蔣彩霞，陶宏衛(wèi)

（1.江蘇省鎮(zhèn)江市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心江蘇鎮(zhèn)江 212009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇泰州 225300）

禽流感（Avian Influenza，AI），主要是由正黏病毒科的A 型流感病毒所引起的傳染病，流行范圍廣，傳播速度快，病死率高，亞型多，變異快，其中H5 和H7 亞型對(duì)養(yǎng)禽業(yè)和人類身體健康危害嚴(yán)重，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列入A 類動(dòng)物疫病，我國列為一類動(dòng)物傳染病。2017 年發(fā)生人感染禽流感事件，危害到人類公共衛(wèi)生。近幾年全國多地有禽流感疫情發(fā)生，防控形勢(shì)嚴(yán)峻[1]。2017年以來H7N9 流感變異毒株給我國家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的影響和經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外禽流感防控實(shí)踐表明，疫苗免疫是防治禽流感的關(guān)鍵措施之一。為探索本地禽流感疫苗免疫的最佳免疫程序，篩選免疫質(zhì)量較好的禽流感疫苗，筆者做了以下試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)試劑 禽流感H5N1 Re-11、H5N1 Re-12 抗原均由青島易邦生物工程有限公司提供，批號(hào)為190066100、190066300，H7N9 H7-Re 2 抗原由哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)為2019007。

1.1.2 疫苗3 個(gè)不同廠家的禽流感油乳劑滅活苗見表1。

表1 來自3個(gè)廠家的H 5+H 7三價(jià)滅活苗信息

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物是由句容市某規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)提供的京紅一號(hào)雞苗200 只。

1.2 方法

1）參照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》GB/T18936-2003 標(biāo)準(zhǔn)，通過血凝（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）的方法檢測(cè)H5、H7 亞型抗體。以完全抑制四單位（4HAU）抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。HI效價(jià)≥4log 2 個(gè)滴度判斷為合格，群體合格率達(dá)70%以上達(dá)標(biāo)。

2）根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，將試?yàn)雞隨機(jī)分為A、B、C、D 四組，每組50只，在同等條件下飼養(yǎng)。雛雞分別于1、7、14、21 日齡采血，監(jiān)測(cè)其母源抗體。15 日齡時(shí)對(duì)A、B、C 三組進(jìn)行3 個(gè)不同廠家禽流感三價(jià)疫苗首次免疫，劑量為0.5mL，D 組為空白對(duì)照組；45 日齡時(shí)再將A、B、C 三組平均分成A1、A2、B1、B2、C1、C2 六組，A1、B1、C1 進(jìn)行二免，疫苗品種和劑量與一免相同，A2、B2、C2 不免。分別于第一次免疫后第2 周、3 周、4 周、5 周，第二次免疫后第2 周、4 周、6 周、8 周翅膀靜脈采血，對(duì)每組采集20 份全血進(jìn)行分離血清，之后分別進(jìn)行H5N1 Re-11、H5N1 Re-12、H7N9 Re-2 免疫抗體監(jiān)測(cè)。

3）紅細(xì)胞懸液的制備。采集3 只健康成年公雞的血液，加入盛有抗凝劑的離心管中。用PBS 液洗滌血細(xì)胞，每次以2,000r/min離心10min，棄去上清液，加入新的PBS 液反復(fù)沖洗后再離心，重復(fù)3 次，最后一次用PBS 液配成1%的紅細(xì)泡懸液，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 母源抗體消長(zhǎng)規(guī)律

通過對(duì)雛雞母源抗體檢測(cè)，1 日齡雛雞H5N1 Re-11、H5N1 Re-12、H7N9 Re-2 平均效價(jià)為7log 2 個(gè)滴度左右；在7 日齡降到6log 2 個(gè)滴度左右；在14 日齡降到5log 2 個(gè)滴度左右；在21 日齡降到4log 2 個(gè)滴度左右。隨著日齡的增長(zhǎng)，母源抗體逐步下降。根據(jù)資料顯示抗體效價(jià)在4～6log 2 個(gè)滴度才具有保護(hù)性。所以將15 日齡作為首免日齡。具體結(jié)果見表2。

表2 母源抗體消長(zhǎng)規(guī)律

2.2 一免后抗體消長(zhǎng)規(guī)律

首免后2 周，H5N1 Re-11、H5N1 Re-12、H7N9 Re-2 的禽流感抗體開始上升，首免后4 周，不同毒株的抗體平均效價(jià)均達(dá)到6log 2 個(gè)滴度以上。從3 組抗體消長(zhǎng)規(guī)律來看，產(chǎn)生H5N1 Re-11的抗體最好的是A 組，高峰時(shí)抗體效價(jià)最高（A 組）和最低（C 組）相差1.05log 2 個(gè)滴度；產(chǎn)生抗H5N1 Re-12 的抗體最好的是A組，高峰時(shí)抗體效價(jià)最高（A 組）和最低（B 組）相差0.9log 2 個(gè)滴度；產(chǎn)生抗H7N9 Re-2 的抗體最好的是A 組，高峰時(shí)抗體效價(jià)最高（A 組）和最低（C 組）相差1.05log 2 個(gè)滴度。三個(gè)毒株的抗體均是A 組最高，不同廠家禽流感三價(jià)苗產(chǎn)生禽流感抗體效價(jià)差異不顯著。具體結(jié)果見表3～5。

