張愛興 ，馬曉溪 ，陳冉 ，李慶 ，張慧 ，王玉明

（1.昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650101；2.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650032）

肺癌是我國發(fā)病率及死亡率最高的癌癥種類，有研究顯示，該疾病的年死亡率為42.09/10萬[1]。尤其是地處西南部的云南宣威地區(qū)。研究顯示宣威肺癌患者中,男性和女性平均患病死亡率分別為 98.10/10 萬，83.28/10 萬[2]，居世界之首[3]。 p53 正向凋亡調(diào)控因子 （p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種促凋亡因子,它是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員,在p53依賴與非依賴性細胞凋亡途徑中均起重要作用，PUMA基因上游啟動子序列中含p53的結(jié)合位點,受凋亡信號刺激后,p53可直接與其靶位點結(jié)合而促進PUMA的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達[4,5]。前期研究顯示,從肺癌組織中篩選出對PUMA可能具有調(diào)控作用的miRNA，其中有10條miRNA表達上調(diào)，miR-221升高較為明顯[6]。迄今為止，關于miR-221調(diào)控肺癌細胞生長的系統(tǒng)性研究在國內(nèi)外鮮見報道，由此，本研究根據(jù)miRNA的作用機制構(gòu)建雙熒光報告載體，以驗證PUMA是否為miR-221的靶基因，進一步通過后續(xù)實驗研究miR-221在宣威肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 宣威肺癌細胞株（XWLC-05）購自中國科學院云南省腫瘤研究所；質(zhì)粒pm irGLO購自美國Promega公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；TRIzol、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；Dual-Luciferase?Reporter Assay System、Caspase-Glo?3/7 Assay、Caspase-Glo?9 Assay購自美國 Promega公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；miR-221過表達/抑制表達載體購自美國GeneCopoeia公司；Taq DNA聚合酶 、Primescript RT Reagent kit、SYBR Premix Ex Taq kit購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 根據(jù)細胞貼壁生長的特性進行XWLC-05培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)基為加入10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素雙抗液的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基，具體培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。

1.2.2 PUMA載體的構(gòu)建 從數(shù)據(jù)庫中搜索PUMA基因中能夠和miR-221相結(jié)合的序列片段，即其3’UTR端，然后設計并合成兩段此3’UTR序列，一段作為野生型基因，即不改變其結(jié)合位點序列：5’AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGGCGCGGGGG ACTTTCTCTGCACCATGTAGCATACTGGACTCTAG TCTAGACTAG3’（正向序列）；而另一段作為突變型基因,即使其結(jié)合位點改變 （對照）：5’AGCTTT GTTTAAACGGCGCGCCGGCGCGGGGGACAAACA GACGAGGAAGAACGATACTGGACTCTAGTCTAG ACTAG3’（正向序列）,共同的下游系列為5’CTA GTCTAGACTAGAGTCCAGTATCGTTCTTCCTCGTC TGTTTGTCCCCCGCGCCGGCGCGCCGTTTAAACA AAGCT3’,在所有序列兩端分別加入酶切位點及保護性堿基，退火酶切后，將兩段基因片段分別與質(zhì)粒連接,連接后導入大腸桿菌JM109進行轉(zhuǎn)化并培養(yǎng)。挑選體積較大的菌落用實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）方法和測序方法驗證插入序列的正確性后，將菌落保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雙熒光素酶報告實驗 培養(yǎng)的XWLC-05經(jīng)表1中各組上述抽提野生型、突變型質(zhì)粒載體分別進行轉(zhuǎn)染,并于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4～6h后,改為在細胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后使用Luciferase報告基因系統(tǒng)對其熒光素酶活性進行檢測,每組做5個復孔，取其平均值進行計算。

表1 雙熒光素酶報告實驗分組

1.2.4 MTT比色法分析XWLC-05增殖 按表1野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組進行分組，在各組XWLC-05細胞中分別加入MTT液，并于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，立即加入DMSO，輕微地振蕩混勻20 min。 XWLC-05 細胞經(jīng)培養(yǎng) 0、24、48、72 h 后使用酶標儀于570 nm波長分別進行酶活性的檢測，每組做5個復孔，取其平均值進行計算。

1.2.5 Caspase 3/7、Caspase 9的活性檢測 首先將Caspase的反應底物及緩沖液充分混勻，混勻后靜置于室溫10 min，然后加入表1野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組各組XWLC-05細胞，于室溫孵育30 min。使用酶標儀進行酶活性的檢測，每組做5個復孔，取其平均值進行計算。

