賈明璐，王靜，田會(huì)東，陳雪平，王瑞*

(1.漯河市中心醫(yī)院，河南 漯河 462000;2.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462000)

在臨床上，將兩味藥一起應(yīng)用往往能起到良好的協(xié)調(diào)或制約作用，這種在臨床最習(xí)用的兩味藥就是藥對(duì)，也稱“對(duì)藥”[1]。藥對(duì)不是兩味藥的簡(jiǎn)單疊加，而是歷代醫(yī)藥學(xué)家用藥經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)提煉和智慧結(jié)晶，是中醫(yī)用藥的特色之一[2]。

三七是五加科植物三七的干燥根，常用于治療冠心病、糖尿病、心絞痛等[3]；黃連是毛茛科植物黃連的干燥根莖，具有抗氧化、降壓與降血糖的作用[4]。二者合用，具有清熱燥濕、益氣生津之功效，是治療“消渴”的典型代表藥對(duì)。研究表明，兩種藥材配伍后易產(chǎn)生相互作用，或產(chǎn)生助溶或產(chǎn)生沉淀，使有效成分溶出率發(fā)生變化，從而影響療效[5]?；钚猿煞秩艹雎孰S配伍比例變化規(guī)律是中藥復(fù)方一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容[6-7]。然而，三七-黃連的最佳配伍比例尚無相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了9個(gè)配伍比例(1∶0、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、0∶1)參照《中華人民共和國(guó)藥典》[8]質(zhì)量要求，研究三七與黃連的配伍比例對(duì)三七中3個(gè)組分溶出率的影響，并從化學(xué)成分角度考察最佳配比，為三七-黃連藥對(duì)的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

島津LC-20A高效液相色譜儀(DGU-20A3R在線脫氣系統(tǒng)、全波長(zhǎng)色譜工作站、SPD-M20A光電二極管陣列紫外可見光檢測(cè)器，日本島津公司)；SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CT0-20AC柱溫箱(日本島津公司)；16K臺(tái)式高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；SB25-12D超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；JY電子分析天平(上海衡平儀器儀表廠)；Milli-Q純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào):110745-201820，純度93.1%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào):GSB-107939，純度98.34%，斯坦福分析化學(xué)公司)、人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)：GSB-705891，純度99.87%,斯坦福分析化學(xué)公司)；三七和黃連均購(gòu)自安徽瑞生源中藥飲片有限公司，經(jīng)本醫(yī)院中藥房田正印主任鑒定為五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根及根莖和毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch)的干燥根莖。

乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)；甲醇(色譜純，科密歐)；乙醇(分析純，大茂)；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm )；流動(dòng)相為乙腈(B)-水(A)，線性梯度洗脫(0～25 min，2%→20% B；25～50 min，20%→45% B；50～60 min，45%→70% B；60～65 min，70%B；65～70 min，70%→2% B)；流速:1.0 mL/min；柱溫:35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm；進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備

精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1適量，甲醇溶解定容于25 mL容量瓶中，搖勻，制成含三七皂苷R10.362 mg/mL,人參皂苷Rg11.350 mg/mL、人參皂苷Rb11.400 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備

分別按表1稱取三七、黃連兩味藥材粗粉，置于500 mL圓底燒瓶中，加20倍量60%乙醇，加熱回流2 h，稱重，補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，濾液置于離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液，加水稀釋1倍，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得，避光低溫保存。

表1 各配伍比例藥材稱取量

2.3 HPLC檢測(cè)色譜圖

分別取上述溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，色譜圖見圖1。

2.4 線性考察

分別量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻。精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定分析。以濃度(mg/mL)為X坐標(biāo)，峰面積為Y坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。結(jié)果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在各自濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。如表2所示。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.31%、0.57%、0.78%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下三七與黃連之比為1:1供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1峰面積RSD值分別為1.93%、 1.05%、1.68%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

注：1三七皂苷R1；2人參皂苷Rg1；3人參皂苷Rb1圖1 混合對(duì)照品(A)、黃連陰性對(duì)照品(B)、三七陰性對(duì)照品(C)、樣品(D)的HPLC色譜圖

表2 3個(gè)成分的回歸方程、r值及線性范圍

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備三七與黃連之比為1∶1的供試品溶液6份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下檢測(cè)。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1平均溶出率分別為1.14%、3.46%、1.12%，RSD分別為1.98%、1.31%、1.51%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

平行量取1.0 mL含量已知的三七與黃連之比為1∶0供試品溶液，共9份，分別精密加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液制備加樣供試品溶液(每個(gè)濃度3份)，按照“2.2.2”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，測(cè)定三者的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率分別為 97.3%、99.7%、102.2%，RSD分別2.96%、0.92%、1.97%，符合加樣回收規(guī)定。

2.9 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果

2.9.1 有效成分溶出率

按三七-黃連藥對(duì)9個(gè)不同比例精密稱取藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，計(jì)算不同配比條件下3種有效成分的溶出率，結(jié)果見圖2～圖4和表3。圖2和圖3顯示，隨著藥對(duì)中黃連比例的提高，三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的溶出率隨之增加；當(dāng)三七和黃連的比例為1∶2時(shí)，三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的溶出率最高，但隨著黃連比例的繼續(xù)增加，二者的溶出率迅速降低；圖4顯示，隨著藥對(duì)中黃連比例的提高，人參皂苷Rb1的溶出率隨之增加，當(dāng)三七與黃連比例為2∶1時(shí)，人參皂苷Rb1的溶出率最高，隨著黃連比例的繼續(xù)增加，Rb1的溶出率隨之降低。當(dāng)藥對(duì)比例為1∶3或1∶4時(shí)三者的溶出率都很低，均低于配伍前。

