郭李坤，曾偉主，周景文*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

丙酮酸(pyruvic acid)是一種重要的小分子有機(jī)酸，在臨床上可以用于治療抑郁癥和創(chuàng)傷性腦損傷[1]，也常用來制備谷物保護(hù)劑和氫化阿托酸[2]，還可用作食品添加劑改善人體機(jī)能[3]。目前，丙酮酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法以及微生物發(fā)酵法。工業(yè)生產(chǎn)常用的方法是化學(xué)合成法，主要為酒石酸法，但這種方法成本普遍較高且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重[4]。酶轉(zhuǎn)化法是利用微生物中某些酶催化底物分子結(jié)構(gòu)中的某一部分轉(zhuǎn)變?yōu)榕c底物結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)[5]。多年來研究者利用了不同的酶，如L-氨基酸脫氨酶、丙酮酸合成酶、D-乳酸脫氫酶等催化不同底物以生產(chǎn)丙酮酸[6-9]。雖然酶轉(zhuǎn)化法具有較大的優(yōu)勢(shì)，可以大幅度降低污染，而且有些具有較高的底物轉(zhuǎn)化率[10]，但是由于底物成本較高等條件的限制，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化仍存在較大困難。

相比化學(xué)合成法和酶轉(zhuǎn)化法，微生物發(fā)酵法可以利用廉價(jià)的可再生碳源生產(chǎn)丙酮酸，大幅降低生產(chǎn)成本，同時(shí)能提高產(chǎn)品的安全性，降低生產(chǎn)過程中的污染。目前有一些微生物用于發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸，如光滑球擬酵母[11]、釀酒酵母[12]、大腸桿菌[13]等。許多策略被開發(fā)用于強(qiáng)化丙酮酸的生產(chǎn)。周景文等[14]借助代謝工程及微生物生理學(xué)手段，闡述了光滑球擬酵母中ATP對(duì)胞內(nèi)微環(huán)境的調(diào)控以及對(duì)菌株生長和丙酮酸合成機(jī)制的影響。徐沙等[15]借助多種組學(xué)技術(shù)解釋了光滑球擬酵母酸脅迫下的丙酮酸積累機(jī)制，并進(jìn)一步改善了菌株的酸耐受性。羅正山等[16]通過控制能量代謝提高了糖酵解效率和丙酮酸的積累水平，最終丙酮酸搖瓶產(chǎn)量為40.2 g/L。目前關(guān)于微生物發(fā)酵法主要通過基因工程手段激活或改善胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、糖酵解和TCA循環(huán)中靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯水平以強(qiáng)化丙酮酸的生產(chǎn)，有關(guān)發(fā)酵過程優(yōu)化與控制的報(bào)道相對(duì)較少。

本研究通過對(duì)篩選得到的突變菌株進(jìn)行發(fā)酵鑒定，對(duì)具有較強(qiáng)丙酮酸生產(chǎn)能力的光滑球擬酵母進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。通過改善相關(guān)培養(yǎng)基成分與質(zhì)量濃度，大幅度提高了搖瓶發(fā)酵水平。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步在15 L發(fā)酵罐上分析了發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，設(shè)計(jì)了一種恒速補(bǔ)料流加方案，強(qiáng)化了丙酮酸的生產(chǎn)，為進(jìn)一步提升工業(yè)水平丙酮酸發(fā)酵性能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

光滑球擬酵母(Candidaglabrata)CCTCC M202019 4種維生素營養(yǎng)缺陷型菌株(硫胺素、生物素、煙酸、吡哆醇)，為本實(shí)驗(yàn)室保存[17]，C.glabrata5D1、4C4、4A4，3G5、4H2和5C6為篩選得到的高產(chǎn)突變株[18]。

1.1.2 主要試劑

大豆蛋白胨、蛋白粉、酵母粉，Oxoid公司，硫胺素、吡哆醇、煙酸和生物素，Sigma-Aldrich公司，其他試劑來自國藥試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 20，酵母膏 10，葡萄糖20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30，大豆蛋白胨 10，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41，2 mol/L HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH至5.5，于115 ℃下滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中加入15～20 g/L瓊脂，于115 ℃下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 120，尿素 3.86，MgSO4·7H2O 0.8，KH2PO42，CH3COONa 3。微量元素液 10 mL/L，維生素液 10 mL/L，于115 ℃下滅菌20 min。