表3 一免后不同廠家H5N1 Re-11抗體消長(zhǎng)規(guī)律

表4 一免后不同廠家H5N1 Re-12抗體消長(zhǎng)規(guī)律

表5 一免后不同廠家H7N9 Re-2抗體消長(zhǎng)規(guī)律

2.3 二免后抗體消長(zhǎng)規(guī)律

二免后2 周，不同毒株的抗體平均效價(jià)均達(dá)到8log 2 個(gè)滴度以上，從3 組抗體消長(zhǎng)規(guī)律來看，產(chǎn)生H5N1 Re-11 的抗體最好的是A1 組，高峰時(shí)抗體效價(jià)最高（A1 組）和最低（C1 組）相差1log 2個(gè)滴度；產(chǎn)生抗H5N1 Re-12 的抗體最好的是A1 組，高峰時(shí)抗體效價(jià)最高（A1 組）和最低（C1 組）相差1.05log 2 個(gè)滴度；產(chǎn)生抗H7N9 Re-2 的抗體最好的是A1 組，高峰時(shí)抗體效價(jià)最高（A1 組）和最低（B1 組）相差1log 2 個(gè)滴度。三個(gè)毒株的抗體均是A 組最高，不同廠家禽流感三價(jià)苗產(chǎn)生禽流感抗體效價(jià)差異不顯著。具體結(jié)果見表6～8。

首免后，試驗(yàn)雞在免疫后抗體離散度較大，且很難達(dá)到6log 2個(gè)滴度以上。二次免疫后抗體離散度較小，基本能達(dá)到6log 2 個(gè)滴度以上，對(duì)防止高致病性禽流感的發(fā)生有一定的保障，但是在101日齡左右時(shí)抗體滴度開始下降，所以對(duì)養(yǎng)殖周期較長(zhǎng)的蛋雞，建議在產(chǎn)蛋前至少要進(jìn)行3 次免疫。雞場(chǎng)要根據(jù)雞群體的抗體消長(zhǎng)規(guī)律確定免疫的時(shí)間和次數(shù)，保證整個(gè)飼養(yǎng)周期內(nèi)抗體的保護(hù)率達(dá)到100%。

表6 二免后不同廠家H5N1 Re-11抗體消長(zhǎng)規(guī)律

表7 二免后不同廠家H5N1 Re-12抗體消長(zhǎng)規(guī)律

表8 二免后不同廠家H7N9 Re-2抗體消長(zhǎng)規(guī)律

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明雛雞禽流感母源抗體隨日齡的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，根據(jù)國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，AI的最低臨界保護(hù)值為4～6log 2 個(gè)滴度，并且必須大于4log 2 個(gè)滴度。按照本試驗(yàn)結(jié)果，建議AI 的首次免疫在15～21 日齡（2～3 周齡左右），這樣既可避開母源抗體對(duì)免疫效果的不良影響，又不遲于母源抗體低于臨界值[2]。二免的時(shí)間在45～50 日齡左右較為合適，三免時(shí)間在105～110 日齡左右較為合適。雞群的免疫程序及免疫劑量應(yīng)根據(jù)母源抗體、雞場(chǎng)飼養(yǎng)管理水平、環(huán)境、雞的品種、出欄時(shí)間等而定，不可盲目照搬其他雞場(chǎng)的免疫程序。

試驗(yàn)證明禽流感免疫抗體水平與免疫次數(shù)呈正相關(guān)，二免后刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)時(shí)間早于一免，抗體滴度高峰時(shí)間也早于一免達(dá)到，二免的抗體水平較高而且維持時(shí)間較長(zhǎng)。

重組禽流感H5+H7 三價(jià)疫苗因不同廠家疫苗抗原含量、生產(chǎn)工藝、免疫佐劑以及保存運(yùn)輸?shù)确矫娴脑?，?huì)導(dǎo)致疫苗質(zhì)量存在一些差異，從而造成免疫后H5 和H7 亞型免疫抗體水平略有差異[3]。本試驗(yàn)中，從免疫后產(chǎn)生的抗體來看，3 個(gè)廠家H5+H7 三價(jià)滅活苗差異不顯著，都符合規(guī)定。雞場(chǎng)可以通過經(jīng)濟(jì)成本、疫苗效果、操作便利等方面綜合考慮選擇適合本場(chǎng)的疫苗。

HI抗體水平的高低是評(píng)估禽流感疫苗保護(hù)效果的一個(gè)重要因素。在實(shí)際生產(chǎn)中，常用血清學(xué)方法替代免疫攻毒法來衡量疫苗接種后的免疫力。通常認(rèn)為疫苗免疫后雞群特異性抗體水平越高，雞群抵抗相應(yīng)病毒感染的能力越強(qiáng)。因此，免疫前后持續(xù)的抗體檢測(cè)是當(dāng)前高致病性禽流感免疫防控工作中的重要環(huán)節(jié)。另外，由于禽流感病毒血清型較多，變異性較強(qiáng)，不同亞型之間又不能完全保護(hù)，有條件的雞場(chǎng)建立抗體效價(jià)監(jiān)測(cè)的同時(shí)進(jìn)行病原學(xué)監(jiān)測(cè)，針對(duì)當(dāng)前本地流行的疫情來選擇血清型和毒株相同的疫苗，定期開展家禽重大疫病的流行病學(xué)調(diào)查和疫苗的免疫效果評(píng)估，為雞場(chǎng)選擇適合本場(chǎng)的疫苗品種，這樣才能更有效地避免禽流感疫病的發(fā)生。