李穎嫦，梁彩紅，禤潔甜，鄭會(huì)潔

（廣東省佛山市第一人民醫(yī)院，佛山528000）

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)包括一系列病癥，但都因造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞發(fā)育異常所引起，且最早都起源于某一個(gè)造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，故稱其為克隆性造血異常，是一種后天性疾病[1]。研究表明，輕度MDS會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，易發(fā)生感染及出血，嚴(yán)重者可危及生命[2]，患者往往會(huì)伴隨感染、發(fā)熱、貧血性心臟病等并發(fā)癥[3]。隨著對(duì)MDS的深入認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)MDS患者都具有染色體異常發(fā)現(xiàn)大多數(shù)MDS患者都具有染色體異常。染色體核型分析對(duì)在MDS的診斷及預(yù)后具有重要意義[4,5]。常規(guī)的染色體核型分析可在40%-50%MDS患者中檢測(cè)出染色體異常。隨著DNA分子探針技術(shù)的不斷發(fā)展，如今在MDS的診斷中熒光原位雜交技術(shù)（FISH)的應(yīng)用有極其重要的作用，已被證明可提高患者染色體異常的檢出率。在這項(xiàng)研究中，我們將FISH探針用于檢測(cè)MDS患者的染色體異常，并將其與常規(guī)染色體核型分析結(jié)果進(jìn)行比較，以分析FISH檢測(cè)在MDS診斷中的重要性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月-2018年12月期間在我院接受治療的78例MDS患者為研究對(duì)象，其中女38例,男40例，年齡34-78歲，平均年齡（56.42±2.87）歲。按照2014WHO中MDS的分型標(biāo)準(zhǔn)[6]，所有患者均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)及功能診斷。診斷可分為:Ⅰ級(jí)：難治性貧血（RA）;Ⅱ級(jí)：難治性貧血伴環(huán)狀鐵粒幼細(xì)胞（RAS）;Ⅲ級(jí)：難治性血細(xì)胞減少伴多系發(fā)育異常（RCMD）;Ⅳ級(jí)：難治性貧血伴原始細(xì)胞過(guò)多Ⅰ型及Ⅱ型（RAEB-Ⅰ，RAEB-Ⅱ）;Ⅴ級(jí)：骨髓增生異常綜合征，不能分型（MDSU）。所有MDS患者的一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。上述患者及家屬對(duì)該研究均知情并簽署了知情同意書(shū)，此次研究由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 MDS患者的分型情況[n(%)]

1.2 方法

1.2.1 熒光原位雜交技術(shù) 使用6組不同特異性DNA分子探針包括CSF1R/D5S23，D5S721、EGRI/D5S23,D5S721、D7S486/CSP7、D7S522/CSP7、D20S1 08/CSP8以及CSPX/CSPY（北京金菩嘉科技有限公司）進(jìn)行骨髓細(xì)胞間期FISH四項(xiàng)檢測(cè)。在治療前清晨抽取患者2.0ml骨髓置于肝素鈉試管送檢，用蒸餾水洗滌2次，去掉上清液，取低滲液置37℃水浴10min，用固定液（甲醇：冰醋酸3:1）預(yù)固定5min，離心后去掉上清液，用固定液水浴10 min，離心，重復(fù)2次，獲取的細(xì)胞滴片，干燥，備用；詳細(xì)按照探針試劑盒內(nèi)的FISH操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用熒光顯微鏡觀察探針的雜交信號(hào)和區(qū)域，并作圖像處理，每次FISH檢測(cè)200個(gè)間期細(xì)胞，重疊細(xì)胞不納入計(jì)數(shù)，記錄并分析探針雜交信號(hào)點(diǎn)的數(shù)量。

1.2.2 染色體核型分析 治療前抽取患者骨髓2.0ml送檢，采取36h短期培養(yǎng)細(xì)胞的方法制備所需的染色體，培養(yǎng)期間未添加任何細(xì)胞刺激劑，成功后采用G顯帶進(jìn)行染色體核型分析。核型異常診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《國(guó)際人類遺傳細(xì)胞學(xué)命名體制》判斷。為避免偶然性，每例標(biāo)本的染色體核型至少分析20個(gè)細(xì)胞中期分裂相，并由2位技術(shù)人員共同完成。