微量元素液(g/L)：MnCl2·4H2O 12，F(xiàn)eSO4·7H2O 2，CaCl2·2H2O 2，CuSO4·5H2O 0.05，ZnCl20.5，用2 mol/L HCl溶解，過濾除菌后于4 ℃保存。

維生素液(g/L)：生物素 0.004，硫胺素 0.75 mg/L，吡哆醇 0.04，煙酸 0.8，用2 mol/L的HCl溶解，過濾除菌后于4 ℃保存[19]。

1.1.4 儀器與設(shè)備

安捷倫1200液相色譜儀，美國安捷倫公司；15 L全自動(dòng)滅菌發(fā)酵罐，上海迪比爾生物工程有限公司；恒溫?fù)u床，上海知楚儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；臺(tái)式高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；722s可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；葡萄糖-乳酸生物傳感器分析儀，深圳西爾曼科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：挑取活化的單菌落于液體種子培養(yǎng)基中，于30 ℃，220 r/min培養(yǎng)20～22 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：培養(yǎng)好的種子液以10%(v/v)的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，在30 ℃，220 r/min的搖床上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。同時(shí)加入40 g/L的CaCO3作為發(fā)酵過程中pH緩沖劑。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：以10%接種量將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接到15 L發(fā)酵罐中，總裝液量為9 L，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，通氣量9 L/min，8 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH恒定控制在5.5，30 ℃下培養(yǎng)。發(fā)酵過程中多次取樣測(cè)定菌株的發(fā)酵參數(shù)。

1.2.2 分析方法

(1)

式中：ρ，丙酮酸最終質(zhì)量濃度，g/L;V,發(fā)酵液總體積，L;m,總耗糖質(zhì)量，g。

采用Origin 2019b對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，統(tǒng)計(jì)顯著性表示如下，*為P<0.05, **為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)丙酮酸生產(chǎn)菌株的篩選

實(shí)驗(yàn)篩選獲得的光滑球擬酵母菌株共7株，分別為C.glabrataCCTCC M202019、5D1、4C4、4A4，3G5、4H2和5C6。在相同條件下，對(duì)該7株菌株進(jìn)行搖瓶水平發(fā)酵。通過高效液相色譜對(duì)各菌株丙酮酸的最終產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè)，得到相對(duì)高產(chǎn)的丙酮酸生產(chǎn)菌株。

由圖1和表1可以看出，7株菌株丙酮酸最終產(chǎn)量有所差異。其中C.glabrata4H2的丙酮酸產(chǎn)量相對(duì)最高，達(dá)到(38.85±0.16)g/L，丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度qv為0.61 g/(L·h)，糖酸轉(zhuǎn)化率Q(丙酮酸/葡萄糖)為0.32 g/g。綜上，選擇菌株C.glabrata4H2進(jìn)行進(jìn)一步地發(fā)酵優(yōu)化以強(qiáng)化丙酮酸的生產(chǎn)。

2.2 氮源及其濃度對(duì)丙酮酸發(fā)酵過程的影響

氮源作為種子液中最重要的組成成分，其種類對(duì)種子的生長代謝有重要影響。本研究中，在搖瓶水平首先比較了大豆蛋白胨、大豆蛋白粉、玉米蛋白粉3種不同氮源對(duì)發(fā)酵的影響。通過比較發(fā)酵過程中菌體生長和產(chǎn)物丙酮酸積累的差異，確定種子培養(yǎng)基中的最佳氮源種類。由圖2-A及2-B可知，在以大豆蛋白胨作為氮源時(shí)，菌株丙酮酸產(chǎn)率和菌體生長濃度均為最佳。

