文景芝，趙鈺琦，高新穎，張卓群，吳羚閣，賈夢(mèng)瑱

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

大豆疫霉（Phytophthora sojaeKauf.&Gerd.）是大豆（Glycine maxL.）生產(chǎn)中最具破壞性的植物病原生物之一，引起大豆疫霉根腐病，嚴(yán)重限制大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展并產(chǎn)生巨大損失[1]。大豆疫霉是土傳病原卵菌，寄主范圍窄，自然條件下僅侵染大豆，其他條件下也侵染羽扇豆（Lupinus micranthusGuss）[2]。防治大豆疫霉根腐病最有效方法是選育抗病品種，因此了解大豆抗病機(jī)制尤為重要。

種子分泌物在種子際中發(fā)揮重要作用。種子分泌物瞬時(shí)釋放在很大程度上控制種子際病原物群落動(dòng)態(tài)變化，對(duì)種子際病原物生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生重要影響[3]。種子分泌物是天然的生物活性化合物，由復(fù)雜的混合物組成，包括糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)，還有一些肽類(lèi)和蛋白質(zhì)等。研究表明，種子分泌物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸和糖為病原物生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)提供能量，促進(jìn)病原物侵染寄主[4]。而其中一些肽類(lèi)、蛋白質(zhì)和次生代謝物質(zhì)抑制土傳病原物活性從而阻止其侵染，與植物抗病性有關(guān)[5]。

種子分泌物對(duì)病原物的抑制作用研究較多，如羽扇豆種子分泌物中幾丁質(zhì)酶可有效抑制病原真菌生長(zhǎng)[6]；豇豆（Vigna unguiculata）種子分泌物中鑒定得到抗真菌蛋白如β-1,3 葡聚糖酶、胱蛋白、豌豆球蛋白和脂轉(zhuǎn)移蛋白[7]；大豆分泌大量蛋白酶抑制劑和其他蛋白質(zhì)，在大豆防御病原物過(guò)程中有潛在作用。已報(bào)道大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)包括凝集素、胰蛋白酶抑制劑和脂氧合酶等對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）有防御活性[5]。但大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)大豆疫霉防御作用尚不清楚。

本試驗(yàn)將利用LC/MS-MS技術(shù)鑒定大豆抗、感品種接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)種類(lèi)，重點(diǎn)比較大豆疫霉接種后誘導(dǎo)表達(dá)的差異蛋白。通過(guò)測(cè)定大豆抗、感品種接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子趨化性、成囊、萌發(fā)的影響，明確其防御活性。本研究有助于了解大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)在大豆疫霉防御中的作用，鑒定抗病相關(guān)蛋白，為利用寄主抗病性防治大豆疫霉根腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記大豆疫霉菌株Eps597-3，致病型為1a, 3c, 7。大豆感病品種Sloan，不含任何已知抗大豆疫霉根腐病基因，可被大豆疫霉任何生理小種侵染；大豆抗病品種Williams 82，含有Rps1k基因，對(duì)供試菌株Eps597-3表現(xiàn)抗病。

1.2 游動(dòng)孢子懸浮液制備

參照文景芝等方法[8]。

1.3 收集種子分泌物

接種前收集種子分泌物：選取飽滿(mǎn)、無(wú)破損的2個(gè)供試品種種子各10 g，具體操作參照文景芝等方法[8]。

接種后收集種子分泌物：方法與接種前大致相同，但在25 ℃黑暗條件下吸脹12 h 后補(bǔ)加游動(dòng)孢子懸浮液（濃度為1 g 種子對(duì)應(yīng)1 mL 游動(dòng)孢子懸浮液），繼續(xù)在黑暗條件下浸泡36 h，移出種子，期間補(bǔ)加超純水至10 mL，收集種子分泌物溶液并過(guò)濾除菌。

1.4 種子分泌物中蛋白質(zhì)提取

采取硫酸銨沉淀法提取蛋白質(zhì)[9]，蛋白質(zhì)沉淀經(jīng)過(guò)透析除鹽后測(cè)定活性。采用MWCO3500 透析袋，透析48 h（4 ℃）。

