季傳婷，虎力，梁永瑛，溫佩彤，徐平

(1.上海市徐匯區(qū)漕河涇街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，上海 200235；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,上海 201203；3.上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200052)

失重條件下，人或動(dòng)物的骨骼肌特別是抗重力肌會(huì)出現(xiàn)明顯的萎縮，嚴(yán)重影響正常的功能活動(dòng)。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，肌肉發(fā)生的一系列變化特別是分子機(jī)制的變化目前還在不斷探索中，F(xiàn)oxo3a(Forkhead Box O3a)屬叉頭轉(zhuǎn)錄因子的O亞型，是 Foxo亞家族的成員之一[1]。廣泛表達(dá)于各種組織器官，如骨骼肌、心、腦、胰腺、肺、肝、腎、脾、小腸、外周血白細(xì)胞等[2-3]，有抑制細(xì)胞增殖的作用。鑒于電針在臨床上對(duì)于多種原因?qū)е碌墓趋兰∥s的有效性和本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針干預(yù)能夠影響尾部懸吊小鼠形態(tài)學(xué)等改變[4]，因此本研究仍以電針為干預(yù)措施，對(duì)尾部懸吊小鼠比目魚肌的Foxo3a進(jìn)行檢測，從而探討Foxo3a在電針干預(yù)失重性骨骼肌萎縮中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性C57小鼠，SPF清潔級(jí)，共28只，體質(zhì)量18～22 g，購于斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司(上海)，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005，動(dòng)物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的各種處理均按照科技部2006年的關(guān)于動(dòng)物的使用及倫理學(xué)規(guī)定進(jìn)行。將動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、尾吊組、提前電針組和電針組，每組7只。

1.1.2 主要儀器與試劑

Varifuge 3.0RS高速離心機(jī)(德國Heracus)；MK3酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan)；PS-9電轉(zhuǎn)儀(大連競邁科技有限公司)；mini protean 3 cell電泳儀(BIO-RAD公司)； Foxo3a(美國CST公司)；cDNA合成試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型的建立

用醫(yī)用膠帶固定距離動(dòng)物尾尖部約2～3 cm處,固定處連接鐵鏈，鐵鏈懸吊于單籠頂部，調(diào)整鐵鏈高度使小鼠前肢著地，并可自由活動(dòng)，但不能夠及垂直的四壁(單籠體積45 cm×40 cm×30 cm)而后肢懸空，身體的長軸與籠底平面呈30°～35°角(參照陳杰等[5]改良式大鼠尾部懸吊法建立)。

1.2.2 分組干預(yù)

正常組全程常規(guī)飼養(yǎng)；尾吊組前14 d常規(guī)飼養(yǎng)，后14 d尾部懸吊造模；提前電針組在尾吊組處理基礎(chǔ)上于前14 d加用每天電針；電針組在尾吊組基礎(chǔ)上于后14 d加入每天電針干預(yù)。電針每日1次，每次15 min。

電針方法：自制與水平面呈30°角的平臺(tái)，固定小鼠于平臺(tái)上，頭部在下、下肢在上。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]穴位定位，選取小鼠雙側(cè)“足三里”“陽陵泉”進(jìn)行針刺。選用0.25 mm×25 mm啟舟牌針灸針，直刺，進(jìn)針深度約3～4 mm，接電針(SDZ-Ⅱ型蘇州醫(yī)療用品廠電子針療儀)，負(fù)極接 “足三里”穴，正極接同側(cè)的“陽陵泉”穴，電流1 mA，連續(xù)波，頻率為20～30 Hz，強(qiáng)度以小鼠的四肢輕微抖動(dòng)為度。每日電針1次，每次為15 min，連續(xù)治療14 d。

1.3 觀察指標(biāo)與檢測方法

結(jié)束實(shí)驗(yàn)后，各組小鼠脫頸處死,快速取左側(cè)比目魚肌,立即置于-80 ℃液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 Western blot法檢測Foxo3a

將液氮保存的比目魚肌取出，加蛋白裂解液后碾磨,并用離心機(jī)離心,取上清后調(diào)至統(tǒng)一濃度，高溫下變性4 min后用12%PAGE電泳；轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上(半干轉(zhuǎn)1 h 30 min)； PBS洗膜,滴加一抗(Foxo3a 1∶1 000；β-actin 1∶10 000)，4 ℃下2 h；加兔二抗，加入發(fā)光劑后曝光顯影。結(jié)果應(yīng)用Quantity One軟件分析。設(shè)β-actin作為內(nèi)參。

1.3.2 Foxo3a的Real-time PCR檢測

取部分液氮保存比目魚肌，提取總RNA，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；以SYBR Green作熒光染料，5 min 95℃預(yù)變性、15 s 95℃變性、60℃持續(xù)45 s退火及延伸，上述過程循環(huán)40次，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行Foxo3a、β-actin PCR擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，以系統(tǒng)自帶的ABI Prism 7500 SDS軟件進(jìn)行結(jié)果分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠Foxo3a蛋白表達(dá)

尾吊組與正常組比較Foxo3a蛋白的表達(dá)增加(P<0.05)；電針組與提前電針組及尾吊組相比Foxo3a蛋白表達(dá)減少(P<0.05)，但較正常組仍高(P<0.05)；電針組與提前電針組之間差異不明顯。見圖1、圖2和表2。