圖1 篩選菌株丙酮酸產(chǎn)量對(duì)比

表1 篩選菌株發(fā)酵參數(shù)的對(duì)比

在確定該菌株丙酮酸生產(chǎn)最佳的氮源為大豆蛋白胨之后，繼續(xù)選取了4個(gè)濃度梯度的該種氮源進(jìn)行發(fā)酵，以探究該種氮源的添加量對(duì)丙酮酸發(fā)酵的影響。不同濃度的大豆蛋白胨對(duì)丙酮酸的產(chǎn)率和菌體的生長有著不同程度的影響。由圖2-C可知，在大豆蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，丙酮酸產(chǎn)量和菌體生長狀況都相對(duì)較好，在15 g/L時(shí)，丙酮酸產(chǎn)量有所下降。對(duì)比丙酮酸產(chǎn)量并考慮經(jīng)濟(jì)性因素，確定發(fā)酵生產(chǎn)最適氮源為大豆蛋白胨，且其添加的質(zhì)量濃度為10 g/L。

2.3 搖瓶水平發(fā)酵檢測(cè)

將菌株C.glabrata4H2在上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種至250 mL搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖3-A所示。菌株在52 h丙酮酸產(chǎn)量即達(dá)到(48.56±0.46)g/L，丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度為0.93 g/(L·h)，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.46 g/g，比優(yōu)化之前(圖3-B)分別提高25.0%、52.5%和43.8%。由圖3-C和3-D可看出，在前14.3和25.1 h，菌株在優(yōu)化培養(yǎng)基中的比生長速率和產(chǎn)物比合成速率均強(qiáng)于優(yōu)化前，表明菌株前中期具有更好的生長狀況，以及具有較快的丙酮酸積累速率。其最大比生長速率與最大比丙酮酸合成速率分別為0.21 h-1和0.42 g/(g·h)，比優(yōu)化前有所提升。

A-氮源種類對(duì)丙酮酸產(chǎn)量的影響；B-氮源種類對(duì)菌體生長的影響；C-大豆蛋白胨濃度對(duì)產(chǎn)量及菌體生長的影響

A-優(yōu)化后搖瓶發(fā)酵過程；B-優(yōu)化前搖瓶發(fā)酵過程；C-菌體比生長速率曲線；D-菌體丙酮酸比生成速率曲線

2.4 15 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵

經(jīng)過上述在搖瓶水平對(duì)種子培養(yǎng)基成分進(jìn)行探索和驗(yàn)證后，確定了種子培養(yǎng)基的基本組分，在15 L發(fā)酵罐中進(jìn)行菌株4H2的分批發(fā)酵培養(yǎng)(圖4-A)。發(fā)酵0～16 h時(shí)，葡萄糖的消耗速率較為緩慢，丙酮酸產(chǎn)量處于較低水平;16 h之后，葡萄糖含量以較快速率下降，丙酮酸產(chǎn)量也迅速提升，并在70 h時(shí)達(dá)到最高值，最終丙酮酸產(chǎn)量為(67.81±0.27)g/L，較搖瓶水平提高39.64%。由圖4-B和4-C可知，15 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵菌株最高比生長速率為0.19 h-1，最高比丙酮酸生產(chǎn)速率為0.41 g/(g·h)，與搖瓶水平發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)基本相同。上述結(jié)果表明，在15 L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，可在不影響菌體生長的情況下提高光滑球擬酵母積累丙酮酸的能力。