1.5 種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子趨化性的影響

趨化性試驗(yàn)參照Suo等方法[10]。取充滿(mǎn)2 μL蛋白質(zhì)溶液（10 mL 種子分泌物中提取出的蛋白質(zhì)沉淀，回溶于50 mL超純水中，使其相對(duì)濃度為1：5）的毛細(xì)管插入趨化性測(cè)定室一端，另一端插入充滿(mǎn)2 μL 超純水的毛細(xì)管為對(duì)照。記錄5、15、25 min時(shí)兩只毛細(xì)管中游動(dòng)孢子數(shù)量，觀察大豆疫霉游動(dòng)孢子對(duì)種子分泌物中蛋白質(zhì)的趨化性。試驗(yàn)時(shí)室內(nèi)溫度25 ℃，各處理3次技術(shù)重復(fù)，試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子成囊的影響

取新鮮孢子懸浮液300 μL 加入離心管中，向離心管中加入蛋白質(zhì)溶液200 μL（10 mL 種子分泌物中提取蛋白質(zhì)沉淀回溶于20 mL超純水中，使其相對(duì)濃度為1：2）混合均勻。取100 μL 加入凹玻片中，以等量超純水為空白對(duì)照。記錄0.5、1、2 h時(shí)各處理游動(dòng)孢子成囊率。各處理3 次技術(shù)重復(fù)，試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)大豆疫霉孢囊萌發(fā)的影響

孢囊萌發(fā)試驗(yàn)參照文景芝等方法[8]。向游動(dòng)孢子懸浮液中加入蛋白質(zhì)溶液250 μL（終濃度與試驗(yàn)1.6 相同），以等量超純水為空白對(duì)照。分別記錄8、9、10 h時(shí)各處理孢囊萌發(fā)率。各處理3次技術(shù)重復(fù)，試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定

1.8.1 酶解

蛋白質(zhì)酶解參考Katayama等方法[11]。

1.8.2 質(zhì)譜操作及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

Nano-RPLC Buffer A 溶解多肽樣品。在線(xiàn)Nano-RPLC 液相色譜在Eksigent nanoLC-UltraTM2D系統(tǒng)（AB SCIEX）完成，2 μL·min-1流速上樣C18預(yù)柱上（100 μm×3 cm，C18,3 μm,150 ?），保持流速?zèng)_洗脫鹽10 min。分析柱為C18反相色譜柱（75 μm×15 cm C18-3 μm 120 ?, ChromXP Eksigent），試驗(yàn)所用梯度為90 min 內(nèi)流動(dòng)相B 由5%升至35%。質(zhì)譜采用TripleTOF5600 系統(tǒng)（AB SCIEX）結(jié)合納升噴霧III 離子源（AB SCIEX，USA），噴霧電壓為2.5 kV，氣簾氣壓為30 PSI，霧化氣壓為5 PSI，加熱器溫度為150 ℃，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴(lài)采集工作模式（IDA，Information Dependent Analysis），一級(jí)TOF-MS單張圖譜掃描時(shí)間為250 ms，每次循環(huán)時(shí)間固定為2.5 s，碰撞室能量設(shè)定適用于所有前體離子碰撞誘導(dǎo)解離（CID），動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為18 s。數(shù)據(jù)處理采用Mascot 2.3 軟件（Matrix Science），數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，允許最大漏切位點(diǎn)為2；固定修飾為：Carbamidomethyl（C）；可變修飾為：Acetyl（Protein N-term）、Deamidated（NQ）、Dioxidation（W）、Oxidation（M）、Phospho（ST）和Phospho（Y）；MS 容差為±15 ppm，MSMS 容差為±0.15 u，Protein score C.I.%大于95%為鑒定成功。

1.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016（Microsoft Corporation，Washington D.C，USA）和SPSS 25.0 處理數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)分析。各試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)作平均值及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子的趨化作用

接種前大豆感病品種Sloan 種子分泌物中蛋白質(zhì)顯著吸引大豆疫霉游動(dòng)孢子，接種后卻轉(zhuǎn)而排斥大豆疫霉游動(dòng)孢子。大豆抗病品種WillIams 82接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)均對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子產(chǎn)生排斥作用，且接種后排斥作用更強(qiáng)，但差異不顯著（見(jiàn)圖1A）。