圖2 三七皂苷R1溶出率

圖3 人參皂苷Rg1溶出率

圖4 人參皂苷Rb1溶出率

2.9.2 總?cè)艹雎士疾?/p>

以藥對(duì)中3個(gè)有效成分為考察指標(biāo)，采用Hassan法進(jìn)行“歸一化法”數(shù)據(jù)處理[9]，求得各指標(biāo)“歸一值”，公式見(1)。其中Ymin為指標(biāo)中最小值，Ymax為指標(biāo)中最大值。

di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

(1)

然后，對(duì)各指標(biāo)的“歸一值”進(jìn)行處理，得總評(píng)“歸一值”(Overall desirability，OD)，其值越大越好，公式見(2)，其中k為指標(biāo)數(shù)，結(jié)果見表3。由表4可知，當(dāng)三七與黃連比例為2∶1時(shí)，最有利于3種有效成分的溶出，其次是3∶1，而比例為1∶4時(shí)，三者的溶出率最差。

OD=(d1×d2…×dk)1/k

(2)

表3 不同配伍比例下3個(gè)成分的溶出率(n=3)

表4 不同配比下3種成分的OD值

3 討論

采用三七和黃連配伍輔助治療2型糖尿病是我科經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用已有多年，療效確切，然而兩種藥材的最佳配比一直未從化學(xué)成分角度加以實(shí)驗(yàn)考察。皂苷類成分是三七中的主要活性成分，目前從三七中分離出鑒定出的達(dá)瑪烷型皂苷多達(dá)70余個(gè)[10]，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1被《中華人民共和國(guó)藥典》列為三七藥材質(zhì)控指標(biāo)，因此，本研究選取這3個(gè)成分設(shè)置系列配伍梯度進(jìn)行最佳配比的考察。據(jù)報(bào)道，三七中總皂苷的提取醇提優(yōu)于水提，60%乙醇回流2 h提取最佳[11-12]。鑒于此，本研究在此條件下，設(shè)計(jì)了不同配比黃連三七中3個(gè)皂苷溶出率變化規(guī)律的考察實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著藥對(duì)中黃連比例的增加，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的溶出率隨之增加，在達(dá)到各自最大溶出率后隨著黃連比例的繼續(xù)增加，溶出率然而降低。當(dāng)藥對(duì)比例為1∶3或1∶4時(shí)三者的溶出率都很低，均低于配伍前。煎煮過程對(duì)中藥復(fù)方臨床應(yīng)用和發(fā)揮藥效有重要作用，不同藥材在共同提取過程中化學(xué)成分之間可能發(fā)生助溶、揮發(fā)、水解、氧化、沉淀等復(fù)雜物理或化學(xué)作用，從而使某些化學(xué)成分的溶出增加、減少或消失，表現(xiàn)出不同的藥理活性[13]。中醫(yī)素有“不傳之秘在于量”的說法，藥量多少可影響其藥力，配伍的不同可影響其藥效[14]。三七的主要活性成分是皂苷類，黃連的活性成分主要是生物堿類，皂苷是一種很好的表面活性劑，往往對(duì)其他物質(zhì)有助溶現(xiàn)象。這就提示三七對(duì)黃連中化學(xué)成分的溶出可能也有重要影響，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中將繼續(xù)探討。

據(jù)研究報(bào)道[15]，當(dāng)實(shí)驗(yàn)考察指標(biāo)超過1個(gè)時(shí)，指標(biāo)之間往往互相影響，對(duì)其中一項(xiàng)指標(biāo)有利的方案可能不利于其他指標(biāo)，最終確定的方案要依據(jù)所有指標(biāo)的綜合效應(yīng)。為了使3個(gè)考察指標(biāo)之間具有加和性，筆者采用Hassan法進(jìn)行“歸一化法”數(shù)據(jù)處理，然后對(duì)各指標(biāo)的“歸一值”求幾何平均數(shù)得總評(píng)“歸一值”(Overall desirability，OD)，以O(shè)D值表達(dá)最終效應(yīng)，從而將3個(gè)考察指標(biāo)綜合起來。通過計(jì)算不同配伍比例條件下3種成分溶出率的總評(píng)歸一值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)三七與黃連配伍比例為2∶1時(shí)，三者的總?cè)艹雎首畲螅?∶4配比時(shí)，最不利于3個(gè)有效成分的溶出。三七-黃連配伍比例為2∶1較合理。

本研究通過比較黃連-三七藥對(duì)不同配伍比例三七中3個(gè)有效成分溶出率的變化，可以為黃連-三七藥對(duì)配伍化學(xué)本質(zhì)的揭示提供依據(jù)，在下一步的研究中，將從藥效學(xué)視角[16-17]進(jìn)一步考察，從而為臨床黃連-三七藥對(duì)的使用提供參考依據(jù)。