2.5 15 L罐流加補(bǔ)料發(fā)酵

2.5.1 流加發(fā)酵總糖濃度的影響

基于上述結(jié)果，在15 L自動(dòng)發(fā)酵罐中對(duì)突變株4H2進(jìn)行恒速補(bǔ)料發(fā)酵優(yōu)化。初始葡萄糖濃度設(shè)為120 g/L，分別流加20、30、40 g/L質(zhì)量濃度的葡萄糖。結(jié)果表明，在發(fā)酵前期丙酮酸產(chǎn)量很低，16 h之后丙酮酸產(chǎn)量迅速增加，葡萄糖消耗速率也逐漸增加，在28 h時(shí)已消耗至55～60 g/L，為延長細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期和平衡期的持續(xù)時(shí)間，增加生物量及平衡期細(xì)胞代謝產(chǎn)物的積累，對(duì)其進(jìn)行底物的流加發(fā)酵。當(dāng)補(bǔ)料質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，發(fā)酵中后期葡萄糖消耗速度較快，在76 h時(shí)葡萄糖濃度幾乎耗完，丙酮酸最終產(chǎn)量為(76.36±0.26)g/L(圖5-A)。當(dāng)補(bǔ)料質(zhì)量濃度提高至30 g/L時(shí)，在發(fā)酵的中后期，丙酮酸含量繼續(xù)以較高合成速率上升，在進(jìn)行至64 h時(shí)，產(chǎn)量為73.79 g/L，丙酮酸合成速率放緩，在81 h時(shí)產(chǎn)量達(dá)到(80.15±0.35)g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.69 g/g，生產(chǎn)強(qiáng)度0.99 g/(L·h)(圖5-B)。繼續(xù)提高補(bǔ)料濃度至40 g/L，發(fā)酵進(jìn)行至76 h時(shí)丙酮酸的產(chǎn)量基本保持不變，最終產(chǎn)量為(78.42±0.33)g/L，直到87 h，培養(yǎng)基中仍有8.8 g/L的葡萄糖未耗盡(圖5-C)。綜上所述，考慮到丙酮酸終產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益等因素，選擇30 g/L質(zhì)量濃度的葡萄糖進(jìn)行流加補(bǔ)料。

A-15 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵過程；B-菌體比生長速率曲線；C-菌體丙酮酸比生成速率曲線

流加葡萄糖質(zhì)量濃度分別為：A-20 g/L; B-30 g/L; C-40 g/L

2.5.2 初始糖濃度的影響

在以葡萄糖為主要原料的發(fā)酵生產(chǎn)中，初始葡萄糖的質(zhì)量濃度會(huì)對(duì)丙酮酸的生產(chǎn)有很大影響，因此為進(jìn)一步改善丙酮酸的發(fā)酵過程，需要尋找一個(gè)適宜的初始葡萄糖質(zhì)量濃度。為此，選擇40、60、80、100、120、140 g/L的初始糖濃度，以探究其對(duì)C.glabrata4H2的生長以及丙酮酸的積累的影響。由圖6-A可知，較高濃度的初始葡萄糖(120、140 g/L)會(huì)對(duì)菌體的生長產(chǎn)生抑制，較低質(zhì)量濃度的初始葡萄糖在前期可較快達(dá)到較高的細(xì)胞比生長速率。由圖6-B可看出，20 h后初始濃度為40 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖耗盡；初始糖濃度為80 g/L時(shí)，丙酮酸/DCW值最高，為(2.26±0.02)g/g；24 h后初始濃度為60 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖耗盡，此時(shí)初始糖濃度為80 g/L時(shí)菌株丙酮酸/DCW依然最高，達(dá)到(2.65±0.01)g/g，而葡萄糖濃度為140 g/L時(shí)，丙酮酸/DCW明顯降低。表明初始培養(yǎng)基中高濃度的葡萄糖對(duì)前期的菌體發(fā)酵確實(shí)存在抑制作用。綜上所述，選擇初始葡萄糖濃度為80 g/L的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。

A-不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)比生產(chǎn)速率的影響；B-不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)單位菌體丙酮酸生成能力的影響