2.2 大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子成囊的影響

大豆感病品種Sloan 接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)均促進(jìn)大豆疫霉游動(dòng)孢子成囊，且接種后促進(jìn)作用顯著增強(qiáng)，特別是處理0.5 h 時(shí)，促進(jìn)指數(shù)高達(dá)9.3，顯著高于其他時(shí)段。大豆抗病品種Williams 82 接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)均抑制游動(dòng)孢子成囊，且接種前后無(wú)明顯差異（見(jiàn)圖1B）。

2.3 大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子萌發(fā)的影響

大豆抗病品種Williams 82 接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)均抑制大豆疫霉游動(dòng)孢子萌發(fā)，且接種前后萌發(fā)促進(jìn)指數(shù)在處理8 和9 h 時(shí)差異顯著。大豆感病品種Sloan 接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)游動(dòng)孢子萌發(fā)的影響不同，接種前促進(jìn)而接種后抑制游動(dòng)孢子萌發(fā)，且抑制強(qiáng)度顯著高于抗病品種Williams 82。接種前感病品種Sloan 種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)游動(dòng)孢子萌發(fā)的促進(jìn)作用在處理10 h時(shí)驟然減弱，其萌發(fā)促進(jìn)指數(shù)趨近于0（見(jiàn)圖1C）。

2.4 大豆種子分泌中蛋白質(zhì)種類(lèi)數(shù)量

經(jīng)LC-MS/MS鑒定，大豆抗病品種Williams 82接種后種子分泌物中蛋白質(zhì)種類(lèi)較接種前有所減少；大豆感病品種Sloan 接種后種子分泌物中蛋白質(zhì)種類(lèi)較接種前增加26種。大豆感病品種Sloan接種前種子分泌物中蛋白質(zhì)種類(lèi)多于抗病品種（見(jiàn)圖2A、B、C）。

2.5 大豆抗、感品種接種前種子分泌物中差異蛋白

LC-MS/MS 鑒定結(jié)果表明，與抗病品種Williams 82相比，大豆感病品種Sloan接種前種子分泌物中存在191種差異蛋白，其中68個(gè)蛋白質(zhì)有注釋功能。根據(jù)蛋白質(zhì)功能分為14類(lèi)：催化活性（14種）；水解酶活性（7種）；抗氧化活性（2 種）；新陳代謝（9 種）；氧化還原活性（1 種）；貯藏蛋白（1種）；細(xì)胞分裂及分化（4種）；酶調(diào)節(jié)活性（13種）；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（2 種）；轉(zhuǎn)錄因子（1 種）；啟動(dòng)因子（2種）；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（3種）；抗逆性（6種）；防御活性（3種）。其中紫色酸性磷酸酶具有多種功能，影響植物抗逆境、抗衰老、細(xì)胞發(fā)育和代謝等過(guò)程[12]；大豆基因組中發(fā)現(xiàn)編碼NDPKⅠ的片段，其參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、感病應(yīng)激、非生物脅迫和激素響應(yīng)[13]。此外，鑒定出3 種與植物防御活性相關(guān)的蛋白質(zhì)：類(lèi)葡聚糖β-1,3-葡萄糖苷內(nèi)切酶5、類(lèi)β-葡糖苷酶18和多聚半乳糖醛酸酶抑制劑蛋白（見(jiàn)表1）。

表1 大豆感病品種Sloan接種前種子分泌物中蛋白質(zhì)與抗病品種Williams 82差異蛋白(抗逆蛋白和防御蛋白）Table 1 Differential proteins in the seed exudates of soybean susceptible cultivar Sloan compared with resistance cultivar Williams 82 before inoculation with Phytophthora sojae(Abiotic stress proteins and defense proteins)

與大豆感病品種Sloan 相比，大豆抗病品種Williams 82接種前種子分泌物中共鑒定出144種差異蛋白，其中46 種功能已知。根據(jù)蛋白質(zhì)功能分為10類(lèi)：催化活性（3種）；水解酶活性（8種）；抗逆性（8種）；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（1種）；新陳代謝（4種）；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（1 種）；防御活性（14 種）；酶調(diào)節(jié)活性（2種）；貯藏蛋白（3 種）；AAI_LTSS 蛋白質(zhì)（2 種）。14種具有防御活性的蛋白質(zhì)包括：鏈A，1種皮過(guò)氧化物酶、類(lèi)葡聚糖β-1,3-葡萄糖苷內(nèi)切酶8、類(lèi)葡聚糖β-1, 3-葡萄糖苷內(nèi)切酶3、類(lèi)kiwellin 蛋白、半胱氨酸蛋白酶、Bowman-Birk型蛋白酶抑制劑、類(lèi)vicilin抗菌肽2、類(lèi)葡聚糖β-1,3-葡萄糖苷內(nèi)切酶1、類(lèi)葡聚糖β-1,3-葡萄糖苷內(nèi)切酶3異構(gòu)體、類(lèi)過(guò)氧化物酶20、類(lèi)過(guò)氧化物酶10、GDSL酯酶/脂肪酶、脂氧合酶1。大豆抗病品種Williams 82差異蛋白中具有防御活性的蛋白質(zhì)種類(lèi)多于感病品種（見(jiàn)表2）。