1.2.6 qRT-PCR檢測各組XWLC-05中的PUMA的表達水平 使用TRIzol法提取表1野生型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組各組XWLC-05的總RNA,并使用Primescript RT Reagent kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以qRT-PCR方法檢測各組PUMA的表達水平（上游引物為：ACACGGTAAAACCATGAC，下游引物為：GTCCAAACTCATCAATGTA， 內(nèi)參：GAPDH）。qRT-PCR采用 SYBR Premix Ex Taq kit進行，反應條件為 95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；64 ℃、31 s；72 ℃、34 s，共進行40個循環(huán)，并檢測其融解曲線，使用公式2-△Ct來計算其表達水平，△Ct=同一樣本目的基因Ct值—內(nèi)參基因Ct值。

1.3 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，并使用隨機設計的單因素方差分析實驗數(shù)據(jù),采用Student-Newman-Keuls q檢驗比較多組間樣本均數(shù)；兩組均數(shù)比較采用t檢驗；如果數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（QR）］表示，使用 Kruskal-Wallis秩和檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增后，10%瓊脂糖凝膠電泳可見到與目的片段大小一致的PCR產(chǎn)物條帶；經(jīng)PmeⅠ、XbaⅠ雙酶切后,得到一條約7 300 bp的目的條帶及空載體條帶。見圖1、圖2。

圖1 重組質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖2 重組質(zhì)粒酶切圖

2.2 重組質(zhì)粒的測序結(jié)果 構(gòu)建的表達載體經(jīng)過測序分析后結(jié)果顯示,所插入的PUMA3’UTR端序列（野生型、突變型）與設計相符，沒有出現(xiàn)堿基突變和（或）缺失。質(zhì)粒載體構(gòu)建相關結(jié)果表明已成功構(gòu)建質(zhì)粒載體。見圖3、圖4。

圖3 野生型重組載體PUMA測序結(jié)果

圖4 突變型重組載體PUMA測序結(jié)果

2.3 熒光素酶報告實驗證實PUMA基因是miR-221的靶基因 在實驗組中，pGLO-PUMA(wt)+Over-miR-221轉(zhuǎn)染組的熒光活性值為5.88±0.72，低于pGLO-PUMA(wt)轉(zhuǎn)染組（11.52±1.24）（t=-8.662，P<0.001），熒光值大約降低了49%，見圖5；另外如果轉(zhuǎn)染報告基因質(zhì)粒（wt）和inhibitor載體，則熒光素酶表達量會顯著升高，pGLO-PUMA （wt）+In-mi R-221轉(zhuǎn)染組熒光活性值為31.66±4.72，顯著高于pGLO-PUMA（wt）轉(zhuǎn)染組（10.12±1.58）（t=12.761，P<0.001），熒光值升高超過100%，見圖6。

在對照組中,為了進一步確認miR-221的調(diào)節(jié)作用是通過其與靶基因相應序列互補配對,本研究下一步將質(zhì)粒（wt）上的相應序列進行突變，構(gòu)建突變質(zhì)粒（mut）。當突變質(zhì)粒和過表達載體同時轉(zhuǎn)染時，熒光素酶表達量沒有降低（t=0.806，P=0.445），見圖5；同樣地，突變也造成了inhibitor載體抑制效果的消除（t=1.755，P=0.117），見圖 6。 上述結(jié)果表明重組質(zhì)粒載體已經(jīng)準確地插入到熒光素酶報告基因，并在XWLC-05細胞內(nèi)進行了熒光素酶基因的表達，證實PUMA是miR-221的靶基因之一。

2.4 miR-221促進XWLC-05增殖 各組XWLC-05細胞分別培養(yǎng) 0、24、48 和 72 h 后，Control組和Scramble組按照腫瘤細胞增殖方式進行細胞增殖，過表達轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)24 h后,細胞的生長相比于Con trol組及Scramble組開始出現(xiàn)促進細胞增殖的現(xiàn)象，Over-miR-221組細胞的生長速度也明顯高于Control組和Scramble組；抑制表達轉(zhuǎn)染組中，細胞在培養(yǎng)24 h后開始出現(xiàn)明顯的抑制現(xiàn)象,而且隨著時間的延長，抑制程度也更加明顯，In-miR-221組細胞的生長速度明顯低于Control組和Scramble組[F(24 h)=98.181，P<0.001；F(48 h)=109.561，P<0.001；F(72 h)=143.782，P<0.001]，見圖 7。

2.5 miR221通過Caspase抑制XWLC-05凋亡 相比Scramble組，In-miR-221組細胞的Caspase 3/7活性增高 （t=12.851，P<0.001）； 而 Over-miR-221組轉(zhuǎn)染組中Caspase 3/7活性較低，與Scramble組相差不大（t=-2.181，P=0.061）。 而對于 Caspase 9，相比Scramble組，In-miR-221組細胞的Caspase 9活性也增高（t=15.491，P<0.001）；而 Over-miR-221組轉(zhuǎn)染組中Caspase 9活性較低，與Scramble組相差不大（t=-2.056 ，P=0.074），見圖 8、圖 9。

