牛黃上清丸（大蜜丸）微生物限度檢查法方法適用性試驗研究

王 瑛，王麗霞，買買提·艾買提

（1.黑龍江省藥品檢驗研究中心，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱市食品藥品行政執(zhí)法局，黑龍江 哈爾濱 150001；3.新疆哈密市食品藥品檢驗所，新疆 哈密 839000）

對牛黃上清丸（大蜜丸）的處方及其制造工藝進行研究，檢驗牛黃上清丸（大蜜丸）之中生藥原粉含量，應(yīng)用《藥典四部附錄通則（2015版）》--1107相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行判斷，牛黃上清丸（大蜜丸）之中需氧菌總數(shù)≤3×104cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)應(yīng)≤102 cfu，沙門菌每10 g不得檢出，大腸埃希菌每克不得檢出，耐膽鹽革蘭陰性菌每克應(yīng)＜102cfu[1]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超凈臺生產(chǎn)廠家：AIRTECH，儀器型號：SW-CJ-2FD；電子天平生產(chǎn)廠家：METTLER，儀器型號：PL202-S；勻漿儀生產(chǎn)廠家：泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司，儀器型號：HTY-761；生物安全柜生產(chǎn)廠家：HealForce，儀器型號：Hfsafe-1200A2；電熱恒溫培養(yǎng)箱生產(chǎn)廠家：天津市泰斯特儀器有限公司，儀器型號：DH5000A；生化培養(yǎng)箱生產(chǎn)廠家：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，儀器型號：SPX-250B-Z型；高壓蒸汽滅菌器生產(chǎn)廠家：Panasonic，儀器型號：MLS-3781L-PC；培養(yǎng)箱生產(chǎn)廠家：上海精宏實驗設(shè)備有限公司，儀器型號：MJPS-250；渦旋混合器生產(chǎn)廠家：IKA，儀器型號：VORTEX3。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基符合《中國藥典》2015年版四部附錄通則的相關(guān)規(guī)定[2]，包括胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖肉湯、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、RV沙門增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌肉湯培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基等。

1.3 菌株

全部所應(yīng)用的菌株均為中國食品藥品檢定研究院提供的5代內(nèi)菌種，包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希氏菌等。

2 方法和結(jié)果

2.1 微生物計數(shù)法適用性試驗

采用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基實施銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌接種，培養(yǎng)后應(yīng)用氯化鈉溶液10倍遞增稀釋，菌懸液制成每含菌量≤104 cfu/mL；黑曲霉斜面混合5 mL聚山梨酯及無菌氯化鈉溶液，后吸出孢子懸液10倍稀釋，孢子懸液制成含菌量≤104 cfu/mL。采用沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基實施白色念珠菌接種，培養(yǎng)后應(yīng)用氯化鈉溶液10倍遞增稀釋，菌懸液制成含菌量≤104 cfu/mL。

取5份9.9 mL供試液，分別加入銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌，分別為0.1 mL混勻，抽取1 mL置入到無菌平皿中，置于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中，溫度≤45℃，平行制備2個平皿。

取2份9.9 mL供試液，分別加入黑曲霉菌、白色念珠菌試驗菌菌液，分別為0.1 mL，取1 mL置入到無菌平皿中，置于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，溫度≤45℃，平行制備2個平皿。

對照組應(yīng)用供試液與稀釋液混合后實施各項操作。

試驗組平均菌落數(shù)與供試品對照組平均菌落數(shù)之差，同菌液對照組平均菌落數(shù)的比值為菌回收率，見表1。

表1 計數(shù)方法適用性試驗回收率

2.2 控制菌檢查法適用性試驗

取供試液（供試品）與100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基實施接種，分別放置1 mL大腸埃希菌菌液、乙型副傷寒沙門菌菌液；取供試液（供試品）與100 mL10 mL腸道菌增菌液體培養(yǎng)基實施接種，分別放置1 mL大腸埃希菌菌液、銅綠假單胞菌菌液。陰性對照試驗通過稀釋液予以檢驗，見表2。

表2 控制菌檢查法適用性試驗情況

3 討 論

企業(yè)提供的牛黃上清丸經(jīng)過檢驗可知，牛黃上清丸（大蜜丸）抑菌性欠佳，在培養(yǎng)基稀釋法檢驗方式，能夠降低其抗菌活性、藥渣對菌落計數(shù)結(jié)果所產(chǎn)生的影響。對比《中國藥典》2015版與2010版試驗方法，可知2010版方法并不會因為2015版方法改變而完全廢棄，它可作為探索新方法的參考，雖然2010版方法不能真實的反映藥品對菌液的抑制能力，但是它也客觀的體現(xiàn)出藥品是否具有抑菌性、抑菌能力的強弱。