2.6 大豆抗病品種Williams 82接種前后種子分泌物中差異蛋白

經(jīng)LC-MS/MS鑒定，與接種前相比，大豆抗病品種Williams 82接種后種子分泌物中存在141種差異蛋白，其中42個(gè)功能已知。根據(jù)功能分為10類(lèi)：水解酶活性（4 種）；轉(zhuǎn)錄因子（4 種）；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（1種）；抗逆性（3種）；新陳代謝（7種）；氧化還原活性（3種）；防御活性（9種）；RNase活性（1種）；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（4種）；酶調(diào)節(jié)活性（6種）。抗逆性蛋白γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽還原酶均與植物適應(yīng)非生物脅迫有關(guān)[15]。鑒定出9種與植物防御有關(guān)的蛋白質(zhì)，包括超氧化物歧化酶、類(lèi)非洲奇異果蛋白、類(lèi)TMV 抗性蛋白N、類(lèi)枯草桿菌蛋白酶、環(huán)核苷酸門(mén)控離子通道、酸性幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖內(nèi)切酶、PR-4、胚胎發(fā)育后期豐富蛋白（見(jiàn)表3）。

2.7 大豆感病品種Sloan接種前后種子分泌物中差異蛋白

LC-MS/MS 質(zhì)譜鑒定大豆感病品種Sloan 接種后種子分泌物中蛋白質(zhì)與接種前存在173種差異蛋白，經(jīng)查證其中59 種蛋白質(zhì)有文獻(xiàn)表明其功能。根據(jù)蛋白質(zhì)功能分為15類(lèi)：水解酶活性（6種）；貯藏蛋白（4 種）；新陳代謝（10 種）；轉(zhuǎn)?；饔茫?種）；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（1種）；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（5種）；酶調(diào)節(jié)活性（2 種）；細(xì)胞器RNA 調(diào)控（4 種）；氧化還原活性（1種）；轉(zhuǎn)錄因子（2種）；抗逆性（7種）；啟動(dòng)因子（1種）；防御活性（8種）；抗氧化活性（1種）；催化活性（5 種）。大豆疫霉接種后誘導(dǎo)出8 種具有防御活性的差異蛋白，包括kiwellin 蛋白、類(lèi)葡聚糖β-1,3-葡萄內(nèi)切糖苷酶、類(lèi)α-淀粉酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑、β-1,3-葡聚糖酶、類(lèi)枯草桿菌蛋白酶、類(lèi)PR-5、類(lèi)UDP-半乳糖/UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、外囊復(fù)合體組分。此外，磷脂酶dα1影響鹽脅迫和脫落酸耐受性[16]；半胱氨酸蛋白酶抑制劑參與植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答、衰老、細(xì)胞程序化死亡等生理過(guò)程[17]（見(jiàn)表4）。

表2 大豆抗病品種Williams 82接種前種子分泌物中蛋白質(zhì)與感病品種Sloan差異蛋白（抗逆蛋白和防御蛋白）Table 2 Differential proteins in the seed exudates of soybean resistance cultivar Williams 82 compared with susceptible cultivar Sloan before inoculation with Phytophthora sojae(Abiotic stress proteins and defense proteins)

表3 大豆抗病品種Williams 82接種前后種子分泌物中差異蛋白（抗逆蛋白和防御蛋白）Table 3 Differential proteins in the seed exudates of soybean resistance cultivar Williams 82 after inoculation compared with pre-inoculation with Phytophthora sojae(Abiotic stress proteins and defense proteins)