1.3 探針觀察[7]D20S108/CSP8：2紅為正常核型，含1紅為-20／20q-異常，3綠為＋8異常；D7S522/CSP7（7q31）：2紅2綠為正常核型，-7／7q-異常時(shí)顯示1紅2綠；D7S486/CSP7（7q31）：2紅2綠為正常核型，-7／7q-異常時(shí)顯示1紅2綠；EGR1/D5S23，D5S721（5q31）：核型正常時(shí)為2紅2綠，5q-異常時(shí)顯示1紅2綠；CSF1R/D5S23，D5S721（5q33）：核型正常時(shí)為2紅2綠，5q-異常時(shí)顯示1紅2綠；CSPX/CSPY：顯示1紅1綠表示男性核型正常,僅含1綠為-Y。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用χ2檢驗(yàn)將計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)表示為[n(%)]。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FISH檢測(cè)結(jié)果FISH檢測(cè)共檢出染色體異?；颊?3例（55.13%），其中31例為單條染色體異常,12例為一對(duì)染色體異常，未出現(xiàn)多條染色體整合的情況，按照染色體異常發(fā)生率的高低依次為5q-（40.00%）、＋8（30.91%）、-7／7q-（20.00%）、-20／20q-（9.09%）。見(jiàn)表2。

表2 FISH檢測(cè)染色體異常情況[n(%)]

2.2 FISH檢測(cè)和染色體核型分析結(jié)果比較 染色體核型分析后檢測(cè)出有克隆性染色體異常的患者共有41例，檢出率為52.56%，其中31例為單條染色體異常,10例為一對(duì)染色體異常。共檢出5q-異常20例(39.21%)；＋8異常15例（29.41%）；-7／7q-異常12例(23.53%)；-20／20q--異常4例（7.84%）。兩種方法檢出率相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 FISH檢測(cè)和染色體核型分析結(jié)果比較[n(%)]

3 討論

熒光原位雜交技術(shù)（fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）是使用特定的熒光探針標(biāo)記核酸與細(xì)胞中相應(yīng)的靶DNA或RNA分子雜交[8]。并用熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀觀察熒光信號(hào)以增加顯色，從而確定雜交后染色的細(xì)胞、細(xì)胞器的形態(tài)和分布，還可以判定染色體和其他細(xì)胞器上的熒光探針結(jié)合的DNA或RNA分子的位置[9,10]。因此MDS患者的骨髓造血細(xì)胞的克隆性是否發(fā)生異?？捎蒄ISH四項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果得知，消除了骨髓形態(tài)學(xué)檢查的主觀因素[11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，患者在確診為患有MDS的同時(shí)，其中大約有30%-75%的都存在染色體異常的情況,且在嚴(yán)重MDS患者中染色體異常率高達(dá)85%,大多數(shù)表現(xiàn)為染色體的片段缺失異常，單體造成的部分遺傳信息丟失異常也較為常見(jiàn)，染色體三體造成的遺傳物質(zhì)獲得出現(xiàn)率較低[12,13]。

我院通過(guò)研究FISH四項(xiàng)檢測(cè)染色體異常應(yīng)用于骨髓增生異常綜合征患者的意義發(fā)現(xiàn)：常規(guī)染色體核型分析只能檢測(cè)分裂中期的細(xì)胞，易受外界環(huán)境的干擾，且該檢測(cè)方法需要足夠的細(xì)胞分裂相進(jìn)行分析，而部分MDS患者骨髓增生能力低下，使得核型分析難以進(jìn)行。FISH四項(xiàng)檢測(cè)可直接檢測(cè)存在時(shí)間較長(zhǎng)的間期細(xì)胞，且不需要準(zhǔn)備充分的細(xì)胞分裂相，靈敏度和染色體異常的檢出率均較高。我院共使用了6組DNA探針進(jìn)行細(xì)胞間期FISH四項(xiàng)檢測(cè)，染色體異常的檢出率為55.13%，略高于常規(guī)系統(tǒng)染色體核型分析（52.56%），兩種檢測(cè)方法中染色體異常發(fā)生率的高低均依次為5q-、＋8、-7／7q-、-20／20q-，充分說(shuō)明了FISH四項(xiàng)檢測(cè)的準(zhǔn)確率高，與染色體核型分析相符合。但由于FISH探針的特異性強(qiáng)，僅能檢測(cè)與探針相吻合的位點(diǎn)異常，可能會(huì)存在檢測(cè)結(jié)果假陰性的情況，所以對(duì)于較復(fù)雜的核型而言FISH四項(xiàng)檢測(cè)的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常規(guī)染色體核型分析。

綜上所述，雖然細(xì)胞中期分裂相數(shù)量和質(zhì)量限制了核型結(jié)果的檢出率,但染色體核型分析仍然是臨床上檢測(cè)染色體異常的常規(guī)方法。由于當(dāng)中期細(xì)胞不足且核型正常時(shí)，F(xiàn)ISH探針檢測(cè)可作為核型分析的有效補(bǔ)充，因此FISH探針在檢測(cè)MDS患者的染色體異常中仍具有重要的應(yīng)用價(jià)值。