注：1電針組；2尾吊組；3正常組；4提前電針組圖1 各組小鼠Foxo3a蛋白表達(dá)條帶

注：與正常組比較，*P#P圖2 各組小鼠Foxo3a蛋白表達(dá)比較

表2 各組小鼠比目魚肌Foxo3a蛋白表達(dá)比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與尾吊組比較，#P<0.05。

2.2 各組小鼠Foxo3a mRNA表達(dá)

尾吊組與正常組Foxo3a mRNA比較明顯增高(P<0.05)；，電針組和提前電針組與尾吊組相比Foxo3a mRNA明顯降低(P<0.05)，但較正常組仍高(P<0.05)；電針組與提前電針組之間差異不明顯。見圖3、表3。

注：與正常組比較，*P#P圖3 各組小鼠比目魚肌Foxo3a mRNA表達(dá)比較

表3 各組小鼠比目魚肌Foxo3a mRNA表達(dá)比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與尾吊組比較，#P<0.05。

3 討論

針灸在治療多種骨骼肌萎縮中具有很好療效，如李敏等針灸治療經(jīng)肌電圖證實(shí)坐骨神經(jīng)損傷性麻痹性肌萎縮等療效顯著，能有效延緩肌肉萎縮，促進(jìn)神經(jīng)再生等[7-9]，本研究在前人研究和本課題前期發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上，繼續(xù)以電針對(duì)尾部懸吊的模擬失重小鼠模型進(jìn)行了干預(yù)。

選穴方面，《黃帝內(nèi)經(jīng)》載“陽明者，五臟六腑之海，主潤宗筋，宗筋主束骨而利關(guān)節(jié)也。沖脈者，經(jīng)脈之海也，主滲灌溪谷，與陽明合于宗筋，陽明總宗筋之會(huì)，會(huì)于氣街，而陽明之長，皆屬于帶脈而絡(luò)于督脈，故陽明虛。則宗筋縱，帶脈不引，故足痿不用也”。而足三里為足陽明胃經(jīng)之合穴，“合治內(nèi)腑”，因此筆者選穴足三里。陽陵泉為足少陽膽經(jīng)之合穴，《難經(jīng)》云：“筋病治此”,為八會(huì)穴之“筋會(huì)”，是治療筋病的要穴。《馬丹陽天星十二穴治雜病歌》中載：“陽陵居膝下，外廉一寸中，膝腫并麻木，冷痹及偏風(fēng)……舉足不能起，坐臥似衰翁，刺入六分止，神功妙不同?！币虼斯P者同時(shí)選用陽陵泉穴。

Foxo是轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞進(jìn)程，其中包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)以及代謝等。在人類中有4個(gè)Foxo的同源基因，分別是Foxo1，F(xiàn)oxo2，F(xiàn)oxo3和Foxo4。其中Foxo3a在許多類型的細(xì)胞中有抑制細(xì)胞增殖的作用，可促進(jìn)肌肉萎縮的表達(dá)[10-12]。通過Western blot和Real-time PCR檢測顯示，F(xiàn)oxo3a在4組小鼠中的蛋白和分子水平的表達(dá)一致。其中在正常組表達(dá)較低，而在尾吊組表達(dá)增高，F(xiàn)oxo3a在骨骼肌萎縮尾吊組較正常組的高表達(dá)，提示了Foxo3a在骨骼肌萎縮中的抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)萎縮的作用和造模的成功；同步電針和預(yù)防電針治療降低了Foxo3a的表達(dá)，說明電針干預(yù)能夠降低Foxo3a的表達(dá)，電針發(fā)揮了對(duì)抗Foxo3a促細(xì)胞萎縮的作用。然而電針組和提前電針組的Foxo3a表達(dá)仍高于正常組，經(jīng)電針治療后Foxo3a的表達(dá)仍未降到正常組的水平，思考其原因:一是治療14 d的治療時(shí)間不夠，有待于更長時(shí)間的治療周期的進(jìn)一步觀察;二是可能電針并不能完全對(duì)抗Foxo3a，或有待于加入中藥或其他治療方法和手段或可發(fā)揮更好作用，這有待于在以后的工作中觀察。電針組和提前電針組的Foxo3a表達(dá)未顯示明顯差異。提示兩種不同切入干預(yù)時(shí)機(jī)的選擇可能與對(duì)抗骨骼萎縮分子指標(biāo)的影響不大，也可能與筆者選擇的觀察點(diǎn)只有14 d，觀察點(diǎn)少和觀察時(shí)間較短有關(guān)，這都有待增加觀察點(diǎn)和延長觀察時(shí)間進(jìn)一步研究。另外骨骼肌萎縮中Foxo3a的上下游分子還有多種，也有待于筆者進(jìn)一步的研究。

鑒于多種骨骼肌萎縮的相似臨床表現(xiàn)和針灸干預(yù)的有效性，本研究對(duì)其他類型的肌萎縮可提供一定的借鑒，筆者也期望在未來工作中繼續(xù)研究有所發(fā)現(xiàn)。