續(xù)表

表4 大豆感病品種Sloan接種前后種子分泌物中差異蛋白（抗逆蛋白和防御蛋白）Table 4 Differential protein in the seed exudates of soybean susceptible cultivar Sloan after inoculation compared with pre-inoculation with Phytophthora sojae(Abiotic stress proteins and defense proteins)

3 討論與結(jié)論

目前，對(duì)于植物防御機(jī)制，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究較深入。但對(duì)種子在微生物密集土壤中發(fā)芽和生存的機(jī)制了解有限。大豆抗、感品種種子分泌物均有效吸引大豆疫霉游動(dòng)孢子，而抗病品種Williams 82種子分泌物顯著抑制大豆疫霉卵孢子形成及萌發(fā)和孢囊萌發(fā)[8]，說(shuō)明大豆種子分泌物中存在防御大豆疫霉的物質(zhì)。為了解大豆種子分泌物在植物防御中的作用，本試驗(yàn)重點(diǎn)研究大豆種子分泌物中蛋白質(zhì)特性及其對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子的影響。

種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)真菌生長(zhǎng)的體外抑制作用已被證實(shí)[18]。大豆抗、感品種種子分泌物中蛋白質(zhì)對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子的趨化性影響存在差異。感病品種Sloan 接種前種子分泌物中蛋白質(zhì)吸引大豆疫霉游動(dòng)孢子，接種后排斥游動(dòng)孢子；接種前后均促進(jìn)游動(dòng)孢子成囊，接種前促進(jìn)孢囊萌發(fā)，接種后抑制孢囊萌發(fā)，說(shuō)明感病品種Sloan 種子分泌物中存在對(duì)游動(dòng)孢子有趨化作用的蛋白質(zhì)，接種后誘導(dǎo)防御活性更強(qiáng)的蛋白質(zhì)?？共∑贩NWilliams 82 接種前后種子分泌物中蛋白質(zhì)均排斥游動(dòng)孢子，接種后排斥作用更強(qiáng)，均抑制游動(dòng)孢子成囊和孢囊萌發(fā)，說(shuō)明接種后可能誘導(dǎo)種類(lèi)更多、含量更高、活性更強(qiáng)的與植物防御有關(guān)的蛋白質(zhì)。

感病品種Sloan 接種后誘導(dǎo)8 種已知具有植物防御活性的差異蛋白。其中kiwellin 蛋白可抵抗真菌誘導(dǎo)的宿主代謝干擾，阻斷真菌效應(yīng)酶的酶活性[19]；PR-5 主要參與防御病原物感染的植物防御系統(tǒng)，如抑制真菌孢子萌發(fā)或菌絲生長(zhǎng)。因此，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)可能通過(guò)排斥游動(dòng)孢子和抑制孢囊萌發(fā)參與大豆種子對(duì)大豆疫霉的防御機(jī)制。

抗病品種Williams 82接種后誘導(dǎo)出9種已知與植物防御相關(guān)的差異蛋白。其中PR-4通過(guò)直接抑制內(nèi)切殼多糖酶和水解酶保護(hù)宿主，致使幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和過(guò)氧化物酶表達(dá)；類(lèi)枯草桿菌蛋白酶誘導(dǎo)植物和病原物互作過(guò)程中的PCD 和HR，具有病原物抗性和免疫激發(fā)作用，說(shuō)明這些差異蛋白可能在抗病品種Williams 82 防御大豆疫霉的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

大豆抗、感品種接種前種子分泌物中共鑒定出17 種具有植物防御活性的差異蛋白，抗病品種多于感病品種。大豆種子中胰蛋白抑制劑抑制植物病原微生物各種酶[20]?？共∑贩NWilliams 82中存在Bowman-Birk型蛋白酶抑制劑，可能參與大豆對(duì)大豆疫霉的防御過(guò)程。此外，過(guò)氧化物酶、脂氧合酶均與植物對(duì)病原物反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，大豆種子對(duì)蛋白質(zhì)的選擇性分泌可能有助于對(duì)大豆疫霉的防御機(jī)制，且接種后誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)防御活性更強(qiáng)，因此認(rèn)為大豆分泌蛋白在植物對(duì)土壤病原物的防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。后續(xù)應(yīng)研究具體的防御蛋白，了解其對(duì)大豆疫霉的生理活性，為大豆抗病機(jī)制和抗病育種研究提供理論依據(jù)。