2.5.3 補(bǔ)料時(shí)機(jī)對(duì)發(fā)酵的影響

為進(jìn)一步強(qiáng)化光滑球擬酵母突變菌株生產(chǎn)丙酮酸，繼續(xù)考察了補(bǔ)料時(shí)機(jī)對(duì)發(fā)酵過程的影響。初始糖質(zhì)量濃度為80 g/L，以發(fā)酵液中的葡萄糖質(zhì)量濃度為參考，分別選取其濃度降低至65、55、45、35以及25 g/L五個(gè)不同濃度時(shí)期進(jìn)行補(bǔ)料，為保持葡萄糖總濃度為150 g/L，補(bǔ)加的葡萄糖質(zhì)量濃度為70 g/L。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，如圖7-A，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至12 h時(shí)，殘?zhí)菫?5 g/L時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，此時(shí)葡萄糖消耗速度相對(duì)較慢，其濃度迅速積累，81 h發(fā)酵結(jié)束時(shí)丙酮酸終產(chǎn)量為(81.37±0.42)g/L, 生產(chǎn)強(qiáng)度為1.01 g/(L·h)。如圖7-C和7-D，當(dāng)發(fā)酵分別進(jìn)行至23與27 h時(shí)，葡萄糖含量分別降低至45與35 g/L，分別在此時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料流加，發(fā)現(xiàn)這2種補(bǔ)料策略在發(fā)酵中后期的耗糖速率均較快，丙酮酸的終產(chǎn)量分別為(79.94±0.72)g/L和(83.62±0.86)g/L。如圖7-E，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行至33 h時(shí)，葡萄糖質(zhì)量濃度降低至約25 g/L進(jìn)行補(bǔ)料，發(fā)現(xiàn)菌株在72 h后葡萄糖消耗速率嚴(yán)重降低，發(fā)酵至91 h時(shí)，發(fā)酵液中仍有約22.3 g/L的葡萄糖未被利用，丙酮酸終產(chǎn)量?jī)H為(72.58±0.33)g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度與底物利用率均較低，表明在發(fā)酵后期高質(zhì)量濃度的葡萄糖對(duì)丙酮酸合成具有一定的抑制作用。如圖7-B，當(dāng)發(fā)酵至17 h時(shí)，葡萄糖含量降低至55 g/L時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料流加，發(fā)現(xiàn)中后期葡萄糖消耗較快，丙酮酸的終產(chǎn)量最高，達(dá)到(86.63±0.29)g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.78 g/g，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.07 g/(L·h)。

剩余葡萄糖質(zhì)量濃度分別為: A-65 g/L; B-55 g/L; C-45 g/L; D-35 g/L; E-25 g/L

3 討論

丙酮酸作為一種重要的工業(yè)原料，廣泛應(yīng)用于制藥、日化、食品以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[21]。目前主要通過基因工程手段激活或改善細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、糖酵解或TCA循環(huán)中某些靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯水平以強(qiáng)化丙酮酸的生產(chǎn)[16]，有關(guān)發(fā)酵過程優(yōu)化與控制的報(bào)道相對(duì)較少。本文從7株菌種鑒定出最佳菌株C.glabrate4H2，并對(duì)其生產(chǎn)丙酮酸的發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳種子培養(yǎng)基相關(guān)成分以及質(zhì)量濃度。在此條件下，搖瓶水平發(fā)酵52 h丙酮酸最高產(chǎn)量為(48.56±0.46)g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.93 g/(L·h)，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.46 g/g，較未優(yōu)化前分別提高了25.0%、52.5%和43.8%。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行15 L發(fā)酵罐的放大發(fā)酵，丙酮酸產(chǎn)量達(dá)(67.8±0.27)g/L，并對(duì)過程中的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了分析。進(jìn)一步對(duì)15 L罐中流加發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的工藝進(jìn)行探究，確定了總葡萄糖質(zhì)量濃度為150 g/L，初始葡萄糖為80 g/L，并在剩余葡萄糖濃度為55 g/L時(shí)進(jìn)行恒速補(bǔ)料的策略，最終丙酮酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到(86.63±0.29)g/L、0.78 g/g和1.07 g/(L·h)。已有的研究表明，光滑球擬酵母代謝副產(chǎn)物多糖的積累是影響丙酮酸轉(zhuǎn)化率提升的主要原因之一[22-23]。近年來，關(guān)于光滑球擬酵母的基因編輯方法日趨成熟[24-25]。在后續(xù)研究中，通過建立光滑球擬酵母高效基因編輯系統(tǒng)并弱化潛在副產(chǎn)物合成相關(guān)基因表達(dá)，以及對(duì)胞內(nèi)中心化合物進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，有望進(jìn)一步提升丙酮酸積累水平。本研究相關(guān)優(yōu)化與補(bǔ)料策略為利用光滑球擬酵母發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的放大實(shí)驗(yàn)提供了理論與技術(shù)參考。