2.6 XWLC-05過表達與抑制表達miR-221后PUMA基因的表達水平 因各組樣本數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，所以各組XWLC-05之間的PUMA表達水平通過Kruskal-Wallis秩和檢驗進行統(tǒng)計分析，差異無統(tǒng)計學意義（H=1.262，P=0.532），表明 miR-221在調(diào)控其靶基因PUMA表達的過程中，無論是過表達還是抑制表達,在靶基因PUMA的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控中無明顯作用。

圖5 過表達轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性檢測miR-221與PUMA的相互作用

圖6 抑制表達轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性檢測miR-221與PUMA的相互作用

圖7 各轉(zhuǎn)染組細胞酶活性

圖8 各轉(zhuǎn)染組的Caspase 3/7活性

3 討論

miR-221定位于X染色體p11.3區(qū)，呈成簇分布,是定性較為明確的原癌基因簇[7]。miR-221是一種很有潛力的生物靶向分子,在多種惡性腫瘤中均表達異常，例如Garofalo等[8]在研究與雌激素表達相關的miRNA時發(fā)現(xiàn)，miR-221直接作用于ERα基因的3’UTR端，它在MCF-7和T47D細胞中呈現(xiàn)異常表達，使ERα蛋白表達下降，而mRNA的表達并未降低。Lupini等[9]在分析通過過表達miR-221來影響甲狀腺癌細胞生長的過程中，通過沉默機制對miR-221進行基因沉默,以此來影響并降低甲狀腺癌細胞的細胞增殖能力,這表明miR-221可以在甲狀腺癌細胞中起到促進細胞增殖的作用。此外，在胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤細胞中，miR-221的表達也都出現(xiàn)了異常[10,11]。

本研究結(jié)果顯示,過表達轉(zhuǎn)染組細胞生長相比Control組和Scramble組出現(xiàn)促進細胞增殖的作用；抑制表達轉(zhuǎn)染組細胞在轉(zhuǎn)染后24 h相比Control組和Scramble組出現(xiàn)了抑制細胞增殖的現(xiàn)象，且隨著時間的推移，抑制程度也更加明顯，這與Ie Sage以及Koelz等[12,13]的研究結(jié)果相符。

Caspase 3是引發(fā)細胞凋亡機制的一個關鍵酶,其主要功能是對pro Caspase 3、6、7和9進行剪切,并對許多Caspase底物進行直接特異性剪切，這些通過Caspase 3介導的蛋白剪切機制是細胞凋亡機制中的一個主要組成部分；Caspase 9則是細胞凋亡階段中位于上游的一個Caspase，激活Caspase 9后可以進一步激活Caspase 3，進而促使后續(xù)細胞凋亡。在Caspase家族的凋亡信號通路中，已有研究證實puma可通過激活Caspase 3/Caspase 9等機制促進細胞凋亡以及抑制細胞增殖[14]。在本實驗結(jié)果中，抑制表達轉(zhuǎn)染組細胞Caspase 3/7和Caspase 9活性增高；而轉(zhuǎn)染過表達組別中無論是Caspase 3/7還是Caspase 9，其活性均較低，與Control組及Scramble組相差不大。實驗結(jié)果提示通過對miR-221進行抑制表達可以激活Caspase 3和Caspase 9凋亡機制,使Caspase活性增高并進一步促使肺癌細胞凋亡，這與Wu等[13]的研究結(jié)果一致；而在促進細胞增殖過程中，過表達miR-221可以促進細胞增殖，但Caspase活性變化不大，造成這種結(jié)果可能的原因是存在另外的機制促進細胞增殖，而并不是通過降低Caspase 3/7和Caspase 9活性來抑制細胞凋亡，進而促進細胞增殖。本研究在利用qRT-PCR方法檢測PUMA表達水平的結(jié)果中，其統(tǒng)計學結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義，這可能是因為PUMA只是miR-221的靶基因之一，還存在其他靶基因共同調(diào)控肺癌細胞增殖凋亡，miR-221可能通過抑制PUMA的翻譯而非誘導PUMA的降解來調(diào)控基因表達。

本研究證實PUMA為miR-221的靶基因之一，這一結(jié)論與張春智等[15]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的結(jié)果相一致，轉(zhuǎn)染Over-miR-221對宣威肺癌細胞的生長起到促進細胞增殖的作用,而在轉(zhuǎn)染In-mi R-221時，細胞中Caspase 3/7、9的活性均升高，促進了細胞凋亡,最終抑制了肺癌細胞的生長?？傊琺iR-221可能通過負向調(diào)控PUMA以及其他靶基因來參與宣威肺癌的發(fā)生、發(fā)展，然而miR-221調(diào)控PUMA進一步影響宣威肺癌發(fā)生發(fā)展的機制仍待進一步研究。

圖9 各轉(zhuǎn)染組的Caspase 9活性