)驗(yàn)中設(shè)定的咪達(dá)唑侖給藥劑量0.8 mg/kg是參照文獻(xiàn)[7]及多次預(yù)實(shí)驗(yàn)后確定。

本研究結(jié)果顯示，咪達(dá)唑侖干預(yù)后,A549肺癌移植瘤質(zhì)量和體積得到了顯著抑制，計(jì)算后抑瘤率為33.3%。HE染色可見對照組移植瘤細(xì)胞排列紊亂，核異型性明顯，染色深，核分裂像增多;咪達(dá)唑侖組可見瘤細(xì)胞核濃縮，排列松散，胞質(zhì)呈嗜酸性。這一結(jié)果表明在形態(tài)學(xué)上，咪達(dá)唑侖對A549肺癌移植瘤BALB/c裸鼠腫瘤組織有明顯的抑制作用。

IHC技術(shù)在腫瘤診斷和鑒別診斷中具有重要作用，準(zhǔn)確率可達(dá)50%～75%[8-9]。在IHC技術(shù)中，通常以Ki-67作為細(xì)胞增殖的一種標(biāo)記[10],Ki-67即Ki-67抗原，編碼人類Ki-67蛋白的基因，通常可以在細(xì)胞周期的G1、S、G2、M期表達(dá)，但在G0期缺如。作為一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)，參與許多腫瘤細(xì)胞分化、浸潤和轉(zhuǎn)移的過程[11-17]。本研究利用IHC技術(shù)檢測裸鼠移植瘤組織中Ki-67的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖可以顯著抑制肺癌移植瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)移植瘤細(xì)胞凋亡，證實(shí)咪達(dá)唑侖可以在體內(nèi)抑制人肺癌細(xì)胞的生長。

STAT家族是潛在的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)記，可以為許多細(xì)胞因子和生長因子提供轉(zhuǎn)導(dǎo)。STAT3是龐大的STAT家族中的主要成員之一，目前已知STAT3可以在多種腫瘤疾病或免疫性疾病中被激活。作者前期的體外研究[2]發(fā)現(xiàn)，咪達(dá)唑侖可以影響STAT3相關(guān)通路的正常表達(dá)，從而發(fā)揮抗肺癌的效應(yīng)。本研究仍選取STAT3作為靶向分子標(biāo)記，分析咪達(dá)唑侖體外抗腫瘤細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制，與前期研究結(jié)果一樣，作者發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖可以顯著下調(diào)STAT3蛋白水平。

本研究利用體外建模證實(shí)咪達(dá)唑侖可以抑制A549移植瘤，但本研究也有一定的局限性，如利用單一的給藥劑量(0.8 mg/kg)尚不足以分析咪達(dá)唑侖干預(yù)肺癌的劑量效應(yīng)關(guān)系;本研究的樣本量相對較小;本研究僅建立了移植瘤一種模型，對于轉(zhuǎn)移瘤的效應(yīng)還有待于進(jìn)一步的證實(shí);本研究設(shè)計(jì)的對照組為生理鹽水，咪達(dá)唑侖抗肺癌的效應(yīng)是否優(yōu)于已知的抗腫瘤藥物同樣有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，咪達(dá)唑侖可以影響STAT3的表達(dá)，從而顯著抑制A549肺癌移植瘤BALB/c裸鼠腫瘤細(xì)胞生長。